CN104991079A

CN104991079A - 一种凝血试剂用抗氧化剂

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Publication number: CN104991079A
Application number: CN201510420415.9A
Authority: CN
Inventors: 王�华; 胡小伟; 高军; 黄翔宇
Original assignee: Qingdao Gugao Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Gugao Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-07-16
Also published as: CN104991079B; CN105424946A; CN105424946B

Abstract

本发明涉及一种凝血试剂用的抗氧化剂，为丹酚酸或迷迭香酸，所述的丹酚酸包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C。所述凝血试剂包括APTT、PT、TT、FIB、AT-III试剂。所述丹酚酸或迷迭香酸在APTT试剂中的浓度为0.5-15mM；在PT试剂中的浓度为0.05-5mM；在TT试剂中的浓度为0.01-2mM。本发明的丹酚酸或迷迭香酸可以降低原料或工艺过程中有害金属离子、自由基对组织因子或凝血酶的破坏或损伤，显著提高凝血试剂的抗氧化性能。本发明提出的抗氧化剂，可添加到其它如丁基羟基甲苯或丁基羟基茴香醚、抗坏血酸、甘氨酸和蛋氨酸等一般的抗氧化剂中，共同使用时，可以进一步改善凝血试剂的稳定性能。

Description

一种凝血试剂用抗氧化剂

技术领域

本发明涉及止血与血栓检测试剂用的抗氧化剂。

背景技术

凝血测试属于血栓性疾病检查，涉及APTT(活化部分凝血活酶时间)、PT(凝血酶原时间)、TT(凝血酶时间)和FIB(纤维蛋白原)等几种测试试剂。

APTT试剂中含有分布不饱和脂肪酸链的磷脂，其脂肪酸链上的双键易被氧化，形成过氧化物、丙二醛、脂肪酸及溶血卵磷脂。加入抗氧化剂，可减少脂质体发生氧化。

PT试剂中含有组织因子(TF)和磷脂。组织因子是由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，包括细胞膜外、跨膜区和内膜区。TF通过与因子Ⅶ/Ⅶa结合而启动血液凝固级联反应，最终导致凝血酶产生，并催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白。在FIB和TT试剂中，主要组份为凝血酶。它是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，是由在凝血酶原复合物中的非活性凝血酶原在Xa因子(FXa)因子的作用下通过蛋白裂解的方式产生的。当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白。无论是PT试剂中的组织因子，还是TT和FIB试剂中的凝血酶，这类物质易于氧化，即某些特定的氨基酸残基发生反应，导致蛋白质功能与结构上变化，对氧化物的亲和力增强，易于聚合、交联作用而导致其功能失活。

蛋白质类组织中的反应性氧系包括羟基自由基，一般蛋白质和脂质的氧化都是由自由基链式反应引起，涉及去氢、电子传递、加成、断裂和重排、二聚、歧化和取代，与脂肪氧化一样，同样包括起始、传递与终止三个阶段。因此，合适的抗氧化剂的加入，可保持凝血试剂的稳定性。

在制备含抗氧化剂的凝血试剂方面，专利EP942284A2中提出了一种液态重组因子制备PT试剂的方式，提出的抗氧化剂为抗坏血酸。专利US5506146中，提出在APTT试剂中加入氨基酸作为抗氧化剂，而在制备PT试剂的专利US5314695中，也提出加入适量的甘氨酸。同样，在制备FIB和TT试剂中，专利CN101221188A和专利CN101221184A，也提出加入甘氨酸作为FIB与TT试剂的组成部分。近期的专利文献US 8729022B2中，提出加入蛋氨酸作为抗氧化剂。

根据查询的文献资料，凝血试剂中添加的抗氧化剂大概包括3类，一是氨基酸及其衍生物，以甘氨酸为主要表现形式；二是酸性己糖衍生物，包括抗坏血酸；三是包括丁基羟基茴香醚和丁基羟基甲苯在内的其它抗氧化剂。

包括蛋氨酸在内的氨基酸的氧化还原循环，能够维持蛋白质的活性。Levine[1]等(1996)以大肠杆菌的谷氨酸合成酶为研究模型，证明当酶暴露在过氧化氢中后，蛋白质表面的蛋氨酸残基氧化成Met0，而埋在蛋白质空隙里的却完好无损，即使16个蛋氨酸残基中有8个被氧化，酶活性依然没有变化，在高浓度的过氧化氢(160nmol)下，酶活性仅仅下降了15％。但是，包括蛋氨酸在内的含硫氨基酸，本身更容易被氧化而难以保存，因此，增加了生产过程中的难度。

包括抗坏血酸在内的酸性己糖衍生物，可与活性氧反应后形成单脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸。据张京芳[2](2002)的研究，脱氢抗坏血酸又可分解为酒石酸和草酰乙酸，而单脱氢抗坏血酸还原酶又利用NADPH或谷胱甘肽的还原力将单脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸，从而形成抗坏血酸谷胱甘肽循环，消除活性氧。不过，抗坏血酸往往采用与其它物质的合成产物，包括与棕榈酸酯化后的VC衍生物(AP)，才能有较好的抗氧化效果[3]。

丁基羟基茴香醚和丁基羟基甲苯作为抗氧化剂，主要是防止脂质的氧化，对蛋白质类保护有限，另外，毒理学实验表明，这两种物质都具有一定的毒性，尤其是丁基羟基甲苯，因此，它们在使用中受到限制[4]，同时，它与其它抗氧化剂柠檬酸并用时，抗氧化效果才比较理想。

另一方面，酚类作为凝血试剂的添加组份，见于一些专利文献。在专利US5055412中，提出加入苯酚作为APTT试剂的稳定剂，专利US6183979公开的PT试剂中提出添加苯酚。苯酚分子由一个羟基直接连在苯环上构成，有弱酸性。由于苯酚对人体健康和环境都具有破坏性的影响，也不利于安全生产，因此限制了其应用。

在上述研究的基础上，本发明基于抗氧化性的差异和浓度对产物的影响，提出以含有邻苯二酚结构和相对较小分子量的酚酸作为凝血试剂的抗氧化剂。更特别的，选择丹酚酸或迷迭香酸作为不同凝血试剂的抗氧化剂，以提升不同凝血试剂的抗氧化性能。

发明内容

本发明的目的，是在常规凝血试剂的基础上，提出一种高效、无毒的抗氧化剂，它可以防止凝血试剂中磷脂及蛋白质的氧化，消除一般抗氧化剂抗氧化性能的不足的问题，为凝血试剂(包括APTT、PT、TT、FIB、AT-III试剂)带来更好的抗氧化性。

本发明提出的丹酚酸和迷迭香酸属于酚类的一类，按WBSSH的分类，大多数酚类都具有不同程度的抗氧化性，但并不是所有的酚类都可以用于凝血试剂的抗氧化剂。有研究发现，蛋白质可以与酚类相互作用，导致蛋白质沉淀[5][6]，另一方面，Asano等[7][8]认为，含有脯氨酸残基的蛋白质在与酚类类化合物络合时容易产生沉淀，因为脯氨酸残基或其它疏水性氨基酸含量高的蛋白质对酚类的亲和力比较强。因此，并不是所有的酚类都可以用于凝血试剂，尤其是PT、FIB和TT试剂的抗氧化剂。

以FIB和TT试剂为例，它们的主要组成为凝血酶。为了验证酚类对凝血酶活性的影响，本发明将一定浓度的凝血酶与不同类型的酚类混合，采用发光基物浓度的变化，确定不同类型的酚类对凝血酶活性的影响。具体地，用Sonder等人[9]提出的方法，测定发光基物D-Phe-Pip-Arg-pNA的水解程度，以确定人凝血酶的活性，即用96孔酶标仪测定415nm处的吸光度值，每孔中加入发光基物，同时加入与酚类预培养后的人凝血酶。确定各吸光曲线中最大反应值，并根据曲线估算IC50值，即凝血酶酰胺分解活性抑制50％时对应的酚类的浓度。

结果表明，在选择的酚类中，不同的酚类对凝血酶的活性影响不同，添加表儿茶酸和儿茶酸时，导致人凝血酶活性减少50％时对应的添加浓度较高，介于130-150mM之间；添加单宁酸时，即使较低的浓度(1.42mM)，也将使人凝血酶的浓度减少50％。丹酚酸或迷迭香酸对凝血酶活性的影响，受加入浓度的影响，当加入浓度介于0.01-2mM时，基本不影响凝血酶的活性，同时提升试剂稳定效果。同时，黄酮类酚类对人凝血酶具有最大的抑制效果，这与Jedinak[10]和Mozzicafreddo[11]等人的研究结果是吻合的。这一结论，也可以根据Liu[12]、Li[13]和Shi[14]等人从分子对接方面的研究结果得到验证，他们的研究表明，在黄酮结构的B环中，-OH基越多，对凝血酶的抑制就越大；黄酮结构的B环与C环，会分别与凝血酶结构中的S1链袋和S2链袋反应，A环会部分地与凝血酶S3链袋反应，而B环中的3’-羟基与4’-羟基官能团，以及C环上的其它3’-羟基团，都会抑制凝血酶的活性。

本发明在上述实验的基础上，进一步说明，虽然酚类都具有不同程度的抗氧化性，但并非所有的酚类都可以用于凝血试剂的抗氧化剂或稳定剂。

在实验研究的基础上，从抗氧化性相对强弱出发，提出以丹酚酸及迷迭香酸作为凝血试剂的抗氧化剂。

本发明的凝血试剂用抗氧化剂，为酚酸，具体为丹酚酸或迷迭香酸。

所述的丹酚酸，包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C。

本发明所述的丹酚酸或迷迭香酸，含有邻苯二酚结构，邻苯二酚结构具有如下的优势：

1)邻苯二酚结构具有很强的金属离子蛰合能力，从而降低了二价金属离子对氧化反应的催化作用，特别地，在制备凝血试剂的过程中，所用原料中的少量重金属离子，会破坏组织因子或凝血酶的稳定。因此，它起到EDTA钠盐或钾盐及部分氨基酸对金属离子的螯合作用。

2)邻苯二酚结构能够与过氧自由基发生反应，从而终止蛋白质氧化或脂质过氧化链反应，这一点对包括APTT、PT、FIB、TT、ATIII等试剂更为重要。

另一方面，当酚酸的分子量较大时，会含有较多的酚羟基，这样可以增加酚酸与蛋白质之间的反应机率，易于形成酚酸(或酚类)-蛋白质的交联网状结构，导致蛋白质不稳定。因此，本发明在选择酚酸类时，尽量选择分子量较小的含有邻苯二酚结构的酚酸类。同时，结合实验研究，优选丹酚酸和迷迭香酸，丹酚酸包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C，特别地，更优先丹酚酸A，其次为丹酚酸B和迷迭香酸。

本发明优选的丹酚酸A(SAA)是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza bunge的干燥根及根茎中所含的一种水溶性酚酸类化合物，对光和热不稳定，暴露空气易氧化成丹酚酸C和异丹酚酸C，分子式为C₂₆H₂₂O₁₀，相对分子质量为494。紫外吸收光谱的最大吸收波长在288nm处。红外吸收光谱显示含有羟基(3385cm^-1)、羰基(1689cm^-1)和苯环(1601,1519cm^-1)。实验表明，SAA具有较强的抗氧化活性，对超氧阴离子的清除作用强用丹酚酸B[15]。

本发明优选的丹酚酸B，由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸缩合形成，具有两个羧基，分子式为C₃₆H₃₀O₁₆，相对分子量718。田影[16]等人的研究表明，丹酚酸B有很强的清除自由基、还原和抗脂质过氧化能力，对OH、O₂ ^-、DPPH清除作用的IC₅₀分别为0.3371、4.1223、0.0138g/L；对还原能力，丹酚酸B比同质量浓度下抗坏血酸要强，平均是抗坏血酸还原能力的1.3倍；对抑制脂质过氧化能力，丹酚酸B有很强的抗脂质过氧化作用，其IC₅₀为0.2576g/L，同质量浓度下，抑制作用明显强于抗坏血酸。

本发明优选的丹酚酸C，分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量492.44。

本发明优选的迷迭香酸，分子式为C₁₈H₁₆O₈，分子量为360。作为天然抗氧化剂，迷迭香酸具有极强的清除自由基的活性，其抗氧化性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸等。西北轻工业学食品工程系进行的评价试验证明，迷迭香酸抗氧化剂具有比丁基羟基甲苯更强的抗氧化作用[17]。根据邹坤[18]等人的研究，迷迭香酸抗氧化作用机理包括直接与活泼自由基反应，即阻断自由基链的传链过程，从而阻断自由基链式反应；与诱导氧化的过渡金属离子(包括二价铁离子)络合，达到抗氧化效果。

在本发明中，所述丹酚酸或迷迭香酸在APTT试剂中的浓度为0.5-15mM；在PT试剂中的浓度为0.05-5mM；在TT试剂中的浓度为0.01-2mM。

本发明的另一个目的是提供一种采用丹酚酸或迷迭香酸作为抗氧化剂的APTT凝血试剂，由含有0.3％纳米二氧化硅、0.07mM混合磷脂、2mM丹酚酸、0.07％丁基羟基甲苯、0.5％牛血清白蛋白、2.5％甘露醇、2％麦芽糖、3％氯化钠和0.01％叠氮酸钠的HEPES-NaOH缓冲液组成，其中的百分比均为质量体积比，pH为7.4。

本发明的另一个目的是提供一种采用丹酚酸或迷迭香酸作为抗氧化剂的PT凝血试剂，由组织因子及磷脂混合液与SM吸附树脂以体积质量比10:3混合而成，所述的组织因子及磷脂混合液为含有300nM兔脑组织因子、2.5mM混合磷脂、0.1％牛血清白蛋白、5mM丹酚酸、1.5％蛋氨酸、0.01％丁基羟基甲苯、3.5％氯化钠、2.5％甘露醇、2％麦芽糖、0.01％叠氮酸钠和1％Triton X-100的HEPES-NaOH缓冲液，其中的百分比均为质量体积比，pH为7.4。

本发明的另一个目的是提供一种采用丹酚酸或迷迭香酸作为抗氧化剂的TT凝血试剂，由含有25U/ml人凝血酶、2％牛血清白蛋白、1.5mM迷迭香酸、3.5％蛋氨酸、1.5％PEG、3％甘露醇、2.5％麦芽糖和10mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液组成，其中的百分比均为质量体积比，pH为7.4。

本发明所述丹酚酸或迷迭香酸，可以配合其它抗氧化剂共同使用，以进一步提升凝血试剂的抗氧化能力，改善凝血试剂的稳定性能。所述的其它抗氧化剂包括酸类抗氧化剂如抗坏血酸，氨基酸类抗氧化剂如甘氨酸、蛋氨酸，另外如丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯等，这类添加剂的加入量，可按一般凝血试剂中的加入量添加。

由于酚类能够抑制包括丝氨酸蛋白酶在内的许多酶的活性[19]，且酚类和蛋白质能相互作用导致蛋白质沉淀，因此，目前少有将酚类类物质用作凝血试剂稳定剂的报道。而本发明发现，在凝血试剂中加入一种或多种酚类，可显著提升混合液的稳定性。本专利通过抗自由基活性分析，确定了适合的酚类类型为丹酚酸或迷迭香酸；同时，对酚类和凝血酶之间的反应作了分析，并在此基础上，提出了制备各凝血试剂中丹酚酸或迷迭香酸的加入的浓度值。本专利通过对酚类种类及浓度的合理选择，不但不会对凝血试剂的稳定性带来不利影响，反而可显著提升其稳定性，尤其是以凝血酶为成份的TT试剂。另外，申请人还发现，凝血试剂中，在添加了抗坏血酸类抗氧化剂、氨基酸类抗氧化剂、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯或它们的混合物等一般稳定剂的基础上，再添加本发明的酚酸时，效果明显优于一般稳定剂或酚酸单独做稳定剂时的效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明：

实施例1

丹酚酸A对APTT试剂抗氧化性的影响

(1)室温条件下试剂抗氧化性试验

制备APTT试剂：取混合磷脂(20μmol的PS、35μmol的PC和35μmol的PE)，加入到50mL浓度为25mmol/L的HEPES缓冲液中，HEPES缓冲液中含有0.05％的叠氮酸钠、100mM的氯化钠和20mg/L的丁基羟基甲苯，pH为7.4。在该混合液中，加入牛血清白蛋白、40nm的二氧化硅和甘露醇及麦芽糖，将滤液用去离子水补足至体积为1L，使终溶液中各部分组成及含量为：0.07mmol的混合磷脂、3g二氧化硅、0.7g丁基羟基甲苯、25g甘露醇、20g麦芽糖、5g牛血清白蛋白、30g氯化钠和0.1g叠氮酸钠。上述混合液经磁力搅拌器混匀后，用0.22微米滤膜过滤，即为测定APTT试剂。以CA1500全自动血凝仪测定，该APTT试剂对正常人新鲜血浆的测定值为25.3S。

对比试剂：实验表明，APTT试剂中加入丹酚酸或迷迭香酸的浓度介于0.5-15mM时较为理想。在具体实施中，在前述APTT试剂中，加入终浓度为2mM的丹酚酸A。用CA1500血凝仪测定的即时结果仍为25.3s。

将制备的两种APTT试剂，在室温(25℃)条件下保存，每三天定时取样一次，检测两种试剂的APTT值。结果表明，在共计28天的测量期内，APTT值有随时间逐渐变大的趋势。结果见表1。

表1 室温条件下APTT试剂的稳定性检测结果单位：秒

上述结果表明，在28天之内，仅仅采用丁基羟基甲苯作为脂类抗氧化剂的APTT试剂的稳定性较差。丹酚酸A作为抗氧化剂，可明显提升APTT试剂中主要组份磷脂的抗氧化性能。

(2)长期抗氧化性试验

长期抗氧化性试验划分为三组：含有0.07％丁基羟基甲苯的APTT试剂；含有2mM丹酚酸A(替代丁基羟基甲苯)的APTT试剂；含有0.07％丁基羟基甲苯和2mM丹酚酸的APTT试剂。将所得试剂分装，在4℃条件下保存，每个月取出一瓶，连取9个月，检测三种试剂的APTT值。

回归方程：

0.07％丁基羟基甲苯：y＝0.2099x+25.564；CV＝3.1％

2mM丹酚酸A：y＝0.0901x+25.375；CV＝1.4％

0.07％丁基羟基甲苯与2mM丹酚酸A：y＝0.0747x+25.352；CV＝1.2％。

这说明在上述时间段内，不含丹酚酸A的APTT试剂的稳定性相对较差，而含有丹酚酸的APTT试剂的稳定性明显增强，如果丹酚酸A与丁基羟基甲苯共同使用，APTT试剂的稳定性能得到进一步的改善。

实施例2

丹酚酸B对PT试剂抗氧化性的影响

(1)室温条件下试剂抗氧化性试验

制备PT试剂：取混合磷脂(20μmol的PS、35μmol的PC和35μmol的PE)，加入到50mL浓度为25mmol/L的HEPES缓冲液中，HEPES缓冲液中含有0.05％的叠氮酸钠、100mM的氯化钠和20mg/L的丁基羟基甲苯，pH为7.4。将该缓冲液倒入1L烧坏中，加入10g TritonX-100，在25℃下轻轻搅拌90分钟后，获得均匀分散的磷脂溶液。在含有磷脂的上述溶液上加入兔脑组织因子、牛血清白蛋白、蛋氨酸、氯化钠、PEG、甘露醇、麦芽糖和叠氮酸钠，并定容至1L，使终溶液中各组份的含量为：兔脑组织因子300nm、混合磷脂2.5mM、牛血清白蛋白0.1％、丁基羟基甲苯0.01％、蛋氨酸1.5％、氯化钠3.5％、甘露醇2.5％、麦芽糖2％、叠氮酸钠0.01％。根据Smith[21]提出的PT试剂的制备方式，向组织因子与磷脂的上述混合液中，分次加入共计300mg SM吸附树脂，对混合搅拌后得到的浑浊液进行离心分离，得到上清液，即为PT试剂。

用CA1500凝血分析仪分析结果，该制备试剂的PT值为14.6s。

对比试剂：实验表明，PT试剂中酚酸及迷迭香酸的加入量为0.05-5mM较为理想。具体实施中，加入5mM的丹酚酸B，用CA1500血凝仪测定的即时结果为14.5s。

将制备的两种PT试剂，在室温(25℃)条件下保存，每隔3天定时取样一次，检测两种试剂的PT值。结果表明，在共计28天的测量期内，PT值有随时间逐渐变大的趋势。结果如表2所示。

表2 室温条件下PT试剂的稳定性检测结果单位：秒

上述结果表明，在28天之内，仅仅采用丁基羟基甲苯和蛋氨酸作为抗氧化剂的PT试剂的稳定性较差。丹酚酸B作为抗氧化剂，可明显提升PT试剂的抗氧化性能，进而提升试剂的稳定性能。

(2)长期抗氧化性试验

长期抗氧化性试验划分为二组：含有丁基羟基甲苯和蛋氨酸的PT试剂；添加丹酚酸B的PT试剂。将所得试剂分装，在4℃条件下保存，每个月取出一瓶，连取9个月，检测二种试剂的PT值。

回归方程：

0.01％丁基羟基甲苯与1.5％的蛋氨酸：y＝0.094x+14.436；；CV＝3.8％

5mM丹酚酸B和0.01％丁基羟基甲苯与1.5％的蛋氨酸：y＝0.0286x+14.398；CV＝2.4％

这说明在上述时间段内，不含丹酚酸B的PT试剂的稳定性相对较差，而加入丹酚酸B后的PT试剂的稳定性明显增强。

实施例3

迷迭香酸对TT试剂抗氧化性的影响

(1)室温条件下试剂抗氧化性试验

配制Tris浓度50mM(pH7.4)的缓冲液，向该缓冲液中，加入终浓度分别为2％的BSA、0.05％的叠氮酸钠、3.5％的蛋氨酸、1.5％的PEG、3％的甘露醇、2.5％的麦芽糖、10mM的氯化钙，其中除氯化钙外，其余均为质量体积分数。将上述混合液用0.22微米滤膜过滤，在滤液中加入人凝血酶冻干制剂，使终滤液中人凝血酶的浓度为25U/ml，得到TT试剂。经CA1500凝血分析仪测定，该试剂的TT值为15.8s。

对比试剂：研究表明，在含有凝血酶的凝血制剂中，高浓度的丹酚酸及迷迭香酸的加入，不但没有起到抗氧化作用，反而促进了蛋白质降解，随着浓度的降低，它们对凝血酶的降解作用减弱或消失。基于试验研究，本发明丹酚酸及迷迭香酸的加入浓度为0.01-2mM。具体实施中，在前述TT试剂中加入1.5mM的迷迭香酸，用CA1500血凝仪测定的即时结果为15.7s。

将制备的两种TT试剂，在37℃条件下保存，每天定时取样一次，检测两种试剂的TT值。结果表明，在共计5天的测量期内，TT值有随时间逐渐变大的趋势。结果如表3所示。

表3 室温条件下TT试剂的稳定性检测结果单位：秒

上述结果表明，在5天之内，仅仅采用蛋氨酸作为抗氧化剂的TT试剂的稳定性较差。在TT试剂中加入迷迭香酸，可明显提升TT试剂的抗氧化性，进而提升试剂的稳定性能。

(2)长期抗氧化性试验

将前述不含迷迭香酸的TT试剂与含迷迭香酸的TT试剂，分装，在4℃条件下保存，每个月取出一瓶，连取9个月，检测两种试剂的TT值。

回归方程：

3.5％蛋氨酸：y＝0.0352x+15.766；CV＝4.2％

3.5％蛋氨酸与1.5mM的迷迭香酸：y＝0.0187x+15.726；CV＝3.5％

这说明在上述时间段内，由于迷迭香酸的加入，显著提升了TT试剂的抗氧化性能。

本发明重点提到的丹酚酸类及迷迭香酸，具有潜在的生物活性，包括它的抗氧化性能。在含有凝血酶的制剂中加入丹酚酸类及迷迭香酸，可以对凝血酶的活性有一定的抑制，但在适量浓度存在的前提下不会影响凝血机制。Fan HY[20]等人通过动静脉分流模型的研究结果也证明了这一点。因此，合适的酚酸类型及浓度，会提高凝血酶的抗氧化性能，进而提升试剂的长期稳定性。

另外，FIB与AT-III试剂的主要成份为凝血酶，本发明中的丹酚酸或迷迭香酸添加剂，同样适应于这两种试剂的抗氧化性能。

本专利申请的引证文件如下：

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Claims

1.一种凝血试剂用抗氧化剂，其特征在于，为丹酚酸或迷迭香酸。

2.根据权利要求1所述的凝血试剂用抗氧化剂，其特征在于，所述丹酚酸或迷迭香酸在APTT试剂中的浓度为0.5-15mM；在PT试剂中的浓度为0.05-5mM；在TT试剂中的浓度为0.01-2mM。

3.根据权利要求1或2所述的凝血试剂用抗氧化剂，其特征在于，所述丹酚酸包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C。

4.根据权利要求1或2所述的凝血试剂用抗氧化剂，其特征在于，所述凝血试剂包括APTT、PT、TT、FIB、AT-III试剂。

5.根据权利要求1或2所述的凝血试剂用抗氧化剂，其特征在于，将所述丹酚酸或迷迭香酸添加至其它含有丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、抗坏血酸及氨基酸类抗氧化剂的凝血试剂中。

6.根据权利要求5所述的凝血试剂用抗氧化剂，其特征在于，所述氨基酸类抗氧化剂包括甘氨酸和蛋氨酸。

7.一种采用权利要求1或2所述抗氧化剂的APTT凝血试剂，其特征在于，由含有0.3％纳米二氧化硅、0.07mM混合磷脂、2mM丹酚酸、0.07％丁基羟基甲苯、0.5％牛血清白蛋白、2.5％甘露醇、2％麦芽糖、3％氯化钠和0.01％叠氮酸钠的HEPES-NaOH缓冲液组成，其中的百分比均为质量体积比，pH为7.4。

8.一种采用权利要求1或2所述抗氧化剂的PT凝血试剂，其特征在于，由组织因子及磷脂混合液与SM吸附树脂以体积质量比10:3混合而成，所述的组织因子及磷脂混合液为含有300nM兔脑组织因子、2.5mM混合磷脂、0.1％牛血清白蛋白、5mM丹酚酸、1.5％蛋氨酸、0.01％丁基羟基甲苯、3.5％氯化钠、2.5％甘露醇、2％麦芽糖、0.01％叠氮酸钠和1％Triton X-100的HEPES-NaOH缓冲液，其中的百分比均为质量体积比，pH为7.4。

9.一种采用权利要求1或2所述抗氧化剂的TT凝血试剂，其特征在于，由含有25U/ml人凝血酶、2％牛血清白蛋白、1.5mM迷迭香酸、3.5％蛋氨酸、1.5％PEG、3％甘露醇、2.5％麦芽糖和10mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液组成，其中的百分比均为质量体积比，pH为7.4。