CN108279313B - 快速检测血液粘弹性的试剂及测试杯 - Google Patents

快速检测血液粘弹性的试剂及测试杯 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测血液粘弹性的试剂及测试杯，所述试剂包括溶剂水，以及2‑8g/L的缓冲剂，0.1‑1g/L的NaOH，0.1‑0.5g/L的没食子酸丙酯和10‑30g/L的CaCl2，pH为6.0‑9.0。上述试剂使用没食子酸丙酯作为激活剂，能够激活血小板膜磷酯酰丝氨酸(PF3，凝血催化表面)内外膜翻转，同时能激活内源性凝血系统，在钙离子的存在下启动凝血过程。同时没食子酸丙酯经处理后能溶于水，因此能充分保证反应时混合均匀，且没食子酸丙酯不受抑肽酶影响。

Description

快速检测血液粘弹性的试剂及测试杯
技术领域
本发明涉及检验技术领域，特别是涉及一种快速检测血液粘弹性的试剂及测试杯。
背景技术
血栓弹力图仪(TEG)能提供由凝血启动到血小板联结形成、纤维蛋白丝形成、血块生长、最大血块形成、血块降解至溶解的全部信息，是一种以细胞学为基础的新型凝血检测模式。TEG现已成为围术期监测凝血功能的重要指标，逐渐广泛应用于肝移植、心脏外科等领域，并指导术中输血、用药、诊断、溶栓及抗凝等治疗，评估深静脉血栓形成风险。
血栓弹力图仪主要用于检测血凝块的物理特性，即第一块血凝块形成的时间、血凝块形成的动力学特性、血凝块的强度以及血凝块的溶解，而这些物理特性将决定病人是否具有正常的凝血功能，是否会出血或形成血栓。
血栓弹力图仪的主要检测原理是将测试杯的杯体固定在恒温控制板中，恒温控制板模拟人体温度恒定在37℃。测试杯的杯盖则通过探针连接着垂悬丝，垂悬丝上端装有一传感器来检测垂悬丝扭矩力的变化。恒温控制板将模拟人的静脉血液流速带动测试杯的杯体运动，即以4°45′的角度旋转，每一次转动持续10s。当血液开始凝固时，杯体和杯盖之间会逐渐形成纤维蛋白-血小板复合物，该复合物会将杯体和杯盖粘在一起，因此杯盖会受到凝块的切应力的作用，跟随着测试杯左右旋动，杯盖在旋转过程中带动垂悬丝，传感器记录垂悬丝的运动并转换成电子信号，形成TEG曲线。
TEG曲线的主要测试参数为：
R(min)：是指血样开始运作至第一块可检测得到的血凝块(TEG扫描图上幅度＝2mm)形成所需的时间。大多数传统的凝血检测方法的检测行为到此为止。R时间因抗凝剂及凝血因子缺乏而延长，因血液呈高凝状态而缩短。
K(min)：血凝块的形成时间，是指第一块可以检测得到的血凝块形成开始至血凝块硬度达到某一固定水平(振幅＝20mm)的时间。因此，K时间用来评估血凝块强度达到某一水平的速度或动力学特性。K时间的缩短受增加的纤维蛋白原水平的影响，而受到血小板功能的影响则较小。
Angle角(deg)：血凝块逐渐形成的动力学特性，a与K时间密切相关，因为两者都是血凝块聚合速度函数。
在血液处于低凝状态时，血凝块的最终状况是振幅达不到20mm(此时K无法确定)。因此，a比K时间更全面。与K时间相似，a角在增加的纤维蛋白原水平的影响下角度较大，而受血小板功能的影响则较小。
最大振幅MA(mm)：最大振幅，用来评估已形成的血凝块的最大强度或硬度(最大切应系数)，影响血凝块强度的因素有两个，即纤维蛋白和血小板，其中血小板作用要比纤维蛋白大。
目前的血栓弹力图普通杯均采用双试剂进行检测，且试剂需放至2～8℃保存，使用前试剂需要进行复温。使用高岭土作为激活剂，需预先加入1mL血样与高岭土进行预混激活，即将血样加到试剂管中上下摇匀，然后在测试杯中加入20uL 0.2M CaCl2，最后将340uL激活的血样加入测试杯中进行检测。检测试剂为双试剂，加样过程繁琐，导致测试的CV均在10％甚至更大，同时人为操作对实验结果的影响较大。测试需要预先加入1mL血样进行混合，需血量较大。血栓弹力图普通杯采用高岭土作为激活剂，试剂与血样激活后可能存在沉降的现象，且高岭土属于固体，在与血液预混时可能存在不均匀的现象，导致凝集反应的重复性较差。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种快速检测血液粘弹性的单试剂。
具体的技术方案如下：
一种快速检测血液粘弹性的试剂，包括溶剂水，以及2-8g/L的缓冲剂，0.1-1g/L的NaOH，0.1-0.5g/L的没食子酸丙酯和10-30g/L的CaCl2，pH为6.0-9.0。
在其中一些实施例中，所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)或4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述缓冲剂为3-吗啉丙磺酸。
在其中一些实施例中，快速检测血液粘弹性的试剂包括溶剂水，以及2-8g/L的3-吗啉丙磺酸，0.1-1g/L的NaOH，0.1-0.5g/L的没食子酸丙酯和18-24g/L的CaCl2，pH为6.8-7.2。
在其中一些实施例中，还包括0.01-1g/L的扩散剂和1.51-15.04g/L的保护剂。
在其中一些实施例中，所述扩散剂选自曲拉通100(Tx-100)、聚乙二醇4000或聚氧乙烯月桂醚中的一种或几种；所述保护剂包括海藻糖、甘氨酸、丁基羟基茴香醚(BHA)以及叠氮化钠。
在其中一些实施例中，所述扩散剂为0.01-0.1g/L的曲拉通100；所述保护剂包括0.5-5g/L的海藻糖、1-10g/L的甘氨酸、0.005-0.02g/L的丁基羟基茴香醚以及0.005-0.02g/L的叠氮化钠。
本发明的另一目的是提供一种快速检测血液粘弹性的测试杯。
一种快速检测血液粘弹性的测试杯，包括测试杯本体，以及形成于所述测试杯本体的杯底的试剂薄膜；所述试剂薄膜由上述试剂干燥而成。
在其中一些实施例中，所述试剂薄膜的形成方法：取1-20μL权利要求1-7任一项所述的试剂点胶于所述测试杯本体的杯底，于45-55℃下加热20-40min，即得。
上述快速检测血液粘弹性的试剂使用没食子酸丙酯替代高岭土作为激活剂，没食子酸丙酯能够激活血小板膜磷酯酰丝氨酸(PF3，凝血催化表面)内外膜翻转，同时能激活内源性凝血系统，在钙离子的存在下启动凝血过程，与高岭土有着相同的作用。同时没食子酸丙酯经处理后能溶于水，因此能充分保证反应时混合均匀，且没食子酸丙酯不受抑肽酶影响。
上述快速检测血液粘弹性的测试杯将上述试剂直接干燥于测试杯底部后，可直接置于室温下保存，提高了试剂的稳定性，还能省去了使用前将试剂复温至室温的步骤，用户只需直接加血样即可检测。简化操作步骤，避免了人为因素造成的测试误差，提高了测试的重复性，同时减少了测试的用血量。
附图说明
图1为静脉血凝集曲线反应时间(R)的相对偏差分布图；
图2为静脉血凝集曲线中K时间的相对偏差分布图；
图3为静脉血凝集曲线中Angle角的相对偏差分布图；
图4为静脉血凝集曲线最大幅度(MA)的相对偏差分布图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例实施了一种快速检测血液粘弹性的试剂，按如下方法配制：
向1000mL的缓冲液(2g MOPS)中加入0.1g NaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.1g没食子酸丙酯，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀。然后加入10g无水CaCl2，0.01gTx-100，0.5g海藻糖，1g甘氨酸，0.005g BHA以及0.005g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至6.0。
然后移取1uL的试剂点胶于测试杯底部，将分装好的测试杯置于50℃烘箱30min进行烘干。将烘好的测试杯取出即为能准确、快速检测全血粘弹性的测试杯。
实施例2
本实施例实施了一种快速检测血液粘弹性的试剂，按如下方法配制：
向1000mL的缓冲液(4g MOPS)中加入0.5g NaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.2g没食子酸丙酯，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀。然后加入20g无水CaCl2，0.08gTx-100，2.5g海藻糖，5g甘氨酸，0.01g BHA以及0.01g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至7.0。
然后移取5uL的试剂点胶于测试杯底部，将分装好的测试杯置于50℃烘箱30min进行烘干。将烘好的测试杯取出即为能准确、快速检测全血粘弹性的测试杯。
实施例3
本实施例实施了一种快速检测血液粘弹性的试剂，按如下方法配制：
向1000mL的缓冲液(8g MOPS)中加入1g NaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.5g没食子酸丙酯，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀。然后加入30g无水CaCl2，0.1g Tx-100，5g海藻糖，10g甘氨酸，0.02g BHA以及0.02g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至9.0。
然后移取20uL的试剂点胶于测试杯底部，将分装好的测试杯置于50℃烘箱30min进行烘干。将烘好的测试杯取出即为能准确、快速检测全血粘弹性的测试杯。
测试时使用从Heamoscope购买的质控血浆，参考范围如下表所示：
R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
Level I 0～3 0～2 77～89 44～61
Level II 3～6 2～4 50～70 20～40
将质控血浆按照说明书进行复溶，然后取360uL复溶后血浆加入实施例1-实施例3所述的测试杯中进行检测，每个实施例测试6次，检测结果如表1所示。
由表1可知，实施例2的CV值均在5％以内，重复性较好，同时均值也在靶值范围内，而实施例1和3的CV值有超过5％，因此实施例2为最佳实施例。
表1
Figure BDA0001535401240000051
Figure BDA0001535401240000061
实施例4：与对比例1的重复性的比较
向1000mL的缓冲液(4g MOPS)中加入0.5gNaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.2g没食子酸丙酯，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀。然后加入20g无水CaCl2，0.08gTx-100，2.5g海藻糖，5g甘氨酸，0.01g BHA以及0.01g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至7.0。
然后移取5uL的试剂于测试杯底部，将分装好的测试杯置于50℃烘箱30min进行烘干。将烘好的测试杯取出即为能准确、快速检测全血粘弹性的测试杯。
对比例1
向1000mL的缓冲液(4g MOPS)中加入0.5gNaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.2g高岭土，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀，再加入0.08g Tx-100，2.5g海藻糖，5g甘氨酸，0.01g BHA以及0.01g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至7.0。
使用柠檬酸钠的抗凝管采集2人血样，每人采血20mL，其中一位是未发生凝血问题的健康人，一位是近期使用肝素治疗的病人，检测仪器为TEG-5000(Heamoscope公司)。
对比例1需预先加入1mL血样进行预混激活，然后在测试杯中加入20uL0.2MCaCl2，最后将340uL激活的血样加入测试杯中进行检测,每份血样测试10次。
本发明所述测试杯进行测试时，直接将340uL血样加入测试杯中进行检测即可，每份血样测试10次。
表2为健康人血液检测结果，表3为近期使用肝素治疗的病人血液检测结果，本发明所制得的测试杯与对比例1相比，本发明所制得的测试杯CV值远低于对比例1的CV值，说明本发明所制得的测试杯重复性较好。
表2
Figure BDA0001535401240000071
表3
Figure BDA0001535401240000072
Figure BDA0001535401240000081
实施例5：与对比例1准确度比较
向1000mL的缓冲液(4g MOPS)中加入0.5gNaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.2g没食子酸丙酯，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀。然后加入20g无水CaCl2，0.08gTx-100，2.5g海藻糖，5g甘氨酸，0.01g BHA以及0.01g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至7.0。
然后移取5uL的试剂于测试杯底部，将分装好的测试杯置于50℃烘箱30min进行烘干。将烘好的测试杯取出即为能准确、快速检测全血粘弹性的测试杯。
使用柠檬酸钠的抗凝管采集20位临床病人血样，每位采血3mL。检测仪器为TEG-5000(Heamoscope公司)。
本发明直接将340uL血样加入自制的测试杯中进行检测即可,分别对该20位临床病人血液进行测试。
对比例1需预先加入1mL血样进行预混激活，然后在测试杯中加入20uL0.2MCaCl2，最后将340uL激活的血样加入测试杯中进行检测,分别对该20位临床病人血液进行测试。
由于对比例1的CV较差，因此使用的参考值为对比例1测试4次的均值。而采用本发明的试剂只需测试一次。
由图1-图4可知，本实施例5的测试杯与对比例1相比，有着较好的相关性，使用本发明的测试杯，检测数据均在±1.96SD范围内，即检测结果能为临床治疗提供有效的参考。
实施例6：抗抑肽酶干扰实验
向1000mL的缓冲液(4g MOPS)中加入0.5gNaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.2g没食子酸丙酯，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀。然后加入20g无水CaCl2，0.08gTx-100，2.5g海藻糖，5g甘氨酸，0.01g BHA以及0.01g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至7.0。
然后移取5uL的试剂于测试杯底部，将分装好的测试杯置于50℃烘箱30min进行烘干。将烘好的测试杯取出即为能准确、快速检测全血粘弹性的测试杯。
对比例2
向1000mL的缓冲液(4g MOPS)中加入0.5gNaOH，搅拌10min至固体溶解，加入0.2g硅藻土，将混合好的溶液超声20min，使其充分混匀，加入0.08g Tx-100，2.5g海藻糖，5g甘氨酸，0.01g BHA以及0.01g叠氮化钠。继续搅拌30min至固体溶解，调节试剂pH至7.0。
使用柠檬酸钠的抗凝管采集1位志愿者血样20mL。将其平均分成4份，每份5mL，向血中加入不同浓度的抑肽酶，平衡10min后开始检测。检测仪器为TEG-5000(Heamoscope公司)。
对比例1和对比例2分别需预先加入1mL血样进行预混激活，然后在测试杯中加入20uL 0.2M CaCl2，最后将340uL激活的血样加入测试杯中进行检测,每份血样分别测试2次。
本发明所述测试杯进行测试时，直接将340uL血样加入测试杯中进行检测即可，每份血样分别测试2次。
由表4可知，当使用硅藻土(对比例2)做为激活剂时，加入50uM的抑肽酶，R值和K值会升高，而使用高岭土(对比例1)和没食子酸丙酯时(实施例6)，R值和K值与不加抑肽酶时的测值一致，说明高岭土和没食子酸丙酯不受抑肽酶的影响，性能稳定，得到的测试效果更真实可靠。
表4
Figure BDA0001535401240000091
Figure BDA0001535401240000101
实施例7：稳定性实验
按照实施例2制得带有单试剂的测试杯，将测试杯置于50℃进行加速老化2周，定时取样进行测试，在测试过程中所使用的质控血浆(Level I)是同一批次的质控血浆，每个时间点重复测试三次，计算均值、样本的标准偏差以及变异系数，其结果如表5。
由表5可知，根据本发明制得的试剂在50℃条件下加速老化14天后，测试同一样本偏差依然较小，说明本发明所述的试剂有着较好的稳定性，并且能够在常温下进行保存。
表5
Figure BDA0001535401240000102
Figure BDA0001535401240000111
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种快速检测血液粘弹性的试剂，其特征在于，由溶剂水，以及2-8g/L的缓冲剂，0.1-1g/L的NaOH，0.1-0.5g/L的没食子酸丙酯，10-30g/L的CaCl2，0.01-1g/L的扩散剂和1.51-15.04g/L的保护剂组成，pH为6.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的快速检测血液粘弹性的试剂，其特征在于，所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-吗啉丙磺酸或4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的快速检测血液粘弹性的试剂，其特征在于，所述缓冲剂为3-吗啉丙磺酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的快速检测血液粘弹性的试剂，其特征在于，由溶剂水，以及2-8g/L的3-吗啉丙磺酸，0.1-1g/L的NaOH，0.1-0.5g/L的没食子酸丙酯和18-24g/L的CaCl2，0.01-1g/L的扩散剂和1.51-15.04g/L的保护剂组成，pH为6.8-7.2。
5.根据权利要求1-3任一项所述的快速检测血液粘弹性的试剂，其特征在于，所述扩散剂选自曲拉通100、聚乙二醇4000或聚氧乙烯月桂醚中的一种或几种；所述保护剂包括海藻糖、甘氨酸、丁基羟基茴香醚和叠氮化钠。
6.根据权利要求1-3任一项所述的快速检测血液粘弹性的试剂，其特征在于，所述扩散剂为0.01-0.1g/L的曲拉通100；所述保护剂包括0.5-5g/L的海藻糖、1-10g/L的甘氨酸、0.005-0.02g/L的丁基羟基茴香醚以及0.005-0.02g/L的叠氮化钠。
7.一种快速检测血液粘弹性的测试杯，其特征在于，包括测试杯本体，以及形成于所述测试杯本体的杯底的试剂薄膜；所述试剂薄膜由权利要求1-6任一项所述的试剂干燥而成。
8.根据权利要求7所述的测试杯，其特征在于，所述试剂薄膜的形成方法：取1-20μL权利要求1-6任一项所述的试剂点胶于所述测试杯本体的杯底，于45-55℃下加热20-40min，即得。
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