DD300328A7

DD300328A7 - METHOD FOR DETERMINING HARVESTIC ACID IN KOERPERFLUESSIGKEITEN

Info

Publication number: DD300328A7
Application number: DD32215488A
Authority: DD
Inventors: Gudrun Lewin; Igor Popov
Original assignee: Lewin,Gudrun,De; Popov,Igor,Su
Priority date: 1988-11-24
Filing date: 1988-11-24
Publication date: 1992-06-04

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Bestimmungsverfahren fuer Harnsaeure in Koerperfluessigkeiten, vor allem in Blutproben und im Urin, in einem bed-side-Test. Es wird die antiradikale Aktivitaet der zu untersuchenden Proben vor und nach Zugabe von Uricase mit Hilfe der Photochemolumineszenzmethode bestimmt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Harnsaeure; Bestimmung; Koerperfluessigkeiten; Blut; Urin; bed-side-Test; antiradikale Aktivitaet; Uricase; Chemolumineszenz; Photochemolumineszenz; Medizin; Diagnostik}The invention relates to a new assay for uric acid in body fluids, especially in blood samples and in urine, in a bedside test. The antiradical activity of the samples to be examined before and after the addition of uricase is determined by means of the photoluminescence method. The field of application of the invention is the medical diagnosis {uric acid; Determination; body fluids; Blood; Urine; bed-side test; anti-radical activity; uricase; chemiluminescence; photochemoluminescence; Medicine; diagnosis}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten mittels einer neuen Photochemolumineszenzmethode. Das Verfahren liefert Harnsäurewerte z. B. des Blutserums innerhalb von lOMinuten und eignet sich sowohl zur routinemäßigen Harnsäurebestimmung als auch als „bed-side" Test. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to a method for the determination of uric acid in body fluids by means of a novel photoluminescence method. The method provides uric acid values z. It is suitable for both routine uric acid determination and bed-side testing. The field of application of the invention is medical diagnostics.

Characteristic of the known state of the art

Die Harnsäure stellt das Endprodukt des Purinstoffwechsels des Menschen dar. Ihre Bestimmung im Serum bzw. Blutplasma ist klinisch bedeutungsvoll bei Gicht und ihren Folgeerkrankungen sowie bei kardiovaskulären Erkrankungen. Sie wird mittels spektralphotometrischer, elektroanalytischer, chromatograhischer und chemoluminometrischer Methoden durchgeführt.Uric acid is the end product of human purine metabolism. Its determination in serum or blood plasma is clinically significant in gout and its sequelae as well as in cardiovascular diseases. It is carried out by means of spectrophotometric, electroanalytical, chromatographic and chemoluminometric methods.

Unabhängig vom konkreten Meßverfahren können die Bestimmungsmethoden in direkte und indirekte unterteilt werden. Die direkten Methoden bestimmen die Konzentration der Harnsäure selbst aufgrund ihrer chemischen (reduzierenden) bzw. physikalischen (Lichtabsorption) Eigenschaften, während die indirekten auf der Messung des im Ergebnis folgender Reaktion entstehenden Wasserstoffperoxids basieren:Regardless of the specific measurement method, the determination methods can be subdivided into direct and indirect ones. The direct methods determine the concentration of uric acid itself due to its chemical (reducing) or physical (light absorption) properties, while the indirect methods are based on the measurement of the hydrogen peroxide resulting from the reaction:

Harnsäure + Uricase-> Allantoin + Kohlendioxid +WasserstoffperoxidUric acid + uricase-> allantoin + carbon dioxide + hydrogen peroxide

(Harnsäure-Test FERMOGNOST* des VEB Laborchemie Apolda innerhalb des VEB Pharmazeutisches Kombinat GERMED Dresden; Pachla, L. A., D. L. Reynolds, D. S. Wright und P.T. Kissinger, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70 [1987] 1-14; Gorus, F. und E.Schräm, Arch. Internat. Physiol. 85 [1977] 981-982).(Uric acid test FERMOGNOST * of VEB Laborchemie Apolda within the VEB Pharmaceutical Combine GERMED Dresden, Pachla, LA, DL Reynolds, DS Wright and PT Kissinger, J. Assoc., Off., Chem., 70 [1987] 1-14; Gorus , F. and E. Scharm, Arch. Internat. Physiol. 85 [1977] 981-982).

In unterschiedlicher Ausprägung weisen alle Methoden folgende Mängel auf:To varying degrees, all methods have the following shortcomings:

- interferierender Einfluß verschiedener Substanzen mit ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften (wie z.B. Ascorbinsäure, Cystein, Tryptophan, Glutathion u.a. reduktiv wirkender Substanzen bzw. Substanzen, die im selben Spektralbereich eine Absorption aufweisen);- interfering influence of various substances with similar chemical and physical properties (such as ascorbic acid, cysteine, tryptophan, glutathione and other reductive substances or substances having an absorption in the same spectral range);

- relative Unempfindlichkeit (minimal notwendige Plasmamenge bei den meisten Methoden 100μΙ) bzw. zu hohe Empfindlichkeit (Notwendigkeit der Vorverdünnung);- Relativ insensitivity (minimum necessary amount of plasma in most methods 100μΙ) or too high sensitivity (need for predilution);

- unzureichende Reproduzierbarkeit;- insufficient reproducibility;

- Notwendigkeit einer Vorbehandlung des Materials, z.B. Deproteinisierung zwecks Verminderung der Lichtstreuung und Entfernung unerwünschter enzymatischer Komponenten (Katalase, Peroxidase) sowie des Hämoglobins und anderer Proteine;- need for pretreatment of the material, e.g. Deproteinization for the purpose of reducing light scattering and removal of undesired enzymatic components (catalase, peroxidase) as well as hemoglobin and other proteins;

- hoher Zeitaufwand.- a lot of time.

Mit Hilfe der Photochemolumineszenz ist der Harnsäuregehalt bislang nicht gemessen worden. Aus der DD-PS 249618 ist bekannt, daß sich die antiradikale Aktivität von einigen Stoffen photochemoluminometrisch quantifizieren läßt. Dazu wird das Phänomen des die Reaktion zwischen fotochemisch erzeugten Superoxidradikalen und Luminol begleitenden Leuchtens (Chemolumineszenz) genutzt. Die Dauer der durch Radikalfänger bedingten Chemolumineszenzhemmung ist ein Maß seiner Menge. Das dazu verwendete Photochemoluminometer besteht nach DD-PS 249618 aus reiner Lichtquelle, Bestrahlungsküvette, Chemoluminometer mit einer Durchflußküvette (modifiziert nach DD-PS 213997) und der Mikroschlauchpumpe für die Überführung der bestrahlten Lösung in die Meßküvette. Die Latenzdauer (Lagphase) der Photochemolumineszenz ist proportional der Menge der in die Lösung gegebenen antiradikalisch wirkenden nichtenzymatischen Substanzen wie a-Tocopherol und ß-Kartin. Die Photochemolumineszenzmethode zeichnet sich vorteilhaft bezüglich ihrer Einfachheit, Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Billigkeit aus.With the help of photochemoluminescence, the uric acid content has not been measured. From DD-PS 249618 it is known that the antiradical activity of some substances can be quantified photochemoluminometrically. For this purpose, the phenomenon of the light accompanying the reaction between photochemically generated superoxide radicals and luminol (chemiluminescence) is used. The duration of the chemiluminescence inhibition caused by radical scavengers is a measure of its amount. The photochemoluminometer used to DD-PS 249618 consists of pure light source, irradiation cuvette, chemiluminometer with a flow cell (modified to DD-PS 213997) and the micro tube pump for the transfer of the irradiated solution in the measuring cuvette. The latency period (lag phase) of photochemiluminescence is proportional to the amount of antiradical nonenzymatic substances such as α-tocopherol and β-kardin added to the solution. The photoluminescence method is advantageous in terms of its simplicity, reliability, accuracy and cheapness.

Aufgrund der bekannten Eigenschaften der Harnsäure mit Radikalen zu reagieren (Meadows, J., C. Robert Smith und J. Reeves, Biochem. Biophys. Res. Commun. 137 [1986] 536-541), ist zu erwarten, daß sie als reine Substanz sich auch aktiv im photochemoluminometrischen System zeigt. Für die direkte Bestimmung der Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten als Gemischen von unterschiedlichen antiradikal wirkenden Substanzen wäre das Verfahren ungeeignet; denn die vorherige Reinigung des Materials ist mit hohem technischem und materiellem Aufwand verbunden.Due to the known properties of the uric acid to react with radicals (Meadows, J., C. Robert Smith and J. Reeves, Biochem Biophys Res. Commun., 137 [1986] 536-541), it can be expected that they are as pure Substance also shows active in the photochemoluminometric system. For the direct determination of uric acid in biological fluids as mixtures of different antiradical substances, the method would be inappropriate; because the previous cleaning of the material is associated with high technical and material costs.

-2-Ziel der Erfindung-2-goal of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, auf der Basis der photochemoluminometrischen Meßmethode ein einfaches Verfahren zur quantitativen Harnsäurebestimmung in biologischen Flüssigkeiten zu entwickeln, dessen Spezifität, Empfindlichkeit, Kosten- und Zeitaufwand seine Anwendung sowohl in der Routineanalyse als auch für einzelne Messungen in Einrichtungen des Gesundheitswesens, die sich mit der Gesundheitsüberwachung und der Kontrolle von Risikofaktoren befassen, erlaubt. Weiterhin soll die Anwendung des Verfahrens so einfach sein, daß es auch von Nichtfachleuten und nicht nur in klinischen Laboratorien, sondern auch von praktischen Ärzten und Hilfspersonal verwendet werden kann.The object of the invention is to develop on the basis of the photochemoluminometric measurement method a simple method for quantitative determination of uric acid in biological fluids whose specificity, sensitivity, cost and time its application both in the routine analysis as well as for individual measurements in health care institutions, which deal with health monitoring and control of risk factors. Furthermore, the use of the method should be so simple that it can be used by non-professionals and not only in clinical laboratories, but also by general practitioners and support staff.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Bestimmung der Harnsäure zu entwickeln. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß die antiradikalen Eigenschaften des Untersuchungsmaterials vor und nach Zugabe von Uricase (Uratoxidase) mit Hilfe der Photochemolumineszenzmethode bestimmt werden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß unabhängig von der Menge der Harnsäure in der Probe (d. h. auch von der Menge des sich bei der Reaktion mit Uricase bildenden oxidativ wirkenden Wasserstoffperoxides) sich die uratunabhängige Komponente der antiradikalen Kapazität des Untersuchungsmaterials nach der Reaktion mit Uricase nicht verändert und außerdem sowohl das gebildete Wasserstoffperoxid als auch das Produkt der im Meßsystem potentiell möglichen ReaktionThe invention has for its object to develop a new method for the determination of uric acid. The object has been achieved by determining the antiradical properties of the test material before and after the addition of uricase (urate oxidase) by means of the photoluminescence method. Surprisingly, it has been shown that irrespective of the amount of uric acid in the sample (ie also the amount of oxidative hydrogen peroxide which forms in the reaction with uricase), the urate-independent component of the antiradical capacity of the test material does not change after the reaction with uricase and In addition, both the hydrogen peroxide formed and the product of the potentially possible reaction in the measuring system

H₂O₂ + O₂" -» OH" + O₂ + OHH ₂ O ₂ + O ₂ "-" OH "+ O ₂ + OH

das Hydroxylradikal OH offensichtlich unter den gegebenen Bedingungen keinen Einfluß auf die Indikatorreaktion mit Beteiligung von Luminol haben.the hydroxyl radical OH apparently under the given conditions has no influence on the indicator reaction involving luminol.

Somit kann aus der Differenz der antiradikalen Kapazität vor und nach Uricaseeinwirkung direkt auf die Harnsäurekonzentration gefolgert werden.Thus, from the difference in antiradical capacity before and after uricase exposure, one can directly deduce the uric acid concentration.

Das erfindunsgemäße Verfahren stellt einen bed-side-Test dar, der gegenüber den herkömmlichen Methoden eine Reihe von Vorteilen aufweist:The process according to the invention represents a bedside test which has a number of advantages over conventional methods:

- Beseitigung jeglicher Vorbehandlung des Materials,- removal of any pretreatment of the material,

- Verringerung der für eine Bestimmung notwendigen Plasma- bzw. Serummenge auf wenige (1-2) μΙ, wodurch die Gewinnung des Materials erleichtert wird (Kapillarblut aus dem Finger bzw. Ohrläppchen, keine Venenpunktion ist notwendig) und somit die Patientenbelastung vermindert ist,Reducing the amount of plasma or serum necessary for a determination to a few (1-2) μΙ, thereby facilitating the recovery of the material (capillary blood from the finger or earlobe, no venipuncture is necessary) and thus the patient load is reduced,

- Verkürzung der Gesamtdauer des Bestimmungsvorganges auf 5 bis 10 Minuten unter Beibehaltung der Spezifität,Shortening the total duration of the determination process to 5 to 10 minutes while maintaining the specificity,

- Einfachheit des Meßvorganges (Als bed-side-Test ist die Bedienung der Apparatur durch Nichtfachleute möglich.),- Simplicity of the measuring process (As a bedside test, the operation of the apparatus by non-experts is possible.),

- geringer materieller Aufwand für den Bau der Meßapparatur.- Low material costs for the construction of the measuring apparatus.

Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode für Harnsäure eignet sich für alle Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Serum, Urin, Fruchtwasser, Liquor usw. sowie für Gewebehomogenate.The determination method for uric acid according to the invention is suitable for all body fluids such as blood plasma, serum, urine, amniotic fluid, cerebrospinal fluid, etc. as well as tissue homogenates.

embodiments example 1

Blut wird aus dem Finger in eine Glaskapillare (Hämatokritkapillare) abgenommen und für die Abtrennung der Zellkomponenten 3 Minuten bei 2000U/min zentrifugiert. In 2μΙ Plasma wird in einem Photochemoluminometer die antiradikale Aktivität bestimmt. Gleichzeitig wird eine zweite Plasmaprobe zu 2μΙ in einem Wassertropfen mit Uricase bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach mindestens fünfminütiger Inkubationszeit wird ebenfalls die antiradikale Aktivität bestimmt. Mittels einer Eichkurve wird die Differenz der antiradikalen Aktivität vor und nach Uricaseeinwirkung in einer Harnsäurekonzentration ausgedrückt.Blood is removed from the finger into a glass capillary (hematocrit capillary) and centrifuged for 3 minutes at 2000 rpm to separate the cell components. In 2μΙ plasma antiradical activity is determined in a photochemoluminometer. At the same time a second plasma sample is incubated to 2μΙ in a water drop with uricase at room temperature. After at least five minutes of incubation, the antiradical activity is also determined. A calibration curve is used to express the difference in antiradical activity before and after uricase exposure in a uric acid concentration.

Example 2

Ein Leberstück wird im Verhältnis 1:2 mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert. Das Homogenat wird 10 Minuten bei 3000U/Min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Mit 0,2μΙ des Überstandes wird entsprechend wie im Beispiel 1 beschrieben verfahren und somit die Harnsäurekonzentration bestimmt.A piece of liver is homogenized in the ratio 1: 2 with physiological saline. The homogenate is centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm and the supernatant is pipetted off. With 0.2μΙ of the supernatant is carried out according to the procedure described in Example 1 and thus determines the uric acid concentration.

Example 3

wie Beispiel 1, nur daß anstelle einer Plasmaprobe Urin (nach Verdünnung 1:40 mit Aquabidest) verwendet wird.as Example 1, except that instead of a plasma sample urine (after dilution 1:40 with Aquabidest) is used.

Example 4

wie Beispiel 1, nur daß anstelle einer Plasmaprobe Gelenkflüssigkeit verwendet wird.as Example 1, except that instead of a plasma sample joint fluid is used.

Example 5

wie Beispiel 1, nur daß anstelle von Blutplasma 1 μΙ Fruchtwasser verwendet wird.as Example 1, except that instead of blood plasma 1 μΙ amniotic fluid is used.

Claims

claims:

1. A method for the determination of uric acid in body fluids due to their reductive properties, characterized in that this property is detected in a photochemical radical generating system as antiradical activity.

2. The method according to claim 1, characterized in that the antiradical activity is quantified by means of chemiluminescence measurement as the inhibition period of photochemiluminescence.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that the antiradical activity of the sample to be examined is measured before and after the selectively eliminating the uric acid treatment by the enzyme urate with the aid of a photochemoluminometer and then based on a reference curve, the uric acid concentration is determined.

4. The method according to claims 1,2 and 3, characterized in that the liquids to be examined u.a. Blood, urine, bile, tissue homogenates, cerebrospinal fluid, amniotic fluid.