CN105368916A - 一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法，该凝血酶原时间测定试剂盒通过含有多种有效成分的缓冲液体系与兔脑粉和组织因子酯化物的结合，解决了单一成分试剂的敏感度不受控的问题，进一步得到准确性高、重复性强及稳定性好且适用于多种半自动/全自动血凝仪的凝血酶原时间测定试剂。

Description

一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种体外诊断试剂盒及其制备方法，用于人血浆标本凝血酶原时间的测定。更具体地，是一种利用兔脑粉和组织因子酯化物制备的凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

医院临床实验室常规凝血实验，即凝血常规四项包括凝血酶原时间测定(PT)、部分活化凝血活酶时间测定(APTT)、凝血酶时间测定(TT)、纤维蛋白原浓度测定(FIB)，主要用于出血性疾病的筛查与诊断、血栓性疾病与血栓前状态检查、各种抗凝治疗监测以及手术前检查。其中，PT为反应机体外源性凝血途径的主要检测指标，常用于：1血液凝固异常可疑包括凝血酶原复合物多个因子(II、VII、X)，因子V，纤维蛋白原及去纤维蛋白原血症的筛选实验；2监测及调整维生素K拮抗剂，香豆素诱导剂的治疗；3监测维生素K缺乏及肝脏疾病；4术前筛选可能的止血异常疾病。

目前PT的临床检测多采用Quick法，其原理为在缺乏血小板的血浆内加入组织促凝血酶原激酶(组织因子)和Ca²⁺后凝血酶原转变为凝血酶，通过产生的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT测定结果报告方式有三种：秒值、根据标准曲线计算的百分活度，国际标准化比率(internationalnormalizedratioINR)。PT测定结果受众多因素的影响，其中凝血酶原试剂为最重要的影响因素。商品化的组织因子在敏感性上与WHO推荐的有所不同，因此生产商需要对每批试剂确定一个敏感因子，此即国际敏感指数ISI(internationalsensitivityindex)，它用来表示试剂中组织凝血活酶相对活性的指数。不同来源的组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同，为了使不同敏感性的组织凝血活酶在PT检测中得到同样的结果，必须要制定一个共同遵循的敏感指标。WHO先后制备或发出了凝血活酶的多种国际参考品(IRP)，用已知ISI值的国际参考试剂与待测组织活酶试剂检测同一标本，对结果进行比较分析，就可得出试剂的ISI数值。

目前用于生产和出售的组织凝血活酶试剂必须标有ISI数值。PT测定影响因素很多，其中最关键的是凝血酶原试剂，由于所用凝血酶原试剂的敏感度不同，即使在相同条件下对同一标本测得的结果也不同，而我国医生常用的凝血酶原百分活动度则因为标准血浆不统一而相差更大，甚至达到难以比较的程度。因此WHO于1981年提出PT标准化报告方式为INR，INR＝(PTR)ISI，其中ISI为国际敏感度指数，PTR为PT测定秒值(s)与PT标准对照秒值(s)的比值。经上述公式换算成INR值后，能克服试剂之间敏感度差异的影响，使INR值报告方式具有可比性和可信度。国内多数文献报告人工心脏瓣膜置换术后采用国际正常标准化比值对口服抗凝药物治疗的监测，结果稳定、可靠，具有可比性。在口服抗凝药治疗中，华法林类药物是非常有效的抗凝药物，它在不同病人体内的新陈代谢率不同，因而它的剂量必须仔细监测，否则就会因超剂量而造成出血或因为剂量不足导致疾病复发，血栓形成。由此可见在凝血酶原时间的测定中，准确的INR结果对临床抗凝治疗药物的监测非常重要。但是不同ISI值的PT试剂测得的INR结果差异非常显著，而且当标本的INR值越高时，测定结果差异越显著。理论上，ISI值越接近1.0，表明试剂越敏感。

但是由于实验室使用PT试剂质量上的不同，使得同一个患者在不同医院测定的结果相差悬殊，造成检测结果的不一致，影响对疾病的正确、及时诊断。因此，PT试剂的质量成了获得准确结果及诊断的关键。同时，由于试剂复溶后的稳定性差，造成浪费，导致医疗单位成本增加，患者负担加重。所以研制一种安全、可靠、准确、稳定，保存时间长的PT试剂，对临床诊断疾病来说是十分必要的。

发明内容

为了克服上述现有背景技术中的不足，本发明提供一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法，该凝血酶原时间测定试剂盒通过含有多种有效成分的缓冲液体系与兔脑粉和组织因子酯化物的结合，解决了单一成分试剂的敏感度不受控的问题，进一步得到准确性、重复性及稳定性等总体性能更好的凝血酶原时间测定试剂。

为了实现上述目的，本发明提供一种凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，所述凝血酶原时间测定试剂由凝血活酶和缓冲液体系组成，所述凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的2～8wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.1～0.5wt％；所述缓冲液体系中各组分含量为：0.1～0.48wt％的TAPSO、0.5～1.8wt％的甘氨酸、0.4～1.0wt％的聚乙二醇6000、0.4～1.0wt％的硫酸钠、0.01～0.2wt％的叠氮化钠、0.01～0.2wt％的Brij-35、6～20mM的氯化钙，其余为水，所述缓冲液体系的pH值为5.0～7.0。

优选地，在上述技术方案中，所述兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的4～6wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.32～0.43wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述TAPSO在缓冲液体系中的含量为0.35～0.43wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述甘氨酸在缓冲液体系中的含量为1.0～1.2wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述聚乙二醇6000在缓冲液体系中的含量为0.6～0.8wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述硫酸钠在缓冲液体系中的含量为0.5～0.7wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述叠氮化钠在缓冲液体系中的含量为0.05～0.15wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述Brij-35在缓冲液体系中的含量为0.07～0.1wt％。

优选地，在上述技术方案中，所述氯化钙在缓冲液体系中的含量为7.2～12mM。

本发明还提供一种制备上述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：包括如下步骤：(1)按照不同配比配制缓冲液体系，温浴，称量兔脑粉加入温浴中的缓冲液体系，搅拌混匀，将混匀后的混合溶液离心，取上层液体后加入组织因子酯化物，充分混匀后得到初始的凝血酶原时间测定试剂；(2)将初始试剂在血凝仪上进行质控的测定，将质控测定结果调至符合该机型血凝仪配套质控说明书要求的范围，测定结果最接近质控平均值的试剂配方确定为相应机型最终的试剂配比；(3)以最终的试剂配比，按照步骤(1)的配制方法得到最终的凝血酶原时间测定试剂，经过分装、冻干，即配制成为凝血酶原时间测定试剂盒。

本发明的有益效果：提供一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法，该凝血酶原时间测定试剂盒通过含有多种有效成分的缓冲液体系与兔脑粉和组织因子酯化物的结合，解决了单一成分试剂的敏感度不受控的问题，进一步得到准确性高、重复性强及稳定性好且适用于多种半自动/全自动血凝仪的凝血酶原时间测定试剂。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

本发明的凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的2～8wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.1～0.5wt％；缓冲液体系中各组分含量为：0.1～0.48wt％的TAPSO、0.5～1.8wt％的甘氨酸、0.4～1.0wt％的聚乙二醇6000、0.4～1.0wt％的硫酸钠、0.01～0.2wt％的叠氮化钠、0.01～0.2wt％的Brij-35、6～20mM的氯化钙，其余为水，缓冲液体系的pH值为5.0～7.0。使用本发明试剂盒时，待测血浆与凝血酶原时间测定试剂用量的体积比为1:1.9～2.2。

制备上述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，包括如下步骤：(1)按照不同配比配制缓冲液体系，温浴，称量兔脑粉加入温浴中的缓冲液体系，搅拌混匀，将混匀后的混合溶液离心，取上层液体后加入组织因子酯化物，充分混匀后得到初始的凝血酶原时间测定试剂；(2)将初始试剂在血凝仪上进行质控的测定，将质控测定结果调至符合该机型血凝仪配套质控说明书要求的范围，测定结果最接近质控平均值的试剂配方确定为相应机型最终的试剂配比；(3)以最终的试剂配比，按照步骤(1)的配制方法得到最终的凝血酶原时间测定试剂，经过分装、冻干，即配制成为凝血酶原时间测定试剂盒。

实施例1

凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的7wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.25wt％；缓冲液体系中各组分含量为：0.32wt％的TAPSO、1.36wt％的甘氨酸、0.92wt％的聚乙二醇6000、,0.47wt％的硫酸钠、0.03wt％的叠氮化钠、0.16wt％的Brij-35、14mM的氯化钙，其余为水，缓冲液体系的pH值为5.0。

制备凝血酶原时间测定试剂盒的方法，包括如下步骤：(1)按照不同配比配制缓冲液体系，温浴，称量兔脑粉加入温浴中的缓冲液体系，搅拌混匀，将混匀后的混合溶液离心，取上层液体后加入组织因子酯化物，充分混匀后得到初始的凝血酶原时间测定试剂；(2)将初始试剂在血凝仪上进行质控的测定，将质控测定结果调至符合该机型血凝仪配套质控说明书要求的范围，测定结果最接近质控平均值的试剂配方确定为相应机型最终的试剂配比；(3)以最终的试剂配比，按照步骤(1)的配制方法得到最终的凝血酶原时间测定试剂，经过分装、冻干，即配制成为凝血酶原时间测定试剂盒。

应用本实施例得到的试剂盒借助血凝仪测定待测血浆的凝血酶原时间，测定方法为：先将凝血酶原时间测定试剂温浴至37℃，待测血浆置于37℃温浴3min，再将待测血浆与凝血酶原时间测定试剂按照体积比为1:1.9～2.2的比例混合，立刻混匀计时，记录凝血酶原时间。做十次平行实验，记录数据，分析本实施例试剂的重复性，本实施例中试剂重复性如表2。

实施例2

凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的8wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.1wt％；缓冲液体系中各组分含量为：0.48wt％的TAPSO、1.8wt％的甘氨酸、1.0wt％的聚乙二醇6000、0.4wt％的硫酸钠、0.2wt％的叠氮化钠、0.01wt％的Brij-35、20mM的氯化钙，其余为水，缓冲液体系的pH值为6.3。

凝血酶原时间测定试剂盒制备方法同实施例1。

应用本实施例得到的试剂盒在血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间，测定方法同实施例1，做十次平行实验，记录数据，分析本实施例试剂的重复性，本实施例中试剂重复性如表2。

实施例3

凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的2wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.5wt％；缓冲液体系中各组分含量为：0.1wt％的TAPSO、0.5wt％的甘氨酸、0.4wt％的聚乙二醇6000、1.0wt％的硫酸钠、0.01wt％的叠氮化钠、0.2wt％的Brij-35、6mM的氯化钙，其余为水，缓冲液体系的pH值为7.0。

凝血酶原时间测定试剂盒制备方法同实施例1。

应用本实施例得到的试剂盒在血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间，测定方法同实施例1，做十次平行实验，记录数据，分析本实施例试剂的重复性，本实施例中试剂重复性如表2。

实施例4

凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的6wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.32wt％；缓冲液体系中各组分含量为：0.43wt％的TAPSO、1.0wt％的甘氨酸、0.8wt％的聚乙二醇6000、0.5wt％的硫酸钠、0.15wt％的叠氮化钠、0.07wt％的Brij-35、12mM的氯化钙，其余为水，缓冲液体系的pH值为6.0。

凝血酶原时间测定试剂盒制备方法同实施例1。

应用本实施例得到的试剂盒在血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间，测定方法同实施例1，做十次平行实验，记录数据，分析本实施例试剂的重复性，本实施例中试剂重复性如表2。

实施例5

凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的4wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.43wt％；缓冲液体系中各组分含量为：0.35wt％的TAPSO、1.2wt％的甘氨酸、0.6wt％的聚乙二醇6000、0.7wt％的硫酸钠、0.05wt％的叠氮化钠、0.1wt％的Brij-35、7.2mM的氯化钙，其余为水，缓冲液体系的pH值为7.0。

凝血酶原时间测定试剂盒制备方法同实施例1。

应用本实施例得到的试剂盒在血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间，测定方法同实施例1，做十次平行实验，记录数据，分析本实施例试剂的重复性，本实施例中试剂重复性如表2。

实验例

实验例1

本发明试剂在不同厂家机型上的ISI值测定结果对比如表1。

表1：在不同厂家机型上本发明试剂ISI值测定结果对比

机型	ISI值
		ACL top300	1.25
STAGO compact	1.30
		CA500	1.13
GDC040	1.30

实验例2

应用实施例1～5得到的试剂盒借助血凝仪测定待测血浆的凝血酶原时间，测定方法为：先将凝血酶原时间测定试剂温浴至37℃，待测血浆置于37℃温浴3min，再将待测血浆与凝血酶原时间测定试剂按照体积比为1:2的比例混合，立刻混匀计时，记录凝血酶原时间。每个实施例的试剂盒做十次平行实验，记录数据。用市售试剂测定同样的血浆样本，记录下凝血酶原时间，本发明试剂与市售试剂重复性比较结果如表2。

表2：本发明试剂与市售试剂重复性比较

表2表明，本发明试剂与市售试剂相比，变异系数(CV)值较小，重复性好

实验例3

本发明试剂与市售试剂稳定性比较结果如表3。

表3：本发明试剂与市售试剂稳定性比较

试剂	1天	3天	5天	8天	10天	12天	14天	17天	19天
										实施例5试剂	13.1	12.9	12.8	12.9	13.2	13.1	13.3	13.1	13.7
市售试剂	13.2	13.0	13.1	12.3	13.6	14.2	15.3	15.7	16.5

表3表明，本发明试剂的凝血酶原时间值从第19天开始才出现变化，而市售试剂的凝血酶原时间值从第10天就发生了变化，说明本发明试剂的稳定性较好。

Claims (11)

1.一种凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，其特征在于：所述凝血活酶包括兔脑粉和组织因子酯化物，兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的2～8wt％，组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.1～0.5wt％；

所述缓冲液体系中各组分含量为：0.1～0.48wt％的TAPSO、0.5～1.8wt％的甘氨酸、0.4～1.0wt％的聚乙二醇6000、0.4～1.0wt％的硫酸钠、0.01～0.2wt％的叠氮化钠、0.01～0.2wt％的Brij-35、6～20mM的氯化钙，其余为水，所述缓冲液体系的pH值为5.0～7.0。

2.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述兔脑粉在缓冲体系中的用量占缓冲液重量的4～6wt％。

3.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述组织因子酯化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0.32～0.43wt％。

4.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述TAPSO在缓冲液体系中的含量为0.35～0.43wt％。

5.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述甘氨酸在缓冲液体系中的含量为1.0～1.2wt％。

6.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述聚乙二醇6000在缓冲液体系中的含量为0.6～0.8wt％。

7.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述硫酸钠在缓冲液体系中的含量为0.5～0.7wt％。

8.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述叠氮化钠在缓冲液体系中的含量为0.05～0.15wt％。

9.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述Brij-35在缓冲液体系中的含量为0.07～0.1wt％。

10.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于：所述氯化钙在缓冲液体系中的含量为7.2～12mM。

11.制备权利要求1所述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)按照不同配比配制缓冲液体系，温浴，称量兔脑粉加入温浴中的缓冲液体系，搅拌混匀，将混匀后的混合溶液离心，取上层液体后加入组织因子酯化物，充分混匀后得到初始的凝血酶原时间测定试剂；(2)将初始试剂在血凝仪上进行质控的测定，将质控测定结果调至符合该机型血凝仪配套质控说明书要求的范围，测定结果最接近质控平均值的试剂配方确定为相应机型最终的试剂配比；(3)以最终的试剂配比，按照步骤(1)的配制方法得到最终的凝血酶原时间测定试剂，经过分装、冻干，即配制成为凝血酶原时间测定试剂盒。