CN117904091A - 一种凝血酶稳定剂以及一种凝血酶时间测定试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种凝血酶稳定剂以及一种凝血酶时间测定试剂，属于凝血酶时间测定技术领域。本发明通过采用特定的表面活性剂、蛋白保护剂和抗氧化剂相结合，组成得到了一种凝血酶稳定剂，能够解决现有技术中的液体凝血酶时间测定试剂稳定期较短、干粉试剂使用不方便且瓶间差大的问题。本发明提供的凝血酶稳定剂用于凝血酶时间测定试剂中能够大大提高试剂的稳定性，使其以液体状态保存至少2年。本发明提供的凝血酶时间测定试剂使用方便，避免了干粉试剂复溶引入误差、不同批次品质存在差异的问题，且保质期长，在凝血酶时间测定试剂生产中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及凝血酶时间测定技术领域，尤其涉及一种凝血酶稳定剂以及一种凝血酶时间测定试剂。
背景技术
凝血酶时间(TT)是指在血浆中加入标准化的凝血酶后血液凝固的时间。在共同凝血途径中，所生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，可用凝血酶时时间(TT)来反映。由于纤维蛋白(原)降解产物(FDP)能使TT延长，故也有人将TT作为纤溶系统的筛选试验。
凝血酶时间(TT)是反映的体内抗凝物质，所以它的延长说明纤溶亢进，测定的是加入标准化凝血酶后纤维蛋白的形成时间，所以血浆纤维蛋白原降低或结构异常，DIC以及类肝素物质存在(如肝素治疗，SLE和肝脏疾病等)时出现延长。凝血酶时间缩短见于血液中有钙离子存在，或血液呈酸性等，TT缩短无临床意义。
现有技术中的凝血酶时间测定试剂存在稳定期较短的问题，大部分液体试剂仅能稳定1年甚至更短时间，干粉试剂虽稳定期相对延长，但使用不方便且瓶间差大。
中国专利CN106480007A公开了凝血酶溶液的稳定剂、凝血酶溶液及相关的检测试剂、制备稳定的凝血酶溶液的方法以及凝血酶溶液的稳定剂的用途，主要成分采用了水溶性葡萄糖酸化合物和水溶性谷氨酸化合物。但上述稳定剂仅能在30天内发挥效果，稳定性能有待进一步提升。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝血酶稳定剂以及一种凝血酶时间测定试剂，稳定效果长达24个月。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种凝血酶稳定剂，包括以下重量份数的组分：
表面活性剂0.01～5份、蛋白保护剂0.01～10份、抗氧化剂0.001～1份；
所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、Brij35和BrijL23中的一种或几种；
所述蛋白保护剂选自甘氨酸、海藻糖、蔗糖、D-甘露醇和酪蛋白中的一种或几种；
所述抗氧化剂选自透明质酸、水杨醛肟和维生素C中的一种或几种。
本发明还提供了上述凝血酶稳定剂在制备凝血酶时间测定试剂中的应用。
本发明还提供了一种凝血酶时间测定试剂，以凝血酶时间测定试剂总体积计，包括以下终浓度的组分：
凝血酶5～50IU/mL、盐离子5～100mM、防腐剂0.01～0.3wt％、上述凝血酶稳定剂0.1～20％。
优选的，所述凝血酶为牛凝血酶。
优选的，所述盐离子选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种。
优选的，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin300、盐酸肼、硫柳汞中的一种或几种。
优选的，所述凝血酶时间测定试剂以缓冲液作为溶剂。
优选的，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液中的一种或几种。
优选的，所述缓冲液的pH为6.0～8.5。
优选的，所述缓冲液的总浓度为10～200mM。
本发明的有益效果：
本发明通过采用特定的表面活性剂、蛋白保护剂和抗氧化剂相结合，组成得到了一种凝血酶稳定剂，用于凝血酶时间测定试剂中能够大大提高试剂的稳定性，使其以液体状态保存至少2年。
本发明提供的凝血酶时间测定试剂使用方便，避免了干粉试剂复溶引入误差、不同批次品质存在差异的问题，且保质期长，在凝血酶时间测定试剂生产中具有重要意义。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了一种凝血酶稳定剂，包括以下重量份数的组分：表面活性剂0.01～5份、蛋白保护剂0.01～10份、抗氧化剂0.001～1份。
在本发明中，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、Brij35和BrijL23中的一种或几种，优选为其中的至少两种；本发明所述表面活性剂可以增强试剂的分散，降低酶分子之间的相互作用，与其他组分协同实现提升试剂稳定性的效果。
在本发明中，所述蛋白保护剂选自甘氨酸、海藻糖、蔗糖、D-甘露醇和酪蛋白中的一种或几种，优选为其中的至少两种；本发明所述蛋白保护剂起到保护凝血酶活性的作用，与其他组分协同实现提升试剂稳定性的效果。
在本发明中，所述抗氧化剂选自透明质酸、水杨醛肟和维生素C中的一种或几种，本发明所述抗氧化剂起到去除金属离子和抗氧化的作用，可以更好的提高凝血酶的稳定性，从而提高试剂的稳定性。
本发明还提供了上述凝血酶稳定剂在制备凝血酶时间测定试剂中的应用。
本发明还提供了一种凝血酶时间测定试剂，以凝血酶时间测定试剂总体积计，包括以下终浓度的组分：凝血酶5～50IU/mL、盐离子5～100mM、防腐剂0.01～0.3wt％、上述凝血酶稳定剂0.1～20％；本发明所述凝血酶优选为牛凝血酶；所述盐离子优选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种；所述防腐剂优选自叠氮化钠、ProClin300、盐酸肼、硫柳汞中的一种或几种；所述凝血酶时间测定试剂优选以缓冲液作为溶剂；所述缓冲液优选自Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液中的一种或几种；所述缓冲液的pH优选为6.0～8.5；所述缓冲液的总浓度优选为10～200mM。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
配制凝血酶时间测定试剂：包括凝血酶、缓冲液、盐离子、防腐剂和稳定剂：
凝血酶为牛凝血酶，浓度为20IU/mL；
缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH为8.0，浓度为20mM；
盐离子为氯化钠和氯化钙，浓度分别为50mM和8mM；
防腐剂为叠氮化钠，占缓冲液重量的0.1wt％；
稳定剂包括A组分、B组分和C组分，其中A组分为吐温20、聚乙二醇8000和Brij35，分别占缓冲液重量的0.01wt％、2wt％和0.1wt％；B组分为海藻糖、酪蛋白，分别占缓冲液重量的3wt％和0.5wt％；C组分为透明质酸，占缓冲液重量的0.05wt％。
实施例2
配制凝血酶时间测定试剂：包括凝血酶、缓冲液、盐离子、防腐剂和稳定剂：
凝血酶为牛凝血酶，浓度为8IU/mL。
缓冲液为PIPES缓冲液，pH为6.8，浓度为50mM。
盐离子为氯化钙，浓度为15mM。
防腐剂为ProClin300，占缓冲液重量的0.03wt％。
稳定剂包括A组分、B组分和C组分，其中A组分为曲拉通X-100、聚乙二醇6000和BrijL23，分别占缓冲液重量的0.02wt％、3wt％和1.5wt％；B组分为甘氨酸和D-甘露醇，分别占缓冲液重量的6wt％和1.5wt％；C组分为水杨醛肟，占缓冲液重量的0.002wt％。
实施例3
配制凝血酶时间测定试剂：包括凝血酶、缓冲液、盐离子、防腐剂和稳定剂：
凝血酶为牛凝血酶，浓度为12IU/mL。
缓冲液为PB缓冲液，pH为8.5，浓度为100mM。
盐离子为氯化钾和氯化钙，浓度分别为5mM和12mM。
防腐剂选自ProClin300、盐酸肼，分别占缓冲液重量的0.05wt％和0.01wt％。
稳定剂包括A组分、B组分和C组分，其中A组分为吐温80、聚乙二醇10000和Brij35，分别占缓冲液重量的2wt％、5wt％和0.05wt％；B组分为甘氨酸、蔗糖和酪蛋白，分别占缓冲液重量的2wt％、3wt％和0.1wt％；C组分选自透明质酸和维生素C，分别占缓冲液重量的0.2wt％和1wt％。
对比例1
与实施例2的不同之处仅在于，将其中的A组分替换为油酸钠和十二烷基硫酸钠，分别占缓冲液重量的1.5wt％和1wt％。
对比例2
与实施例2的不同之处仅在于，将其中的A组分的添加量替换为0.005wt％、10wt％和0.005wt％。
对比例3
与实施例2的不同之处仅在于，将其中的B组分替换为山梨醇和葡萄糖，分别占缓冲液重量的2wt％和1.5wt％。
对比例4
与实施例2的不同之处仅在于，将其中的B组分的添加量替换为12wt％和5wt％。
对比例5
与实施例2的不同之处仅在于，将其中的C组分的替换为酒石酸钾钠，占缓冲液重量的1wt％。
实验例
按照实施例1～3、对比例1～5的方法配制得到凝血酶时间测定试剂，生产出的试剂在2-8℃密封保存，每隔3个月取出各1瓶试剂在CA1500全自动血凝仪上测试凝血质控品的凝血酶时间(TT)，连续测试2年，记录测试结果，统计分析2年内的质控测试结果变化趋势是否显著，p≥0.05为不显著，说明稳定性好。
结果如表1所示：
表1凝血酶时间测定试剂稳定性测试结果比对表
由表1可知，本发明试剂在24个月内的稳定性测试结果在一定范围内波动，显著性分析结果p分别为0.289、0.402和0.933，均大于0.05，变化趋势不显著。对比例1-5在12个月内相对较稳定，超出12个月后都在不同时间点后开始呈现明显凝血酶时间延长的情况，显著性分析结果p值分别为0.006、0.007、0002、0.004和0.003，均≤0.05，变化趋势显著。同时本发明对市售试剂进行了稳定性测试以作为对照，结果显示其在12个月内相对较稳定，超出12个月后呈现明显凝血酶时间延长的情况，显著性分析结果p＝0.002≤0.05，变化趋势显著。因此，与对比例和市售试剂相比，本发明提供的试剂具有更好的稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种凝血酶稳定剂，其特征在于，包括以下重量份数的组分：
表面活性剂0.01～5份、蛋白保护剂0.01～10份、抗氧化剂0.001～1份；
所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、Brij35和BrijL23中的一种或几种；
所述蛋白保护剂选自甘氨酸、海藻糖、蔗糖、D-甘露醇和酪蛋白中的一种或几种；
所述抗氧化剂选自透明质酸、水杨醛肟和维生素C中的一种或几种。
2.权利要求1所述的凝血酶稳定剂在制备凝血酶时间测定试剂中的应用。
3.一种凝血酶时间测定试剂，其特征在于，以凝血酶时间测定试剂总体积计，包括以下终浓度的组分：
凝血酶5～50IU/mL、盐离子5～100mM、防腐剂0.01～0.3wt％、权利要求1所述的凝血酶稳定剂0.1～20％。
4.根据权利要求3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述凝血酶为牛凝血酶。
5.根据权利要求3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述盐离子选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种。
6.根据权利要求3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin300、盐酸肼、硫柳汞中的一种或几种。
7.根据权利要求3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述凝血酶时间测定试剂以缓冲液作为溶剂。
8.根据权利要求7所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液中的一种或几种。
9.根据权利要求3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲液的pH为6.0～8.5。
10.根据权利要求3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲液的总浓度为10～200mM。
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