CN109444439A - 一种稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒。所述的试剂盒包括：缓冲液，酶稳定剂，防腐剂，凝血酶；其中所述酶稳定剂包括酪蛋白0.05‑1％(m/v)。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒。
背景技术
凝血测试属于血栓性疾病检查，其中，凝血酶时间为凝血功能检查的一个重要指标，用于检查血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白能力。凝血酶时间测定试剂的核心组份为凝血酶。凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列与结构，含A、B两条多肽链，由一个链间二硫键相连。B链为功能链，具有典型的丝氨酸蛋白水解酶折叠结构，含有1个位于两个β折叠桶之间的活性中心，2个外结合位点(ExositeⅠ、ExositeⅡ)。凝血酶在凝血过程中具有多方面作用：1.主要作用是从纤维蛋白原N端水解掉四段小肽，即两个A肽和两个B肽，转变为纤维蛋白单体，进而交联成纤维蛋白凝块；释放的A肽和B肽能引起血管收缩，减小血管创面。2.激活凝血因子ⅩⅢ，激活的纤维蛋白稳定因子可促使相邻纤维蛋白单体共价交联，使可溶性纤维蛋白变为不可溶的纤维蛋白多聚体，使最初的疏松纤维蛋白软凝块转变为较为紧密的纤维蛋白凝块。3.凝血酶属于强诱导剂，可诱导血小板发生聚集，其诱导的血小板聚集阿司匹林亦不能抑制；同时促使血小板释放出血小板第Ⅲ因子和血小板第Ⅳ因子，这两种因子在凝血过程中具有重要作用。4.凝血酶还可激活因子V和因子Ⅷ，凝血酶能使凝血因子Ⅷ和凝血因子V的活性增强。然而，凝血酶不稳定，其功能团、三维结构以及所发挥的凝血作用，会因为物理和化学条件的变化而变化。
目前市售的凝血酶产品大部分为冻干粉剂，使用前用水溶解，具有诸多不便，而液体型凝血酶试剂可克服复溶过程或冻干过程带来的缺陷，为用户带来使用的便捷，同时也提高了检测结果的准确性和精确性，但是，液体试剂也给研发者带来了诸多挑战性问题：凝血酶属于生物大分子，它的活性依赖于其自身的精细空间结构的维系，在液体状态下，蛋白质或酶的结构比较脆弱，酸、碱、温度、离子强度以及其它某些化合物(包括重价金属离子)的少量存在，都会引起这种空间结构的改变，局部结构的微小变化也会引起蛋白质或酶活性的丧失。因此，需要尽量消除可能促使蛋白质或酶发生自分解的条件。
虽然市场上已经出现了若干型号的液体型试剂，但多数稳定性不好。即使个别产品的热稳定性和长期稳定性能达到一个较高的水平，但是开盖稳定性依旧很差。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的问题，提供一种稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，此试剂盒不仅热稳定性和长期稳定性能好，开盖稳定性也很好。
为达到上述发明目的，本发明包括以下技术方案：一种稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，所述的试剂盒包括：缓冲液，酶稳定剂，防腐剂，凝血酶；其中所述酶稳定剂包括酪蛋白0.05-1％(m/v)。
酪蛋白是一些含磷蛋白的混合物，分子中有较多的脯氨酸残基。酪蛋白中含有的磷酸基团具有较强的富电子性，可以蛰合溶液中不利于凝血酶稳定的金属离子，从而降低了金属离子对凝血酶氧化反应的催化作用；同时，酪蛋白也会与过氧自由基发生反应，终止蛋白质过氧化链反应，从而进一步提升了凝血酶的稳定性。因此，本发明添加酪蛋白，并合理控制它的加入浓度，会很好地提升液态环境中凝血酶的稳定性。
作为优选，所述酶稳定剂还包括牛血清蛋白、甘氨酸、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。
其中上述牛血清蛋白、甘氨酸、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇在试剂盒中的含量分别为0.05-5％(m/v)、0.1-5％(m/v)、0.1-5％(m/v)、1％-10％(m/v)、0.1％-5％(m/v)、0.1％-5％(m/v)、0.1-5％(m/v)、0.1-5％(m/v)。
作为优选，所述酶稳定剂包括酪蛋白和甘氨酸的复配物，其中酪蛋白0.05-1％(m/v)、甘氨酸0.1-5％(m/v)。甘氨酸为亲水性氨基酸，甘氨酸溶于水后，分子填充在酪蛋白的网状结构空隙中，从而提高酪蛋白在水中的溶解性，有利于酪蛋白稳定凝血酶。
作为优选，所述酶稳定剂为酪蛋白、牛血清蛋白、明胶、甘氨酸的复配物，其中酪蛋白0.05-1％(m/v)、牛血清蛋白0.05-5％(m/v)、明胶0.1-5％(m/v)、甘氨酸0.1-5％(m/v)。
凝血酶时间测定试剂盒开盖之后，空气中的氧分子会进入试剂盒，与试剂中的基团反应生成自由基，从而促进凝血酶的氧化反应，不利于凝血酶试剂的稳定，因此现有技术中的凝血酶时间测定试剂盒开盖之后稳定性较差。而本发明使用的酪蛋白稳定剂可以与过氧自由基发生反应，终止蛋白质过氧化链反应，从而提高凝血酶稳定性；复配使用的甘氨酸可以促进酪蛋白的溶解；牛血清蛋白和明胶增强磷酸基团络合金属离子能力，并与凝血酶分子的羟基、羧基等基团反应，增强凝血酶柔性区域的刚性，有利于维持凝血酶构象稳定性。
进一步优选，所述酶稳定剂为酪蛋白0.1-0.5％(m/v)、牛血清蛋白0.1-2％(m/v)、明胶0.5-3％(m/v)、甘氨酸0.5-3％(m/v)。
作为优选，所述缓冲液为tris缓冲液、mops缓冲液、popos缓冲液、hepes缓冲液、pipes缓冲液、磷酸缓冲液、咪唑缓冲液中的一种或多种。
作为优选，所述缓冲液为10-100mmol/L磷酸缓冲液。
作为优选，所的防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种。
作为优选，所述防腐剂为0.5-1g/L叠氮钠。
作为优选，所述凝血酶为人凝血酶、牛凝血酶中的一种或两种。
作为优选，所述凝血酶为2U/mL-20U/mL牛凝血酶。试剂盒中的凝血酶种类和含量影响测定灵敏度和准确性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在凝血酶时间测定试剂盒中添加酪蛋白为稳定剂，有利于试剂盒的长期保存和热稳定性，而酪蛋白与甘氨酸形成的稳定剂为本发明的优先复配组合，两者的复配有利于提高试剂盒的长期稳定性和热稳定性。本发明更是创造性地将酪蛋白、甘氨酸、牛血清蛋白和明胶四种成分复配作为稳定剂，四种成分在含量合理时所产生的相互作用，大幅度提高凝血酶时间测定试剂盒的稳定性，尤其是开盖稳定性，完美解决了开盖不稳定这一技术难题。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
实施例1
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例2
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
tris缓冲液：80mmol/L，酪蛋白：0.1％(m/v)，牛血清蛋白：0.2％(m/v)，明胶：0.5％(m/v)，甘氨酸：0.5％(m/v)，叠氮钠：0.8g/L，牛凝血酶8U/mL，余量为水。
实施例3
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
mops缓冲液：100mmol/L，酪蛋白：0.3％(m/v)，牛血清蛋白：1.0％(m/v)，明胶：1.2％(m/v)，甘氨酸：1.4％(m/v)，叠氮钠：0.9g/L，牛凝血酶10U/mL，余量为水。
实施例4
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.05％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例5
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：4％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例6
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例7
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例8
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例9
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，聚乙二醇：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例10
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，聚乙二醇：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例11
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，人凝血酶5U/mL，余量为水。
实施例12
本实施例的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶25U/mL，余量为水。
对比例1
对比例1的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
对比例2
对比例2的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
对比例3
对比例3的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.01％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
对比例4
对比例4的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：1.5％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：1％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
对比例5
对比例5的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：0.02％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
对比例6
对比例6的凝血酶时间测定试剂盒由以下组分组成：
磷酸缓冲液：50mmol/L，酪蛋白：0.2％(m/v)，牛血清蛋白：0.5％(m/v)，明胶：1％(m/v)，甘氨酸：5.5％(m/v)，叠氮钠：0.5g/L，牛凝血酶5U/mL，余量为水。
对比例7
市场购买的试剂盒(购自上海太阳生物)
将上述实施例1-12以及对比例1-7的凝血酶时间测定试剂盒进行稳定性测试。
1.1 37℃热稳定性测试
将实施例1-12以及对比例1-7的凝血酶时间测定试剂盒置于37℃水浴箱中，每天定时取样一次，在希森美康CS-2000i上测同一批号的西门子质控Ci-Trol 1，连续监测8天。结果如表1所示。
表1 37℃热稳定性测试结果
| 1天 | 2天 | 3天 | 4天 | 5天 | 6天 | 7天 | 8天 | 最大偏移 | |
| 实施例1 | 13.5 | 13.6 | 13.5 | 13.7 | 13.7 | 13.8 | 13.8 | 13.9 | 0.4 |
| 实施例2 | 13.4 | 13.5 | 13.5 | 13.6 | 13.8 | 13.7 | 13.8 | 13.9 | 0.5 |
| 实施例3 | 13.6 | 13.6 | 13.7 | 13.8 | 13.8 | 13.9 | 14.0 | 14.1 | 0.5 |
| 实施例4 | 13.5 | 13.6 | 13.6 | 13.7 | 13.9 | 14.0 | 14.1 | 14.2 | 0.7 |
| 实施例5 | 13.4 | 13.5 | 13.5 | 13.6 | 13.7 | 13.9 | 14.0 | 14.1 | 0.7 |
| 实施例6 | 13.5 | 13.6 | 13.8 | 13.9 | 14.0 | 14.2 | 14.5 | 14.7 | 1.2 |
| 实施例7 | 13.5 | 13.6 | 13.8 | 13.9 | 14.1 | 14.1 | 14.4 | 14.6 | 1.1 |
| 实施例8 | 13.6 | 13.7 | 13.9 | 14.0 | 14.2 | 14.3 | 14.5 | 14.7 | 1.1 |
| 实施例9 | 13.5 | 13.7 | 13.8 | 14.0 | 14.1 | 14.2 | 14.5 | 14.7 | 1.2 |
| 实施例10 | 13.5 | 13.6 | 13.7 | 13.9 | 14.0 | 14.1 | 14.4 | 14.6 | 1.1 |
| 实施例11 | 13.7 | 13.8 | 14.0 | 14.1 | 14.3 | 14.3 | 14.5 | 14.6 | 0.9 |
| 实施例12 | 13.7 | 13.8 | 13.9 | 14.0 | 14.2 | 14.3 | 14.4 | 14.6 | 0.9 |
| 对比例1 | 13.6 | 13.8 | 14.1 | 14.4 | 14.8 | 15.5 | 16.1 | 16.7 | 3.1 |
| 对比例2 | 13.7 | 13.9 | 14.1 | 14.4 | 14.6 | 15.4 | 16.0 | 16.5 | 2.8 |
| 对比例3 | 13.5 | 13.7 | 13.8 | 14.1 | 14.6 | 15.2 | 15.8 | 16.2 | 2.7 |
| 对比例4 | 13.6 | 13.8 | 14.0 | 14.3 | 14.6 | 15.0 | 15.4 | 15.9 | 2.3 |
| 对比例5 | 13.6 | 13.7 | 13.9 | 14.2 | 14.5 | 15.0 | 15.6 | 16.1 | 2.5 |
| 对比例6 | 13.7 | 13.9 | 14.0 | 14.3 | 14.6 | 15.0 | 15.4 | 15.9 | 2.2 |
| 对比例7 | 13.9 | 14.1 | 14.2 | 14.5 | 14.7 | 14.8 | 15.0 | 15.3 | 1.4 |
对比例1-2的试剂盒相对于实施例1，分别缺少必要组分酪蛋白和甘氨酸，而酪蛋白和甘氨酸为本发明试剂盒中维持热稳定性的必要成分，因此对比例1-2的热稳定性显著低于实施例1；而对比例3-6的试剂盒相对于实施例1，必要组分的含量不当，各组分间不能起到良好的协同增效作用，因此对比例3-6的热稳定性显著低于实施例1。
1.2长期稳定性测试
将实施例1-12以及对比例1-7的凝血酶时间测定试剂盒置于冰箱中保存，每个月定时取样一次，在希森美康CS-2000i上测同一批号的西门子质控Ci-Trol 1，连续监测13个月。结果如表2所示。
表2长期稳定性测试结果
对比例1-2的试剂盒相对于实施例1，分别缺少必要组分酪蛋白和甘氨酸，而酪蛋白和甘氨酸为本发明试剂盒中长期稳定性的必要成分，因此对比例1-2的热稳定性显著低于实施例1；而对比例3-6的试剂盒相对于实施例1，必要组分的含量不当，各组分间不能起到良好的协同增效作用，因此对比例3-6的长期显著低于实施例1。
1.3开盖稳定性测试
将实施例1-12以及对比例1-7的凝血酶时间测定试剂盒开盖置于冰箱中，每天定时取样一次，在希森美康CS-2000i上测同一批号的西门子质控Ci-Trol 1，连续监测15天。结果如表3所示。
表3开盖稳定性测试结果
在本发明中，酪蛋白、甘氨酸、牛血清蛋白、明胶成分之间的作用更有利于维持试剂盒开盖稳定性，如表3所示，对比例1的试剂盒中缺少酪蛋白，表现出最差的开盖稳定性，对比例2缺少必要成分甘氨酸，开盖不稳定性次之，实施6-10分别缺少牛血清蛋白和明胶、明胶、牛血清蛋白、明胶，相应地实施例6-10的开盖稳定性也很差。对比例3-6的试剂盒中，四种稳定剂的含量不当，无法发挥相应的相互作用，因而开盖稳定性较差。市场购买的试剂盒虽然表现出较好的热稳定性和长期稳定性，但是其开盖稳定性差。
综上所述，本发明凝血酶时间测定试剂盒中以酪蛋白为稳定剂有利于试剂盒的长期保存和热稳定性，酪蛋白与甘氨酸形成的稳定剂为本发明的优先复配组合，两者的复配有利于提高试剂盒的长期稳定性和热稳定性，但是其形成的试剂盒表现出较差的开盖稳定性；而酪蛋白、甘氨酸、牛血清蛋白、明胶四种成分的相互作用，有利于试剂盒开盖稳定性的提高，当四种稳定剂含量合理时，试剂盒表现出良好的热稳定性、长期稳定性以及开盖稳定性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (10)
1.一种稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：缓冲液，酶稳定剂，防腐剂，凝血酶；其中所述酶稳定剂包括酪蛋白0.05-1％(m/v)。
2.根据权利要求1所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述酶稳定剂还包括牛血清蛋白、甘氨酸、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述酶稳定剂包括酪蛋白和甘氨酸的复配物，其中酪蛋白0.05-1％(m/v)、甘氨酸0.1-5％(m/v)。
4.根据权利要求3所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述酶稳定剂为酪蛋白、牛血清蛋白、明胶、甘氨酸的复配物，其中酪蛋白0.05-1％(m/v)、牛血清蛋白0.05-5％(m/v)、明胶0.1-5％(m/v)、甘氨酸0.1-5％(m/v)。
5.根据权利要求1所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为tris缓冲液、mops缓冲液、popos缓冲液、hepes缓冲液、pipes缓冲液、磷酸缓冲液、咪唑缓冲液中的一种或多种。
6.根据权利要求1或5所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为10-100mmol/L磷酸缓冲液。
7.根据权利要求1所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为0.5-1g/L叠氮钠。
9.根据权利要求1所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述凝血酶为人凝血酶、牛凝血酶中的一种或两种。
10.根据权利要求9所述的稳定的液体型凝血酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述凝血酶为2U/mL-20U/mL牛凝血酶。
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