CN111638374A

CN111638374A - 一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒

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Publication number: CN111638374A
Application number: CN202010516901.1A
Authority: CN
Inventors: 郑琳; 陈明峰; 郑筱雯; 余嘉陵
Original assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: CN111638374B

Abstract

本发明公开了一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300。本发明中，创造性地采用缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300复配配制缓冲液体系，与凝血活酶相互配合，协同作用，可以在保证凝血酶原时间测定试剂的准确性和灵敏性的基础上，提高凝血酶原时间测定试剂的稳定性。

Description

一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及临床诊断试剂领域，特别涉及一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒。

背景技术

凝血功能正常与否关系着人体生理健康状态，凝血功能的评估实验对多种疾病的诊断、治疗和预后判断有重要意义。凝血过程复杂，检测指标多样，主要分为外源性凝血途径和内源性凝血途径。凝血时间是衡量凝血状态的状态的重要指标，对于判断机体止血和凝血系统的病理性变化、术前凝血性疾病筛查等具有重要意义。其中，凝血酶原时间(PT，ProthrombinTime)是凝血时间检测中外源性凝血功能检测的重要指标，适用于外源性凝血途径的先天性凝血疾病及获得性出血性疾病的诊断，同时也是外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，主要监测凝血因子I、II、V、VII、X的水平，对诊断重症肝炎及早期肝硬化有重要意义，也是临床上口服抗凝药物治疗监控的首选试验指标。PT延长：先天性凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏症；纤维蛋白原(Fg)缺乏(＜0.5g/L)；无纤维蛋白原(Fg)血症；异常纤维蛋白原(Fg)血症；弥散性血管内凝血；原发性纤溶亢进；严重的急慢性肝病；阻塞性黄疸；Vit-K缺乏；循环抗凝物质增多等。PT缩短：先天性凝血因子Ⅴ增多症、血栓性疾病、弥散性血管内凝血(DIC)高凝期；口服避孕药等。

凝血酶原时间(PT)的检测原理：在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液)和钙离子使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间。正常凝血酶原时间位于11.0s-14.0s。

凝血酶原时间测定过程受多种因素的影响，其中凝血酶原时间测定试剂的质量是最关键因素，由于目前国内的凝血酶原时间测定试剂普遍存在产品质量不稳定、敏感性差的问题，致使检测结果不稳定，不同的临床检验实验室之间测得的结果难以比较。有的冻干试剂，需复溶后使用，造成试剂的瓶间差异较大，导致测定结果之间存在较大差异。

因此，如何研制一种稳定性高、使用方便的凝血酶原时间测定试剂，已经成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，使用方便，在保证凝血酶原时间测定试剂的准确性和灵敏性的基础上，提高凝血酶原时间测定试剂的稳定性。

为本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300。

进一步地，所述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.01-0.5M，所述钙离子试剂的质量分数为0.5-15％，所述表面活性剂的质量分数为0.1-10％，所述氨基酸的质量分数为0.5-15％，所述海藻糖的质量分数为0.1-0.5％，所述proclin300的体积分数为0.1-0.5％。

进一步地，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

进一步地，所述缓冲剂选自Tris－Hcl缓冲液、MPOS缓冲液、HEPES缓冲液、TRICINE缓冲液、TAPSO缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。

进一步地，所述钙离子试剂为氯化钙。

进一步地，所述表面活性剂为聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、曲拉通、吐温、Brij35中的至少一种。

进一步地，所述氨基酸为L型氨基酸。

进一步地，所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、络氨酸、苏氨酸中的至少一种。

进一步地，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为40-60％。

本发明具有如下有益效果：

本发明中，创造性地采用缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300复配配制缓冲液体系，与凝血活酶相互配合，协同作用，可以在保证凝血酶原时间测定试剂的准确性和灵敏性的基础上，提高凝血酶原时间测定试剂的稳定性。

现有的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒中，通常采用玻璃瓶盛放凝血酶原时间测定试剂，本发明改变传统，采用塑料瓶盛放凝血酶原时间测定试剂，不仅可以保证运输产品的安全性，而且出乎意料地可以提高凝血酶原时间测定试剂的稳定性。

本发明的凝血酶原时间测定试剂具有良好的稳定性，37℃下可稳定至少10天，试剂开瓶后于5±3℃下至少稳定30天以上。

本发明的凝血酶原时间测定试剂为即开即用型，不需复溶，操作方便。

具体实施方式

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。

本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。

在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本申请引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。

正如背景技术所描述的，现有技术中存在凝血酶原时间测定试剂普遍存在产品质量不稳定、敏感性差的问题，致使检测结果不稳定，不同的临床检验实验室之间测得的结果难以比较的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶。

所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300。

更具体地，所述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.01-0.5M，所述钙离子试剂的质量分数为0.5-15％，所述表面活性剂的质量分数为0.1-10％，所述氨基酸的质量分数为0.5-15％，所述海藻糖的质量分数为0.1-0.5％，所述proclin300的体积分数为0.1-0.5％，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

所述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.01-0.5M，例如为0.01M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

本发明中，对所述缓冲剂的种类没有特别限制，以本领域技术人员熟知的制备凝血酶原时间测定试剂中的缓冲剂剂即可，作为优选，所述缓冲剂选自Tris－Hcl缓冲液、MPOS缓冲液、HEPES缓冲液、TRICINE缓冲液、TAPSO缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。

所述缓冲液体系中，所述钙离子试剂的质量分数为0.5-15％，例如为0.5％、2％、5％、8％、10％、12％或15％等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。本发明中，对所述钙离子试剂的种类没有特别限制，以本领域技术人员熟知的制备凝血酶原时间测定试剂中的钙离子试剂，可以形成钙离子即可。作为优选，所述钙离子试剂为氯化钙。

所述缓冲液体系中，所述表面活性剂的质量分数为0.1-10％，例如为0.1％、1％、2％、5％、8％、或10％等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。本发明中，对所述表面活性剂的种类没有特别限制，以本领域技术人员熟知的制备凝血酶原时间测定试剂中的表面活性剂即可，作为优选，所述表面活性剂为聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、曲拉通、吐温、Brij35中的至少一种。

所述缓冲液体系中，所述氨基酸的质量分数为0.5-15％，例如为0.5％、2％、2％、5％、8％、10％、12％或15％等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。作为优选，所述氨基酸为L型氨基酸。更具体地，所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、络氨酸、苏氨酸中的至少一种。

所述缓冲液体系中，所述海藻糖的质量分数为0.1-0.5％，例如为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

所述缓冲液体系中，所述proclin300的体积分数为0.1-0.5％，例如为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

本发明中的缓冲液体系中除了含有缓冲剂、钙离子试剂外，还复配有氨基酸、海藻糖和proclin300复配配制缓冲液体系，其中，以氨基酸、海藻糖和proclin300复配作为稳定剂，发明人在实践中出乎意料地发现，采用本发明特定的缓冲液体系，与凝血活酶相互配合，协同作用，可以在保证凝血酶原时间测定试剂的准确性和灵敏性的基础上，提高凝血酶原时间测定试剂的稳定性，取得了预料不到的技术效果。

凝血活酶，即凝血因子Ⅲ，通常称为组织因子(tissue factor，TF)。本发明实施例中，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得。本发明对凝血活酶的来源没有特殊的限制，可采用本领域技术人员熟知的符合上述要求的市售商品，也可按照本领域技术人员常用的方法制备得到。作为举例，所述凝血活酶的制备方法为：向兔脑粉中加入低金属螯合能力的缓冲液以及非离子表面活性剂，待混合均匀后置于37℃下的恒温水浴锅中孵育30min。最后将混合液在8000r/min下离心3min，移取上清液，即为提取的凝血活酶，其中，兔脑粉浓度为20mg/mL，低金属螯合能力的缓冲液浓度为20mmol/L，非离子表面活性剂体积百分比浓度为0.1％；低金属螯合能力的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液(PIPES)、N-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液(TES)或双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷缓冲液(Bis-Tris)；非离子表面活性剂选自曲拉通X-405(Tx-405)、吐温20(Tw-20)、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(F68)或司班(Span 60)。

本发明实施例中，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为40-60％。

现有的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒中，通常采用玻璃瓶盛放凝血酶原时间测定试剂，本发明改变传统，创造性地采用塑料瓶盛放凝血酶原时间测定试剂，不仅可以保证运输产品的安全性，使得产品在生产和运输过程中不易出现损坏，而且发明人出乎意料地发现，采用塑料瓶盛放A凝血酶原时间测定试剂可以提高凝血酶原时间测定试剂的稳定性。

本发明中，对所述塑料瓶的材质不作特别限定，可以采用现有技术中已有的各种塑料瓶，作为举例，所述塑料瓶的材质为PET、PVC、HDPE、LDPE、PP、或PS，更优选地，所述塑料瓶的材质为PET。

目前国内大多凝血酶原时间测定试剂为冻干粉制剂形式，使用前需对试剂进行复溶，操作比较麻烦，且容易因复溶液体积不准等造成测定结果出现误差。本发明中，凝血酶原时间测定试剂为即开即用型，不需复溶，操作方便。

本发明中，所述用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒的检测方法为：待测血浆37℃孵育后加入凝血酶原时间测定试剂，记录凝固时间，即为凝血酶原时间。

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施例对上述技术方案进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。

实施例1

一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300；述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.2M，所述钙离子试剂的质量分数为8％，所述表面活性剂的质量分数为5％，所述氨基酸的质量分数为7％，所述海藻糖的质量分数为0.3％，所述proclin300的体积分数为0.3％，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

所述缓冲剂选自Tris－Hcl缓冲液；所述钙离子试剂为氯化钙；所述表面活性剂为聚乙二醇；所述氨基酸为丙氨酸。

基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为50％。

实施例2

一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300；述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.01M，所述钙离子试剂的质量分数为0.5％，所述表面活性剂的质量分数为0.1％，所述氨基酸的质量分数为0.55％，所述海藻糖的质量分数为0.1％，所述proclin300的体积分数为0.1％，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

所述缓冲剂选自MPOS缓冲液；所述钙离子试剂为氯化钙；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠；所述氨基酸为甘氨酸。

基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为40％。

实施例3

一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300；述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.5M，所述钙离子试剂的质量分数为15％，所述表面活性剂的质量分数为10％，所述氨基酸的质量分数为-15％，所述海藻糖的质量分数为0.5％，所述proclin300的体积分数为0.5％，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

所述缓冲剂选自HEPES缓冲液；所述钙离子试剂为氯化钙；所述表面活性剂为曲拉通；所述氨基酸为缬氨酸。

基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为60％。

实施例4

一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300；述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.2M，所述钙离子试剂的质量分数为0.5％，所述表面活性剂的质量分数为30％，所述氨基酸的质量分数为15％，所述海藻糖的质量分数为0.3％，所述proclin300的体积分数为0.1％，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

所述缓冲剂选自TRICINE缓冲液；所述钙离子试剂为氯化钙；所述表面活性剂为聚乙二醇和吐温；所述氨基酸为丙氨酸和谷氨酸。

基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为48％。

对比例1

基于实施例1，不同之处仅在于：本对比例1中采用玻璃瓶盛放所述凝血酶原时间测定试剂。

对比例2

基于实施例1，不同之处仅在于：本对比例2的缓冲液体系中不含有氨基酸。

对比例3

基于实施例1，不同之处仅在于：本对比例3的缓冲液体系中不含有表面活性剂。

对比例4

基于实施例1，不同之处仅在于：本对比例4的缓冲液体系中不含有海藻糖。

对比例5

基于实施例1，不同之处仅在于：本对比例5的缓冲液体系中不含有proclin300。

测试例

为验证本发明产品性能，对实施例1－4和对比例1－5所制得的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒分别进行了相关性能测试。

所述用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒的检测方法为：

取用塑料瓶盛放的凝血酶原时间测定试剂，用sysmexCS－1300凝血分析仪对从siemens购买的质控血浆(正常质控血浆N：11－14s)进行测试，具体的测试方法为：

加入50uL样本，37℃孵育3min后再加入100uL凝血酶原时间测定试剂，记录凝固时间，即为凝血酶原时间。

稳定性测试1：将实施例1－4和对比例1－5中的体外诊断试剂盒在37℃保存，sysmexCS－1300凝血分析仪上测定同一批正常质控血浆N，检测10天内凝血酶原时间测定试剂的稳定性，结果见表1。

	第0天	第3天	第7天	第10天	变化幅度
						实施例1	11.4	11.3	11.6	11.9	4％
实施例2	11.9	12.0	12.2	12.4	4.2％
						实施例3	11.8	11.9	12.2	12.3	4.2％
实施例4	11.5	11.6	11.8	12.0	4.3％
						对比例1	11.3	11.5	12.1	12.5	10.6％
对比例2	11.2	12.3	14.0	14.2	26.8％
						对比例3	11.2	11.7	11.9	12.6	12.5％
对比例4	11.3	12.3	14.2	14.5	28.3％
						对比例5	11.4	11.9	12.3	12.9	13.2％

稳定性测试2：将实施例1－4和对比例1－5中的体外诊断试剂盒开瓶后再2－8℃下保存，sysmexCS－1300凝血分析仪上测定同一批正常质控血浆N，检测30天内凝血酶原时间测定试剂的稳定性，结果见表2。

准确性测试

用实施例1的体外诊断试剂盒测试了50例临床样本，检测仪器为sysmex CS－1300凝血分析仪，同时用与仪器配套的市售凝血酶原时间测定试剂(siemens)进行对照，检测结果表明，实施例1中的凝血酶原时间测定试剂的测试结果与现有可靠的市售试剂(siemens)测试结果相关性良好，两者偏差较小。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，其包括凝血酶原时间测定试剂和用于盛放所述凝血酶原时间测定试剂的塑料瓶；其中，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和凝血活酶组成，所述凝血活酶以兔脑粉为原料提取获得；所述缓冲液体系由下述原料制成：缓冲剂、钙离子试剂、表面活性剂、氨基酸、海藻糖和proclin300。

2.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲液体系中，所述缓冲剂的摩尔浓度为0.01-0.5M，所述钙离子试剂的质量分数为0.5-15％，所述表面活性剂的质量分数为0.1-10％，所述氨基酸的质量分数为0.5-15％，所述海藻糖的质量分数为0.1-0.5％，所述proclin300的体积分数为0.1-0.5％。

3.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲液体系的pH值为7.0－8.0。

4.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲剂选自Tris－Hcl缓冲液、MPOS缓冲液、HEPES缓冲液、TRICINE缓冲液、TAPSO缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。

5.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述钙离子试剂为氯化钙。

6.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、曲拉通、吐温、Brij35中的至少一种。

7.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述氨基酸为L型氨基酸。

8.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、络氨酸、苏氨酸中的至少一种。

9.如权利要求1所述的用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒，其特征在于，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的体积百分比浓度为40-60％。