DD300328A7 - Verfahren zur bestimmung von harnsaeure in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Bestimmungsverfahren fuer Harnsaeure in Koerperfluessigkeiten, vor allem in Blutproben und im Urin, in einem bed-side-Test. Es wird die antiradikale Aktivitaet der zu untersuchenden Proben vor und nach Zugabe von Uricase mit Hilfe der Photochemolumineszenzmethode bestimmt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Harnsaeure; Bestimmung; Koerperfluessigkeiten; Blut; Urin; bed-side-Test; antiradikale Aktivitaet; Uricase; Chemolumineszenz; Photochemolumineszenz; Medizin; Diagnostik}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten mittels einer neuen Photochemolumineszenzmethode. Das Verfahren liefert Harnsäurewerte z. B. des Blutserums innerhalb von lOMinuten und eignet sich sowohl zur routinemäßigen Harnsäurebestimmung als auch als „bed-side" Test. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Harnsäure stellt das Endprodukt des Purinstoffwechsels des Menschen dar. Ihre Bestimmung im Serum bzw. Blutplasma ist klinisch bedeutungsvoll bei Gicht und ihren Folgeerkrankungen sowie bei kardiovaskulären Erkrankungen. Sie wird mittels spektralphotometrischer, elektroanalytischer, chromatograhischer und chemoluminometrischer Methoden durchgeführt.

Unabhängig vom konkreten Meßverfahren können die Bestimmungsmethoden in direkte und indirekte unterteilt werden. Die direkten Methoden bestimmen die Konzentration der Harnsäure selbst aufgrund ihrer chemischen (reduzierenden) bzw. physikalischen (Lichtabsorption) Eigenschaften, während die indirekten auf der Messung des im Ergebnis folgender Reaktion entstehenden Wasserstoffperoxids basieren:

Harnsäure + Uricase-> Allantoin + Kohlendioxid +Wasserstoffperoxid

(Harnsäure-Test FERMOGNOST* des VEB Laborchemie Apolda innerhalb des VEB Pharmazeutisches Kombinat GERMED Dresden; Pachla, L. A., D. L. Reynolds, D. S. Wright und P.T. Kissinger, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70 [1987] 1-14; Gorus, F. und E.Schräm, Arch. Internat. Physiol. 85 [1977] 981-982).

In unterschiedlicher Ausprägung weisen alle Methoden folgende Mängel auf:

- interferierender Einfluß verschiedener Substanzen mit ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften (wie z.B. Ascorbinsäure, Cystein, Tryptophan, Glutathion u.a. reduktiv wirkender Substanzen bzw. Substanzen, die im selben Spektralbereich eine Absorption aufweisen);

- relative Unempfindlichkeit (minimal notwendige Plasmamenge bei den meisten Methoden 100μΙ) bzw. zu hohe Empfindlichkeit (Notwendigkeit der Vorverdünnung);

- unzureichende Reproduzierbarkeit;

- Notwendigkeit einer Vorbehandlung des Materials, z.B. Deproteinisierung zwecks Verminderung der Lichtstreuung und Entfernung unerwünschter enzymatischer Komponenten (Katalase, Peroxidase) sowie des Hämoglobins und anderer Proteine;

- hoher Zeitaufwand.

Mit Hilfe der Photochemolumineszenz ist der Harnsäuregehalt bislang nicht gemessen worden. Aus der DD-PS 249618 ist bekannt, daß sich die antiradikale Aktivität von einigen Stoffen photochemoluminometrisch quantifizieren läßt. Dazu wird das Phänomen des die Reaktion zwischen fotochemisch erzeugten Superoxidradikalen und Luminol begleitenden Leuchtens (Chemolumineszenz) genutzt. Die Dauer der durch Radikalfänger bedingten Chemolumineszenzhemmung ist ein Maß seiner Menge. Das dazu verwendete Photochemoluminometer besteht nach DD-PS 249618 aus reiner Lichtquelle, Bestrahlungsküvette, Chemoluminometer mit einer Durchflußküvette (modifiziert nach DD-PS 213997) und der Mikroschlauchpumpe für die Überführung der bestrahlten Lösung in die Meßküvette. Die Latenzdauer (Lagphase) der Photochemolumineszenz ist proportional der Menge der in die Lösung gegebenen antiradikalisch wirkenden nichtenzymatischen Substanzen wie a-Tocopherol und ß-Kartin. Die Photochemolumineszenzmethode zeichnet sich vorteilhaft bezüglich ihrer Einfachheit, Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Billigkeit aus.

Aufgrund der bekannten Eigenschaften der Harnsäure mit Radikalen zu reagieren (Meadows, J., C. Robert Smith und J. Reeves, Biochem. Biophys. Res. Commun. 137 [1986] 536-541), ist zu erwarten, daß sie als reine Substanz sich auch aktiv im photochemoluminometrischen System zeigt. Für die direkte Bestimmung der Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten als Gemischen von unterschiedlichen antiradikal wirkenden Substanzen wäre das Verfahren ungeeignet; denn die vorherige Reinigung des Materials ist mit hohem technischem und materiellem Aufwand verbunden.

-2-Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, auf der Basis der photochemoluminometrischen Meßmethode ein einfaches Verfahren zur quantitativen Harnsäurebestimmung in biologischen Flüssigkeiten zu entwickeln, dessen Spezifität, Empfindlichkeit, Kosten- und Zeitaufwand seine Anwendung sowohl in der Routineanalyse als auch für einzelne Messungen in Einrichtungen des Gesundheitswesens, die sich mit der Gesundheitsüberwachung und der Kontrolle von Risikofaktoren befassen, erlaubt. Weiterhin soll die Anwendung des Verfahrens so einfach sein, daß es auch von Nichtfachleuten und nicht nur in klinischen Laboratorien, sondern auch von praktischen Ärzten und Hilfspersonal verwendet werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Bestimmung der Harnsäure zu entwickeln. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß die antiradikalen Eigenschaften des Untersuchungsmaterials vor und nach Zugabe von Uricase (Uratoxidase) mit Hilfe der Photochemolumineszenzmethode bestimmt werden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß unabhängig von der Menge der Harnsäure in der Probe (d. h. auch von der Menge des sich bei der Reaktion mit Uricase bildenden oxidativ wirkenden Wasserstoffperoxides) sich die uratunabhängige Komponente der antiradikalen Kapazität des Untersuchungsmaterials nach der Reaktion mit Uricase nicht verändert und außerdem sowohl das gebildete Wasserstoffperoxid als auch das Produkt der im Meßsystem potentiell möglichen Reaktion

H₂O₂ + O₂" -» OH" + O₂ + OH

das Hydroxylradikal OH offensichtlich unter den gegebenen Bedingungen keinen Einfluß auf die Indikatorreaktion mit Beteiligung von Luminol haben.

Somit kann aus der Differenz der antiradikalen Kapazität vor und nach Uricaseeinwirkung direkt auf die Harnsäurekonzentration gefolgert werden.

Das erfindunsgemäße Verfahren stellt einen bed-side-Test dar, der gegenüber den herkömmlichen Methoden eine Reihe von Vorteilen aufweist:

- Beseitigung jeglicher Vorbehandlung des Materials,

- Verringerung der für eine Bestimmung notwendigen Plasma- bzw. Serummenge auf wenige (1-2) μΙ, wodurch die Gewinnung des Materials erleichtert wird (Kapillarblut aus dem Finger bzw. Ohrläppchen, keine Venenpunktion ist notwendig) und somit die Patientenbelastung vermindert ist,

- Verkürzung der Gesamtdauer des Bestimmungsvorganges auf 5 bis 10 Minuten unter Beibehaltung der Spezifität,

- Einfachheit des Meßvorganges (Als bed-side-Test ist die Bedienung der Apparatur durch Nichtfachleute möglich.),

- geringer materieller Aufwand für den Bau der Meßapparatur.

Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode für Harnsäure eignet sich für alle Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Serum, Urin, Fruchtwasser, Liquor usw. sowie für Gewebehomogenate.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Blut wird aus dem Finger in eine Glaskapillare (Hämatokritkapillare) abgenommen und für die Abtrennung der Zellkomponenten 3 Minuten bei 2000U/min zentrifugiert. In 2μΙ Plasma wird in einem Photochemoluminometer die antiradikale Aktivität bestimmt. Gleichzeitig wird eine zweite Plasmaprobe zu 2μΙ in einem Wassertropfen mit Uricase bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach mindestens fünfminütiger Inkubationszeit wird ebenfalls die antiradikale Aktivität bestimmt. Mittels einer Eichkurve wird die Differenz der antiradikalen Aktivität vor und nach Uricaseeinwirkung in einer Harnsäurekonzentration ausgedrückt.

Beispiel 2

Ein Leberstück wird im Verhältnis 1:2 mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert. Das Homogenat wird 10 Minuten bei 3000U/Min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Mit 0,2μΙ des Überstandes wird entsprechend wie im Beispiel 1 beschrieben verfahren und somit die Harnsäurekonzentration bestimmt.

Beispiel 3

wie Beispiel 1, nur daß anstelle einer Plasmaprobe Urin (nach Verdünnung 1:40 mit Aquabidest) verwendet wird.

Beispiel 4

wie Beispiel 1, nur daß anstelle einer Plasmaprobe Gelenkflüssigkeit verwendet wird.

Beispiel5

wie Beispiel 1, nur daß anstelle von Blutplasma 1 μΙ Fruchtwasser verwendet wird.

Claims (4)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten aufgrund ihrer reduktiven Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß diese Eigenschaft in einem photochemischen radikalgenerierenden System als antiradikale Aktivität erfaßt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antiradikale Aktivität mit Hilfe der Chemolumineszenzmessung als Hemmungsdauer der Photochemolumineszenz quantifiziert wird.
3. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die antiradikale Aktivität der zu untersuchenden Probe vor und nach der selektiv die Harnsäure eliminierenden Behandlung durch das Enzym Uratoxidase mit Hilfe eines Photochemoluminometers gemessen und anschließend anhand einer Bezugskurve die Harnsäurekonzentration ermittelt wird.
4. 4. Verfahren nach Ansprüchen 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Flüssigkeiten u.a. Blut, Urin, Galle, Gewebehomogenate, Liquor, Fruchtwasser darstellen.