CN112129941A - 一种检测鳞状上皮细胞癌抗原的化学发光试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫试剂盒,包括包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体的磁珠稀释液、酶标抗体溶液和化学发光底物液,磁珠稀释液包含以下浓度组分:缓冲体系75~125mmol/L,表面活性剂10~20g/L,海藻糖30~35g/L,丙氨酸10~15g/L,Proclin 300 0.5~1g/L;磁珠稀释液的pH值为7.0±0.05。本发明通过在通过优化磁珠稀释液的缓冲体系,抗体包被磁珠周围形成水膜,降低磁珠的非特异性吸附,减少对免疫反应的干扰,从而降低SCC背景噪音。
Description
技术领域
本发明涉及生物物质检测技术领域,尤其涉及一种检测鳞状上皮细胞癌抗原的化学发光试剂盒。
背景技术
目前已知的鳞状上皮细胞癌抗原测定方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强比浊法和化学发光免疫法(CLEIA)等。放射免疫法具有准确性高的优点,但是该方法使用了放射性物质,有辐射影响,实验废物需要专门的实验室,成本高且半衰期短,目前已经逐渐淘汰。酶联免疫吸附法由于其方法学的局限性,存在检测时间长,操作复杂,特异性差,灵敏度低,重复性差等缺点。胶乳增强比浊法操作简单快速,但灵敏度低,低值重复性差。而化学发光免疫法是将高灵敏度的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合,具有操作简便,线性范围宽,灵敏度高,精密度高,重复性好等优点,现有技术中是将抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体包被于磁性微球表面,便于在反应和检测中分离和清洗,可重复多次使用,但是其包被有抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体在制备试剂盒中,对其使用的悬浮液,往往具有较高的背景噪音,致使其检测灵敏度下降。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫试剂盒,包括包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体的磁珠、磁珠稀释液、酶标抗体溶液和化学发光底物液;
所述磁珠稀释液包含以下浓度组分:
缓冲体系75~125mmol/L,
表面活性剂10~20g/L,
海藻糖30~35g/L,
丙氨酸10~15g/L,
Proclin 300 0.5~1g/L;
所述磁珠稀释液的pH值为7.0±0.05。
进一步的,所述缓冲体系选自N-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸,N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸,3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸,N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸或3-[N,N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸中的一种。
进一步的,所述包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体磁珠为经过低聚半乳糖修饰的磁珠通过偶联抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体a得到。
具体的,所述低聚半乳糖修饰的磁珠的制备步骤包括:将分散相分散于连续相中,通过采用膜乳化法进行乳化,在加入磁珠进行交联,即可得到低聚半乳糖修饰的磁珠;其中,分散相为低聚半乳糖的溶液,其中包含2%v/v的醋酸;连续相包含液体石蜡58~60份、石油醚35~38份和乳化剂3~5份。
具体的,乳化剂为乳化矿物油。
具体的,交联剂为按照氨基醛基摩尔比为2:1加入戊二醛饱和的甲苯溶液,交联结束后,调节pH为9~10。
具体的,交联结束后得到的磁珠依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮和超纯洗涤,并用硼氢化钠还原后再水洗至中性。
具体的,所述表面活性剂选自Tetronic 1307、胆酸钠、Emulgen A60、EmulgenB66、EmpigenBB detergent和Emulgen 430中的一种。
进一步的,所述的化学发光试剂盒,其特征在于,还包括校准品和质控品。
具体的,所述校准品和质控品的配制均采用校准稀释液稀释鳞状上皮细胞抗原进行配制;所述校准稀释液包含100mmol/L PB,0.09g/L NaCl,5g/L Tween 80,5g/L海藻糖,3g/L BSA,2g/L Proclin 300;所述标准稀释液pH值为7.5±0.05。
本发明至少具有以下有益效果:
本发明通过在通过优化磁珠稀释液的缓冲体系,抗体包被磁珠周围形成水膜,降低磁珠的非特异性吸附,减少对免疫反应的干扰和对标记用酶的抑制作用,从而降低SCC背景噪音。
附图说明
图1为本发明实施例14的试剂盒I雷杜测值浓度与罗氏定值浓度的样本的线性相关结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫试剂盒
本发明提供一种鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫试剂盒,包括包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体的磁珠、磁珠稀释液、酶标抗体溶液和化学发光底物液;
磁珠稀释液包含以下浓度组分:
缓冲体系75~125mmol/L,
表面活性剂10~20g/L,
海藻糖30~35g/L,
丙氨酸10~15g/L,
Proclin 300 0.5~1g/L;
所述磁珠稀释液的pH值为7.0±0.05。
在本发明提供的上述试剂盒中,本发明采用磁微粒化学发光免疫分析双抗体夹心法,设计定量检测鳞状上皮细胞癌抗原(简称为SCC)试剂盒,主要原理为:磁微粒包被的抗SCC单克隆抗体a结合人血清或血浆中的SCC,SCC再与碱性磷酸酶(简称为ALP)标记的抗SCC单克隆抗体b结合,形成双抗体夹心复合物,最后加入金刚烷底物(简称为AMPPD),AMPPD在ALP的作用下从基态变为不稳定的激发态,不稳定的激发态再回到基态时产生477nm的光,通过化学发光检测系统可定量检测血清或血浆中SCC的浓度。
本发明的目的,通过优化磁珠稀释液的缓冲体系和表面活性剂的种类,来降低化学发光免疫分析法检测SCC的背景信号,从而提高SCC化学发光免疫检测试剂盒检测灵敏度、精密度和准确度。
其中,缓冲体系选自N-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸(J简称为ADA),N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(简称为ACES),3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(简称为MOPSO),N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(简称为BES),3-[N,N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(简称为DIPSO)缓冲体系中的一种。筛选的5种缓冲体系ADA、ACES、MOPSO、BES和DIPSO都是两性离子缓冲体系,其缓冲pH使用范围内包含SCC抗体等电点pH。这5种两性离子缓冲体系不参加和干扰免疫反应的发生,且都存在亲水性的羟基官能团或磺酸基团,疏水性的氨基,能在抗体包被磁珠周围形成水膜,降低磁珠的非特异性吸附,此外氨基官能团能封闭超顺羧基化磁珠上未结合的SCC抗体的多余活性羟基团,也能减少非特异性吸附,降低SCC背景噪音。
对于磁珠稀释液的液体包含的组分浓度,缓冲体系的浓度还可选自80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L,表面活性剂浓度还可选自12g/L、14g/L、16g/L、18g/L,海藻糖浓度还可选自31g/L、32g/L、33g/L、34g/L,丙氨酸浓度还可选自11g/L、12g/L、13g/L、14g/L,Proclin 300浓度还可选自0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L。其中,表面活性剂选自选自Tritox-100、Emulgen A90、Emulgen A60、GENAPOLX-080,吐温-20和吐温-80中的一种。
具体的,包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体磁珠的制备过程包括以下步骤:
S11、将低聚半乳糖修饰的磁珠TBSA缓冲液洗涤3次后,在磁场中进行磁性分离,去除上清液,用硼酸缓冲液重悬,经EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)活化剂在25℃活化1-2h后,去除上清液;
S12、将活化后的磁珠再次用硼酸缓冲液重悬,加入抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体a,置于混匀仪上混匀偶联2-3h,去除上清液;
S13、对偶联后的抗体磁珠封闭处理0.5h,去除上清液,用TBST缓冲液洗涤2-3次,加入保存液于2-8℃保存,备用。
其中,TBST缓冲液包含50mM TrisHCl、8g/L NaCl、0.2g/L KCl、0.5mL/L吐温-20,所述的TBST缓冲液pH值为7.5±0.0.5;硼酸缓冲液pH值为7.0±0.0.5;封闭液包含100mMPBS、1~5wt%赖氨酸和1~5wt%牛血清白蛋白,封闭液pH值为7.0±0.05;所述保存液包含100mM Tris、0.5wt%NaCl、0.1wt%BSA,0.05wt%Proclin300,所述保存液pH值为7.0±0.05。
具体的,低聚半乳糖修饰的磁珠的制备步骤包括:将分散相分散于连续相中,通过采用膜乳化法进行乳化,在加入磁珠(商品化磁珠,主要结构为硅烷化四氧化三铁磁珠)进行交联,即可得到低聚半乳糖修饰的磁珠;其中,分散相为低聚半乳糖的溶液,其中包含2%v/v的醋酸;连续相包含液体石蜡58~60份、石油醚35~38份和乳化剂3~5份。
具体的,乳化剂为乳化矿物油。
具体的,交联剂为按照氨基醛基摩尔比为2:1加入戊二醛饱和的甲苯溶液,交联结束后,调节pH为9~10。
具体的,交联结束后得到的磁珠依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮和超纯洗涤,并用硼氢化钠还原后再水洗至中性。
为具体说明低聚半乳糖的制备过程,将其实施例列入表1,其中为连续相为其组分的比例。
表1
具体的,酶标抗体溶液的制备过程包括以下步骤:
S21、用2IT(2-亚胺基硫烷盐酸盐)蛋白活化剂将抗鳞状细胞癌抗原的抗体b在室温下静置20min进行活化处理,再加入甘氨酸溶液再次混匀5min后,经除盐后,得到活化的抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体b溶液;
S22、将碱性磷酸酶溶液与SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液,充分混匀,室温下静置30min,经纯化后,得到活化的碱性磷酸酶酶溶液;
S23、将活化后的抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体b溶液与活化后的碱性磷酸酶溶液按一定比例混合,在2-8℃条件下静置反应20h后,经纯化,得到碱性磷酸酶标记的抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体b溶液,即为所述酶标抗体溶液,保存备用。其中,除盐和纯化均采用葡聚糖G-25凝胶柱层析处理;保存方式为向酶标抗体溶液中按照1:1的体积加入甘油,于-20℃条件下保存。
进一步的,本发明提供的化学发光试剂盒还包括校准品和质控品。
校准品和质控品的配制均采用校准稀释液稀释鳞状上皮细胞抗原进行配制;校准稀释液包含100mmol/L PB,0.09g/L NaCl,5g/L Tween 80,5g/L海藻糖,3g/L BSA,2g/LProclin 300;所述校准稀释液pH值为7.5±0.05。
将SCC溶解于校准稀释液,配制成0.0ng/mL、0.1ng/mL、1.5ng/mL、10.0ng/mL、35.0ng/mL、70.0ng/mL校准品和2.5ng/mL和50.0ng/mL的质控品。
下面将本发明提供的化学发光试剂盒中磁珠稀释液的缓冲液的实施例和对比例列入表2。其中,列出了实施例7-20与对比例7-18中磁珠的选用。
表2
对鳞状上皮细胞癌抗原的检测评价
1、实验评价方案
本发明以雷杜1200全自动化学发光分析仪为检测工具,对上述实施例和对比例进行鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)化学发光免疫试剂盒性能评价。
(1)精密度和低端信噪比:用鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)校准品进行定标后,测试2次校准品零浓度(0.0ng/mL)和接近检测下限的校准品浓度(0.1ng/mL)光子值RLU,计算RLU均值、变异系数CV和低端信噪比,低端信噪比是检测下限校准品浓度RLU与零浓度校准品RLU的比例;精密度用变异系数CV来表征,CV<5%满足要求。
(2)线性检测:将高值样本用低值样本梯度稀释,要求在[0.1ng/mL,70.0ng/mL]线性范围内,样本浓度值≤1ng/mL时,绝对偏差<±0.2ng/mL;样本浓度值>1ng/mL时,相对偏差<±10%。
(3)灵敏度:重复测试20次SCC零浓度校准品(0.0ng/mL)的RLU值,计算平均值M和标准偏差SD,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度进行两点回归,拟合出一次方程,将M+2SD的RLU值带入方程定标得出对应浓度为最低检测限浓度。
(4)准确度:将已知浓度的SCC样本添加到低中高浓度样本中,计算平均回收率,回收率在[85%,105%]范围内。
(5)样本相关性:测试100例不同浓度且覆盖线性范围的样本,且与罗氏化学发光浓度值进行比较,样本相关性R2>0.975,斜率K在[0.95,1.05]范围内。
(6)热稳定性:磁珠稀释液的液体和R试剂都分别放置于2-8℃冰箱7d和37℃恒温箱7d,取出后于在室温条件下平衡2h,测试SCC低中高浓度校准品信号值,要求与2-8℃保存的信号值平均相对偏差<±10%。
2、实验结果
(1)低端信噪比
表3低端信噪比结果
由表3可以看出:
1、实施例7-20的CV均小于<5%,且低端信噪比高于对比例7-18。
2、实施例7-11的低端信噪比和精密度均优于对比例7,这说明前期筛选背景信号值较低的ADA,ACES,MOPSO,BES和DIPSO缓冲体系,更优选DIPSO缓冲体系,有助于提高试剂盒的低端信噪比、灵敏度和精密度。
4、对比例8-13在对比例1的基础上,其磁珠分别选用了对比例1-6,导致其低端信噪比和精密度进一步劣于对比例1,远不如实施例7-11,这说明通过本发明提供的低聚半乳糖修饰的磁珠,能够提高磁珠的性能,对于其非特异性吸附具有降低作用,从而降低背景噪音。
5、实施例12-18在实施例11的基础对表面活性剂进行了筛选,在磁珠稀释液的液体缓冲液选择合适的缓冲体系,并改变其表面活性剂的种类,如选用Tetronic 1307、胆酸钠、Emulgen A60、Emulgen B66、EmpigenBB detergent或Emulgen 430,更优选EmulgenA60,能够进一步提高试剂盒的低端信噪比、灵敏度和精密度。而且,改变M试剂中表面活性剂Emulgen A60的浓度,用鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)校准品进行定标后,测试2次校准品零浓度(0.0ng/mL)和接近检测下限的校准品浓度(0.1ng/mL)光子值RLU,计算均值M、精密度CV和低端信噪比,结果显示,实施例14和实施例134的CV均<5%,且低端信噪比均>10,相差不大,即表面活性剂Emulgen A60浓度在1%和5%时能改善本底和信号值,更优选表面活性剂浓度为1g/L的实施例14,效果达到最佳。
(2)线性、灵敏度、准确度和热稳定性
表4
表4中,在[0.1ng/mL,70.0ng/mL]线性范围内,绝对偏差为:样本浓度值≤1.0ng/mL时,测值的绝对偏差;相对偏差为样本浓度值>1.0ng/mL时,测值相对偏差为百分比,依次来表征其线性度。表4还列出了的各实施例的最低检测限度、回收率和信号值相对偏差(37℃恒温箱7d),并通过图1来印证了实施例14的样本相关性。
由表4可知,实施例7-20的绝对偏差、相对偏差、最低检测限度和回收率均优于对比例。而且本发明提供的鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫试剂盒在磁珠稀释液中缓冲体系和表面活性剂的选用与表3表现出相同的趋势,使用本发明提供的低聚半乳糖修饰的磁珠能够获得更小的偏差、更低的检测限度和更高的准确度,更优的热稳定性。
综上所述,通过使用本发明所限定的缓冲体系和表面活性剂配制磁珠缓冲液,可降低鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)检测试剂盒的背景信号,提高低端信噪比,从而提高鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)检测试剂盒的灵敏度和精密度,且试剂盒其他性能满足临床要求。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测鳞状上皮细胞癌抗原的化学发光试剂盒,其特征在于,包括包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体的磁珠、磁珠稀释液、酶标抗体溶液和化学发光底物液;
所述磁珠稀释液包含以下浓度组分:
缓冲体系75~125mmol/L,
表面活性剂10~20g/L,
海藻糖30~35g/L,
丙氨酸10~15g/L,
Proclin 300 0.5~1g/L;
所述磁珠稀释液的pH值为7.0±0.05。
2.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述缓冲体系选自N-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸,N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸,3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸,N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸或3-[N,N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述包被抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体磁珠为经过低聚半乳糖修饰的磁珠通过偶联抗鳞状上皮细胞癌抗原的抗体a得到。
4.根据权利要求3所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述低聚半乳糖修饰的磁珠的制备步骤包括:将分散相分散于连续相中,通过采用膜乳化法进行乳化,再加入磁珠进行交联,即可得到低聚半乳糖修饰的磁珠;其中,
分散相为低聚半乳糖的溶液,其中包含2%v/v的醋酸;
连续相包含液体石蜡58~60份、石油醚35~38份和乳化剂3~5份。
5.根据权利要求4所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述乳化剂为乳化矿物油。
6.根据权利要求4所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述交联剂为按照氨基醛基摩尔比为2:1加入戊二醛饱和的甲苯溶液,交联结束后,调节pH为9~10。
7.根据权利要求4所述的化学发光试剂盒,其特征在于,交联结束后得到的磁珠依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮和超纯洗涤,并用硼氢化钠还原后再水洗至中性。
8.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂选自Tetronic1307、胆酸钠、Emulgen A60、Emulgen B66、EmpigenBB detergent和Emulgen 430中的一种。
9.根据权利要求1-8任一项所述的化学发光试剂盒,其特征在于,还包括校准品和质控品。
10.根据权利要求9所述的化学发光试剂盒,其特征在于,所述校准品和质控品的配制均采用校准稀释液稀释鳞状上皮细胞抗原进行配制;所述校准稀释液包含100mmol/L PB,0.09g/L NaCl,5g/L Tween 80,5g/L海藻糖,3g/L BSA,2g/L Proclin 300;所述校准稀释液pH值为7.5±0.05。
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