CN107356768A - 一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂，包括缓冲液、合成磷脂、重组兔组织因子、表面活性剂及稳定剂，所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇组成。本发明利用兔重组因子以及合成磷脂，通过对合成磷脂组分的选择，稳定剂的优化，制备凝血酶原时间检测试剂，使用时无须复溶，开瓶即用。该试剂克服了现有凝血酶原时间检测试剂的批间差难以控制的问题，灵敏度高，稳定性好，批间差小，质量容易控制，易于生产。

Description

一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂及制备方法。

背景技术

血凝系统是由多个因子来参与调控的，血凝系统的激活主要分为内源性途径和外源性途径。组织因子参与外源性途径的激活。组织因子(TF)是一种膜蛋白，当血管受损时，TF释放出来，与因子VIIa形成VIIa/TF复合物，VIIa/TF复合物激活FX因子变成有活性的FXa，FXa激活FII因子变成有活性的FIIa(凝血酶),凝血酶分解纤维蛋白原变成纤维蛋白，最终形成血块。凝血因子的减少或缺失可引起血凝系统疾病，如出血，血栓等疾病。引起凝血因子的减少或缺失的原因很多，有先天遗传的因素和后天获得的因素造成。在临床实践过程中，经常需要对患者的凝血系统功能进行监测，例如：手术，抗凝及溶栓治疗。凝血功能的检测对于临床各科的疾病诊断具有很大的意义。凝血酶原时间(PT)是检查外源性途径凝血因子是否异常的一个筛选试验，主要监测凝血因子I、II、V、VII、X的水平。PT仍然是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，是目前口服抗凝剂治疗的主要监测手段，也是外科手术前病人凝血功能的一项重要检査指标。

凝血酶原时间(PT)检测试剂的主要成分是由组织因子和磷脂。组织因子主要是从兔脑组织提取(如上海太阳公司的PT试剂)和人胎盘提取(如Dade Behring公司的PT试剂)。从兔脑提取的组织因子实际上是组织因子和磷脂的复合物，已经含有磷脂，不需要加入磷脂直接可以用来制备PT试剂。现在大部分的PT试剂都使用从兔脑组织提取组织因子和磷脂来制备。由于兔脑组织中的组织因子和磷脂含量受诸多因素的影响，比如兔的年龄，性别，成长的季节，饮食等均对组织因子的含量以及磷脂的成分和含量有很大的影响。不同的磷脂成分，不同磷脂成分的不同含量，组织因子和磷脂之间的不同比例对PT试剂的检测效果具有很大的影响。使用不同批次的兔脑粉提取组织因子和磷脂，所得的组织因子和磷脂含量差异很大。即使利用同一批次的兔脑粉，利用不同的提取方法，所得的组织因子和磷脂含量也产生很大差异。因此利用兔脑粉来制备的PT检测试剂批间差很难控制。这也是不同公司的PT试剂的临床检测结果不能通用的原因。每个公司的PT试剂的生产工艺不同，所用的兔脑粉来源以及组织因子和磷脂的提取方法不同，不同公司生产的PT试剂对同一个样品测定的结果是不一样的。中国专利CN1952169B公开了一种临床检验凝血酶原时间(PT)测定体外诊断试剂盒，是由组织因子，磷脂和缓冲液体系组成。该发明利用兔脑粉提取组织因子和磷脂制备PT试剂，该试剂为冻干粉试剂，灵敏度不高，批间差难以控制。为了解决批间差的问题，现有技术中利用重组因子取代天然的组织因子，解决了在从天然组织中提取组织因子和磷脂时，所得的组织因子含量不同的问题。中国专利CN101294163B利用基因工程的方法在酵母中表达制备人重组组织因子，再将组织因子和从SIGMA购买的从黄豆中提取的磷脂复合物混合重新脂化，将组织因子嵌合到脂质体的磷脂双分子层表面制备脂化的组织因子。利用脂化的组织因子制备PT试剂。尽管该试剂是液体试剂，解决了组织因子浓度不同引起的批间差问题，但由于天然来源的磷脂混合物组分不明确，而且磷脂组分的组成以及各组分的含量在不同的批次差异很大，因此还没有解决由于天然磷脂内在的不可避免的缺陷引起的批间差问题，而且利用人重组因子制备PT试剂特异性不是很高。中国专利CN102565427A公开了一种利用重组牛或羊的组织因子以及合成磷脂制备PT试剂的方法，将基因工程的方法制备纯度在90％以上的牛或羊组织因子的溶液加入含有磷脂和表面活性剂的磷酸缓冲液中，得到磷脂/组织因子溶液后加入烷基键合硅胶，离心分离，滤除沉淀，取上清液冻干，即得所述的凝血酶原时间测定试剂。该发明在制备过程中利用Triton-X-100溶解磷脂，由于少量的Triton-X-100对PT的检测有很大的影响，因此需要将Triton-X-100去除干净。该技术方案中无法仅通过透析去除Triton-X-100，需要使用烷基键合硅胶对磷脂/组织因子溶液进行纯化，制备步骤繁杂，并且增加了生产成本。此外，由于液体中磷脂/组织因子溶液的稳定性较差，该方法对溶液进行了冻干处理。冻干粉制剂虽然具有稳定性好，保质期长，便于运输等优点，但冻干粉试剂需要冷冻干燥工序，生产起来比较复杂，而且在使用时需要复溶。冰冻干燥首先将试剂分装到各小瓶的试剂瓶里，然后再将装有试剂的瓶子放到冰冻干燥机进行冰冻干燥。由于在分装时会产生差异，且冰冻干燥过程中，各瓶冰冻干燥效果的差异，以及复溶过程中，加复溶剂量的不同引起的浓度差异，所有这些差异使得冻干粉制剂瓶间差，批间差变化很大。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种稳定的液体即用型凝血酶原时间检测试剂及制备方法。

本发明具体技术方案如下：

一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂，包括缓冲液、合成磷脂脂化的重组兔组织因子及稳定剂，所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇组成。优选的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比2：7：1。

优选的，所述稳定剂由BSA、PEG6000、羟基茴香醚、丙氨酸、海藻糖组成。进一步优选所述BSA、PEG6000、羟基茴香醚、丙氨酸和海藻糖质量比为1：1：0.02：5：5。

上述缓冲液选自Tris缓冲液，PBS缓冲液或HEPES缓冲液。优选HEPES缓冲液。

进一步的，本发明所述溶剂包含防腐剂。优选为叠氮钠或者Proclin300，优选工作浓度为0.02-0.5％。本发明中使用的浓度单位％，若无特别说明，均为质量体积百分比。

本发明的一个优选的方案，所述检测溶剂包括20mM HEPES缓冲液,200mM氯化钠，5％丙氨酸，5％海藻糖，1％BSA，1％PEG6000，0.02％羟基茴香醚，0.05％叠氮钠，250μg/ml磷脂，1μg/ml的重组兔组织因子。

本发明的另一目的在于提供一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂的制备方法，将磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇按2：7：1的质量比溶于表面活性剂(优选正辛基吡喃葡萄糖苷)溶液中，使磷脂的终浓度为25mg/ml，完全溶解后加入100μg/ml的重组兔组织因子，搅拌均匀，随后透析去除表面活性剂，将所得到的脂化重组兔组织因子溶液用含有稳定剂的Hepes缓冲液稀释，制成液体即用型凝血酶原时间检测试剂含有250μg/ml合成磷脂，1μg/ml的重组兔组织因子。

优选的，所述表面活性剂为正辛基吡喃葡萄糖苷。

本发明优点：

本发明利用兔重组因子以及合成磷脂，通过对合成磷脂组分的选择，稳定剂的优化，制备液体凝血酶原时间检测试剂，克服冻干粉试剂冻干干燥过程或复溶过程带来的瓶间差和批间差大的缺陷，可保证所有成份构成均一的悬浮溶液，灌装时不会使成份或浓度发生变化，不存在瓶间或批内差问题。本发明所述试剂使用时无须复溶，开瓶即用。该试剂克服了现有制备PT试剂的批间差难以控制的问题，灵敏度高，稳定性好，批间差小，质量容易控制，易于生产。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1凝血酶原时间检测试剂的制备

(1)组织因子的脂化

分别称取一适量的合成磷脂：磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，胆固醇，按不同的比例溶于表面活性剂OGP溶液中(占合成磷脂的质量百分比)具体见表1，磷脂的终浓度为25mg/ml,混匀直至合成磷脂完全溶解，加入100μg/ml的重组兔组织因子，在室温搅拌孵育2小时，将溶液转移到透析袋中，每隔4小时换透析液，透析过夜，去除表面活性剂OGP。将所得到的脂化重组兔组织因子溶液用Hepes缓冲液稀释，制成PT试剂含有250μg/ml合成磷脂，1μg/ml的重组兔组织因子。

表1不同的磷脂组成

将所得的PT试剂测定正常血浆的凝血时间所得结果如表2所示，结果显示用磷脂1制备的PT试剂测定的结果在正常范围。

表2不同的磷脂组成的凝血时间

(2)稳定剂的筛选

按照(1)的方法制备磷脂1脂化的组织因子溶液，分别加入不同稳定剂及叠氮钠(终浓度为0.05％)制备凝血酶原时间检测试剂(如表3所示)。

表3稳定剂的不同组成

将所配制的凝血酶原时间检测试剂分别放置于4℃，37℃孵育，7天后取样对正常血样进行测试，测试结果如表4所示。

表4稳定剂筛选结果

结果显示含有稳定剂5的PT试剂最为稳定。

实施例2稳定性的测定

按照实施例1的方法利用磷脂1和稳定剂5配制PT检测试剂。PT检测试剂包含20mM，HEPES缓冲液,200mM氯化钠，5％丙氨酸，5％海藻糖，1％BSA，1％PEG6000，0.02％羟基茴香醚，0.05％叠氮钠，250μg/ml合成磷脂，1μg/ml重组兔组织因子。将PT检测试剂分别放置于4℃，37℃孵育，每隔7天取样，分别对正常质控血浆和病理质控血浆进行PT测试，所用血凝仪CA1500。结果如表5所示。结果表明37℃放置28天，PT检测的结果，无论是正常血样还是病理血样和0天时的结果变化不大，对4℃放置28天的检测的结果变化也不大，表明PT试剂稳定性非常好。

表5稳定性试验

实施例3批间差的测定

连续配制3批凝血酶原时间检测试剂样品，然后对质控品进行同时测试，结果显示，各批之间，批间差很小(CV<5％)(如表6所示)。

表6批间差

批次	正常质控1(秒)	病理质控水平2(秒)	病理质控水平3(秒)
				1	12.3	20.6	50.1
2	12.1	20.0	49.8
				3	12.4	20.8	50.2

Claims (10)

1.一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂，其特征在于包括缓冲液、合成磷脂、重组兔组织因子及稳定剂，所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇组成。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比2：7：1。

3.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述稳定剂由BSA、PEG6000、羟基茴香醚、丙氨酸、海藻糖组成。

4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于所述BSA、PEG6000、羟基茴香醚、丙氨酸和海藻糖质量比为1：1：0.02：5：5。

5.如权利要求1所述的试剂，其特征在于所述缓冲液选自Tris 缓冲液，PBS 缓冲液或HEPES 缓冲液。

6.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述溶剂包含防腐剂。

7.如权利要求6所述的检测试剂，其特征在于所述防腐剂为叠氮钠。

8.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述检测溶剂包括pH7.35的20mM HEPES缓冲液，200mM氯化钠，5%丙氨酸，5%海藻糖，1% BSA， 1% PEG6000， 0.02%羟基茴香醚，0.05%叠氮钠，250µg/ml合成磷脂，1µg/ml的重组兔组织因子。

9.一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂的制备方法，其特征在于将合成磷脂：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇按2：7：1的质量比溶于表面活性剂溶液中，使合成磷脂的终浓度为25mg/ml，完全溶解后加入100µg/ml的重组兔组织因子，搅拌均匀，随后透析去除表面活性剂，将所得到的脂化重组兔组织因子溶液用含有稳定剂的Hepes缓冲液稀释，制成液体即用型凝血酶原时间检测试剂含有250µg/ml合成磷脂，1µg/ml的重组兔组织因子。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述表面活性剂为正辛基吡喃葡萄糖苷。