CN101221184A - 一种用于测定血浆纤维蛋白原fib含量的体外诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用Clauss法检验血浆纤维蛋白原(FIB)含量的体外诊断试剂盒。它是由FIB凝血酶、FIB缓冲液、FIB定值血浆组成，用于血浆中纤维蛋白原含量的测定。其优点在于凝血酶试剂复溶后稳定时间长、重复性好，同时对于光学法、磁珠法的血凝仪测定结果一致性较好，因此，对大中小型医院均适用，使不同医院的检验结果之间具有可比性，对于推行检验报告“一单通”具有重要意义，为临床诊断治疗血栓与止血类疾病提供可靠的实验数据。

Description

一种用于测定血浆纤维蛋白原FIB含量的体外诊断试剂盒

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用Clauss法测定血浆纤维蛋白原(FIB)含量的体外诊断试剂盒。

背景技术：

血浆纤维蛋白原(Fibrinogen，FIB)是所有凝血因子中含量最高的一种凝血蛋白，是参与止血、血栓形成的主要物质，是凝血活性的主要影响因素，其水平高低可以严重影响血液凝固和血流变，其水平的变化与凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管内凝血(DIC)以及炎症反应等有密切关系。近年来，发现FIB是心血管疾病的重要危险因素之一，在心血管疾病发生发展过程中，血浆FIB主要参与血管内梗阻性血栓形成，并在动脉血栓形成的最后阶段起增强作用。有报道证实大部分心肌梗死、心肌缺血性猝死以及不稳定心绞痛病人冠状动脉内均发现有梗阻性血栓形成，并认为血管内血栓形成是造成这些动脉硬化并发症的主要发病机制，因而在临床上倍受重视。又由于纤维蛋白原是由肝脏实质细胞合成的一种急性反应蛋白，在炎症或脏器损伤时合成增加，在肝功能严重受损或失代偿时合成会减少，故肝脏严重病变，如肝硬化、中毒性肝炎等可出现减低。因此，血浆纤维蛋白含量的测定，在临床中具有重要意义。

血浆纤维蛋白原属于血流变检查的重要指标，其数量或质量的异常均可导致出血性或血栓性疾病的发生。其结果准确与否，直接关系到它的临床应用价值，可影响到许多疾病的临床诊断和治疗。由于它与心血管性疾病、脑梗死、糖尿病、血栓性疾病、恶性肿瘤甚至妊娠等有着密切关系，是血栓与止血检测中的重要项目，因此血栓与止血实验室检查的临床重要性与日俱增，检验内容不断扩大，工作量也日益增多；不断出现的方法更新和试剂商品化、操作自动化，改变了以往靠手工操作、自配试剂、工作效率低的局面。与此同时，方法标准化和质量控制也显得格外重要。文献中查到和临床实验室正式使用过的检测方法有数十种。这些方法有的精密度及准确性较好，但操作过于复杂、繁琐，不适于常规应用；有的虽简便、快速，但准确性及精密度都较差。目前测定纤维蛋白原的方法大体上分三大类：(1)物理、化学测定法(2)免疫学测定法(3)功能法。物理、化学测定法是根据蛋白质的理化特性建立的，这种方法比较简单、快速，尤其适于急诊检验，但缺点是本法的特异性不强，所测的不是有凝固功能的纤维蛋白原，可能包括部分的降解产物和/或其它蛋白，影响因素较多，不适于常规工作。免疫学方法目前多采用抗FIB多克隆抗体与FIB起免疫反应，优点是大部分方法简便，但缺点是所测的不仅是可凝固的纤维蛋白原，可能包括了它的降解产物(因为它们有共同抗原)，也可能包括了障碍性纤维蛋白原，又称缺维生素K引起的蛋白质，因而特异性也较差。功能法测定是建立在FIB经凝血酶作用后形成纤维蛋白凝块基础上的，这类方法的优点是测定的是有凝血功能的纤维蛋白原，又称为可凝固蛋白(clottable protein)，最能直接反映FIB的凝血功能，故特异性较好。常规使用中，多采用Clauss法和PT-der法。

PT-Der法是在检测PT过程中演算出来的，当血浆纤维蛋白原含量在正常范围时，PT-Der法与经典的Clauss法无显著差异或略高于Clauss法；但当纤维蛋白原减低或增高时，PT-Der法往往偏高，使检测结果失去可靠性。我们用Clauss法和PT-Der法对纤维蛋白原含量作比较(表1)，结果是PT-Der法在正常组与Clauss法相比，无差异(P＞0.05)，但在增高组和降低组均有显著差异(P＜0.05、P＜0.01)。

表1PT-Der法和Clauss法测定纤维蛋白原含量的比较(单位：g/L)

	Clauss法	PT-Der法
			增高值(n＝8)	4.68±0.84	4.94±1.12
正常值(n＝32)	2.87±0.92	2.92±1.01
			减低值(n＝29)	1.14＝0.83	1.25±0.57

相较之下，Clauss法在准确度与精密度方面都是FIB含量测定很理想的选择，且操作快速、简便，对临床血栓与止血类疾病的诊断和治疗提供可信的实验数据。

发明内容：

本发明的目的是为了提供一种用Clauss法测定人血浆中纤维蛋白原含量，且操作安全简便、稳定性佳、重复性好、兼容性强的体外诊断试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

一种用Clauss法检验血浆纤维蛋白原(FIB)含量测定体外诊断试剂盒，其特征在于它是由FIB凝血酶、FIB缓冲液、FIB定值血浆组成。

1.FIB凝血酶由下述原料制成：

凝血酶80～200u/ml，氯化钠0.35～0.5％，

甘氨酸3～7％，HEPES 0.24～0.72％，NaN₃ 1‰；

该试剂中凝血酶的最适含量应选为100u/ml；

该试剂中氯化钠的最适含量应选为0.39％；

该试剂中甘氨酸的最适含量应选为4％；

该试剂中HEPES的最适含量应选为0.43％。

2.FIB缓冲液：0.05mol/L咪唑缓冲液

3.FIB定值血浆：健康人血浆，其定值由标准血浆标定得到。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1.本发明通过研究反应机理，摸清了稳定凝血酶活性的有效方法，在凝血酶试剂复溶后37℃条件下能够稳定八天，与市售产品相比，在重复性和稳定性方面较好，且结果准确性较高。因此，对于各级医院来说，使用方便、节省时间、减少浪费并降低医疗成本。

2.适用面广，对于光学法、磁珠法原理的血凝仪测定结果一致性好，具有很好的兼容性，使不同医院的检验结果之间具有可比性，对于推行检验报告“一单通”具有重要意义。

具体实施方式：

本发明的设计是由FIB凝血酶、FIB缓冲液、FIB定值血浆组成。本发明还将结合实例作进一步详述：

实施例1本发明试剂盒的应用

1.检测原理：

将凝血酶加到待测血浆中，使纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白，出现凝固。在有足量的凝血酶存在时，与不同含量的纤维蛋白原作用，其出现凝固的时间与纤维蛋白原含量呈负相关，从而计算出纤维蛋白原的含量。

2.检测步骤(太平洋TS400C血凝仪)：

将FIB凝血酶用一定体积的蒸馏水轻摇溶解。将FIB定值血浆用1.0ml蒸馏水复溶，再用缓冲液将其作1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30稀释。在血凝仪主菜单中选择FIB项目进行检测：取不同稀释度定值血浆各100μl，37℃预温孔预温3分钟，移入测量孔并激活测试通道。分别加入凝血酶溶液50μl，测定凝固时间(S)。以不同浓度纤维蛋白原定值血浆含量(mg/dL)为横坐标，以相应的凝固时间(s)为纵坐标，作标准曲线。

待测血浆用FIB缓冲液作1∶10稀释，测定凝固时间(S)，待测样本FIB含量即可直接读出。

不同血凝仪测定时，按仪器提供的参数操作，根据具体情况选择特定的标准曲线，并进行样本测定，检测结果可直接读出。

实施例2与市售FIB试剂稳定性比较

FIB凝血酶用一定体积的蒸馏水轻摇溶解，然后将复溶后试剂置于37℃保存。在太平洋TS400C血凝仪上测定同一正常质控血浆(FIB值：200～400mg/dL)，市售试剂同步进行测定。(结果见表2)

表2表明，本发明的FIB试剂在复溶后的八天内测定结果较稳定，第九天才开始有变化，而市售试剂在第二天时就开始变化，这一结果对临床检验科来说非常重要，因为它可以减少浪费，从而降低成本。

表2

实施例3与市售FIB试剂重复性比较

将本发明FIB测定试剂与市售试剂按实施例一所述的方法在太平洋TS400C血凝仪上同步测定同一样本。(结果见表3)

表3表明，本发明所讲的FIB试剂与市售试剂相比，变异系数(CV)较小，重复性较好。

表3

实施例4FIB定值血浆的定值确定

取冻干标准血浆(FIB定值：3.15g/L，该品是按暂用的国际标准品89/644定值)用1.0ml蒸馏水复溶，分别取8、12、16、20、24、28、32μl，加入相应体积的缓冲液，使稀释血浆总体积为200μl。FIB凝血酶用一定体积的蒸馏水轻摇溶解。取不同稀释度标准血浆各100μl，在太平洋TS400C血凝仪上制作标准曲线，测定本发明FIB定值血浆，重复测定5次，计算均值，得到定值。

实施例5与市售FIB试剂在光学法和磁珠法血凝仪上测定结果的比较

FIB凝血酶冻干品用一定体积的蒸馏水复溶，分别在光学法和磁珠法血凝仪上测定同一正常质控血浆(FIB值：200～400mg/dL)，重复测定10次，计算均值(X)，进行统计学分析，采用t检验比较两者的差异。(结果见表4)

经统计分析，本发明所讲的FIB试剂在光学法和磁珠法血凝仪上测定结果比较：P＞0.05，无显著性差异，结果基本一致，具有很好的兼容性，相比之下，市售试剂：P＜0.01，差异非常显著，兼容性欠佳。

表4

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (8)

1.一种用于测定血浆纤维蛋白原含量的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述体外诊断试剂盒是由FIB凝血酶、FIB缓冲液、FIB定值血浆组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，FIB凝血酶由下述原料制成：

凝血酶  80～200u/ml；氯化钠  0.35～0.5％；甘氨酸  3～7％；HEPES 0.24～0.72％；NaN₃ 1‰；余量为水。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，凝血酶的最适含量应选为100u/ml。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，氯化钠的最适含量应选为0.39％。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，甘氨酸的最适含量应选为4％。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，HEPES的最适含量应选为0.43％。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，FIB缓冲液为0.05mol/L咪唑缓冲液。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，FIB定值血浆的来源是健康人血浆，其定值由标准血浆标定得到。