CN106645665B

CN106645665B - 一种凝血酶时间检测试剂

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Publication number: CN106645665B
Application number: CN201611226676.8A
Authority: CN
Inventors: 丁重辉; 闫君
Original assignee: Beijing Sicceeder Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Sicceeder Technology Co Ltd
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: CN106645665A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种凝血酶时间检测试剂。该凝血酶时间检测试剂包括凝血酶、HEPES、NaN₃、蛋白胨和氯化钙。本发明通过研究反应机理，在缓冲液中添加了Ca²⁺来模拟体内凝血环境，从而能够使试剂具有较好的临床应用价值；本发明试剂中缓冲液组分使凝血酶试剂复溶后37℃条件下能够稳定七天，与市售试剂相比重复性与稳定性较好。因此，对于各级医院来说，使用可靠、方便、减少浪费并降低医疗成本。

Description

一种凝血酶时间检测试剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种凝血酶时间检测试剂。

背景技术

凝血是由一系列凝血因子参与的复杂的生理过程，凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者的动态平衡是正常机体维持体内血液流动和防止血液流失的关键，凝血是血液由溶胶状态转变为凝胶状态的过程。当机体内抗凝物质缺乏或纤维蛋白溶解异常时会导致血栓的形成，而当今社会，随着人口老龄化进程的加速，各类血栓性疾病日益成为影响人类生活质量的因素，尤其是心、脑血管血栓性疾病，所以需要一种可以为临床血栓与止血类疾病的诊断治疗提供可靠诊断结果体外诊断试剂。

凝血酶时间(TT)是一种快速检测凝血共同通路上纤维蛋白原变成纤维蛋白的方法，是检测凝血、抗凝及纤维蛋白原溶解系统功能的一个简便试验。凝血酶时间(TT)延长见于血浆纤维蛋白原减低或结构异常；临床应用肝素，或在肝病、肾病及系统性红斑狼疮时的肝素样抗凝物质增多；纤溶蛋白溶解系统功能亢进。凝血酶时间缩短见于血液中有钙离子存在，或血液呈酸性等。凝血酶时间(TT)测定的是加入标准化凝血酶后纤维蛋白的形成时间，它的延长说明机体纤溶亢进，所以在低(无)纤维蛋白原症，DIC以及类肝素物质存在(如肝素治疗，SLE和肝脏疾病等)时出现延长。因此，凝血酶时间(TT)测定对检测血栓性疾病的防治有重要意义，是血栓与止血检测中的重要项目。

根据NCCLS H21-A3《用于血液凝固检测的样品采集的指导方法》。抗凝剂选用105-109mmol/L，3.13％-3.2％(通常描述为3.2％)枸橼酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，抗凝剂与抽血量比例为1:9。枸橼酸根离子可与血中的钙离子相结合，形成不易离解的可溶性络合物，使血中钙离子浓度降低，而产生抗凝作用。因此在正常的凝血机制中，必须有钙离子的参与。而标本采集过程中，为了血液抗凝，抗凝剂中的枸橼酸根离子抑制了全血钙离子，因此必须在试剂中加入钙离子，以还原或补充被抑制的钙离子。

目前，市售含钙离子的凝血酶时间检测试剂存在稳定性和重复性较差的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种凝血酶时间检测试剂。该凝血酶时间检测试剂具有较好的稳定性和重复性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种凝血酶时间检测试剂，包括凝血酶、HEPES、NaN₃、蛋白胨和氯化钙。

作为优选，各组分按如下配比配制：

在本发明提供的一优选实施例中，各组分按如下配比配制：

在本发明提供的另一实施例中，各组分按如下配比配制：

作为优选，凝血酶时间检测试剂还包括水。

作为优选，凝血酶时间检测试剂中各组分用量为：

作为优选，凝血酶为牛凝血酶。

本发明还提供了一种非诊断目的检测凝血酶时间的方法，采用本发明的凝血酶时间检测试剂检测待测血浆的凝血时间。

作为优选，该方法为：将待测血浆在37℃条件下预温3min，加入凝血酶时间检测试剂在37℃条件下进行凝血反应，记录凝血时间。

作为优选，凝血酶时间检测试剂与待测血浆的体积比为(1～2)：(1～2)。

在本发明提供的实施例中，凝血酶时间检测试剂与待测血浆的体积比为1：1。

本发明提供了一种凝血酶时间检测试剂。该凝血酶时间检测试剂包括凝血酶、HEPES、NaN₃、蛋白胨和氯化钙。本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明通过研究反应机理，在缓冲液中添加了Ca²⁺来模拟体内凝血环境，从而能够使试剂具有较好的临床应用价值；

2、本发明试剂中缓冲液组分使凝血酶试剂复溶后37℃条件下能够稳定七天，与市售试剂相比重复性与稳定性较好。因此，对于各级医院来说，使用可靠、方便、减少浪费并降低医疗成本；

3、本发明试剂对肝素和纤维蛋白原含量敏感，因此本发明试剂能够为临床血栓与止血类疾病的诊断治疗以及临床中肝素治疗及溶纤治疗监测提供可靠的诊断结果。

附图说明

图1示利用蛋白电泳分析人、牛、猪凝血酶之间蛋白成分差异。

具体实施方式

本发明公开了一种凝血酶时间检测试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的凝血酶时间检测试剂中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例的凝血时间检测试剂包括牛凝血酶4IU/mL、氯化钙0.55％、HEPES 1％、NaN₃ 1‰、蛋白胨2％；其余为纯水。

如果需要长期保存，需制成冻干品，用时再按此浓度复溶。

实施例2

本实施例的凝血时间检测试剂包括牛凝血酶3IU/mL、氯化钙0.25％、HEPES0.5％、NaN₃ 0.5‰、蛋白胨1％；其余为纯水。

实施例3

本实施例的凝血时间检测试剂包括牛凝血酶6IU/mL、氯化钙0.75％、HEPES 2％、NaN₃ 2‰、蛋白胨3％；其余为纯水。

试验例1：本发明试剂盒的应用

1.检测原理

适量的凝血酶溶液作用于待测血浆，能够将血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白而凝固，凝固所需的时间即为待测血浆凝血酶时间(TT)。

2.检测步骤

实施例1-3中任一凝血酶冻干品用一定体积的纯水复溶。以赛科希德SF-400凝血测试仪为例，操作步骤如表1：

表1本发明试剂盒操作步骤

其它凝血测试仪检测时，按照相应的仪器说明书提供的参数操作。

试验例2：凝血酶种类的选择

利用蛋白电泳分析人、牛、猪凝血酶之间蛋白成分差异，分别配制人、牛、猪凝血酶1IU/μL，取8μL样本电泳，120V恒压1h，取蛋白胶染色并脱色。

图1表明，人、猪凝血酶的蛋白成分比较复杂，且杂蛋白的含量较大，而牛凝血酶的蛋白成分比较单一，主要为凝血酶和白蛋白，使用牛凝血酶能够有效降低凝血酶本身对试剂的影响，所以本发明采用了牛凝血酶。

试验例3：最适缓冲液配比

A缓冲液：HEPES 0.5％，NaN₃ 0.5‰，氯化钙0.25％，蛋白胨1％，其余为纯水。

B缓冲液：HEPES 1％，NaN₃ 1‰，氯化钙0.55％，蛋白胨2％，其余为纯水。

C缓冲液：HEPES 2％，NaN₃ 2‰，氯化钙0.75％，蛋白胨3％，其余为纯水。

上述缓冲液中牛凝血酶均为4IU/mL。凝血酶冻干品用纯水复溶，按上述操作步骤在赛科希德凝血检测仪SF-400上检测A、B、C三种试剂的凝血酶时间(结果见表2)。

表2三种不同配比缓冲液检测结果比较(SF-400)

表2结果显示A、C缓冲液配制的试剂检测结果分别在第6天和第5天出现延长，而B缓冲液配制的TT试剂稳定性可以保持7天，所以B缓冲液为最适缓冲液。

试验例4：Ca²⁺对凝血酶时间的影响

分别配制含有Ca²⁺和不含Ca²⁺的TT试剂，分别为：

含Ca²⁺缓冲液(0.25％)：牛凝血酶4 IU/mL，HEPES 1％，NaN₃ 1‰，氯化钙0.25％，蛋白胨2％，其余为纯水。

含Ca²⁺缓冲液(0.55％)：牛凝血酶4 IU/mL，HEPES 1％，NaN₃ 1‰，氯化钙0.55％，蛋白胨2％，其余为纯水。

含Ca²⁺缓冲液(0.75％)：牛凝血酶4 IU/mL，HEPES 1％，NaN₃ 1‰，氯化钙0.75％，蛋白胨2％，其余为纯水。

无Ca²⁺缓冲液：牛凝血酶4IU/mL，HEPES 1％，NaN₃ 1‰，蛋白胨2％，其余为纯水。

在SF-400上检测正常凝血质控的凝血酶时间(结果见表3)。

表3是否含Ca²⁺缓冲液检测结果比较(SF-400)

Ca²⁺是凝血过程中重要的Ⅳ因子，当缺乏时就会导致凝血酶作用于纤维蛋白原形成的纤维蛋白不牢固，延长凝血所需时间，表3结果表明，当试剂中加入0.55％Ca²⁺后能够缩短凝血时间，模拟体内凝血过程。

试验例5：凝血酶试剂复溶后与市售含钙的TT试剂稳定性比较

凝血酶冻干品用一定体积的纯水复溶，然后将复溶后试剂置于37℃保存。在SF-400血凝仪上测定同一正常质控血浆(TT值：14～21s)，市售fisher试剂同步进行测定。(结果见表4)

表4表明，本发明的TT试剂在复溶后的七天内测定结果比较稳定，而市售试剂在第5天时开始明显变化，这一结果对临床检验科来说非常重要，因为它可以减少浪费，从而降低成本。

表4与市售TT试剂稳定性比较

试验例6：与市售fisher TT试剂重复性比较

凝血酶冻干品用一定体积的纯水复溶，按实施例一所述方法操作，重复测定10次。同一正常质控血浆(TT值：14～21s)凝血酶时间(TT)在SF-400血凝仪上测得。(表5)

表5表明，本发明的TT试剂与市售含钙的试剂相比，变异系数(CV)较小，重复性较好。

表5与市售TT试剂重复性比较(n＝10)

试验例7：凝血酶试剂对肝素的敏感性分析

凝血酶冻干品用一定体积的纯水复溶，以协和质控血浆为基础，配制含有不同浓度肝素的血浆标本，并在赛科希德SF-400上检测含肝素血浆对TT试剂的影响。(结果见表6)

表6表明，本发明的TT试剂(3个批次)对肝素的敏感性很高，这一结果对临床检验科来说非常重要，能够有效监测肝素治疗的病人。

表6不同浓度的肝素对TT的影响及纠正

	Lot 1(2ml)s	Lot 2(2ml)s	Lot 3(4ml)s
				0IU/ml	17.4/17.5	18.2/18.2	18.3/17.7
0.1IU/ml	24.8/25.1	25.2/26.2	25.1/25.3
				0.2IU/ml	>200	>200	>200
0.3IU/ml	>200	>200	>200

试验例8：纤维蛋白原含量对凝血酶试剂的影响

凝血酶冻干品用一定体积的纯水复溶，以协和质控血浆为基础，利用咪唑缓冲液稀释血浆来制备低纤维蛋白原含量血浆样本，并在赛科希德SF-400凝血测试仪上监测纤维蛋白原含量对TT试剂的影响。(表7)

表7表明，本发明的TT试剂随着血浆中纤维蛋白原的减少，其检测结果在逐渐延长，说明本发明的TT试剂对血浆中纤维蛋白原的含量比较敏感，这一结果对临床检验科来说非常重要，能够有效监测纤溶治疗的患者。

表7纤维蛋白原含量对TT的影响(用咪唑缓冲液稀释2、4、6、8、10倍质控品：C11D15J1)

稀释倍数	Lot 1(s)	Lot 2(s)	Lot 3(s)
				2	21.3/21.2	21.5/21.3	22.6/22.8
4	25.8/25.8	26.6/26.8	29.2/28.9
				6	30.8/30.4	31.1/31.1	34.2/34.2
8	34.8/34.9	35.4/35.1	38.7/38.6
				10	38.1/38.3	38.8/38.5	42.7/43.2

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种凝血酶时间检测试剂，其特征在于，由凝血酶、HEPES、NaN₃、蛋白胨、氯化钙和水组成；

所述凝血酶时间检测试剂中各组分用量为：

2.根据权利要求1所述的凝血酶时间检测试剂，其特征在于，所述凝血酶为牛凝血酶。

3.一种非诊断目的检测凝血酶时间的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的凝血酶时间检测试剂检测待测血浆的凝血时间。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为：将待测血浆在37℃条件下预温3min，加入凝血酶时间检测试剂在37℃条件下进行凝血反应，记录凝血时间。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述凝血酶时间检测试剂与待测血浆的体积比为(1～2)：(1～2)。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述凝血酶时间检测试剂与待测血浆的体积比为1：1。