JP2966968B2 - プラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの測定方法、並びにその測定用キット - Google Patents
プラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの測定方法、並びにその測定用キットInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組織プラスミノーゲン活
性化因子（以下ｔＰＡと略すことがある）及びウロキナ
ーゼプラスミノーゲン活性化因子（以下ｕＰＡと略すこ
とがある）よりなる群から選択されたプラスミノーゲン
活性化因子、及び該プラスミノーゲン活性化因子のイン
ヒビター（以下ＰＡＩと略すことがある）の測定方法に
関し、詳細にはα2-アンチプラスミン（以下α2-APと略
すことがある）とマクログロブリン（以下α2-Mと略す
ことがある）の２つのプラズマプロティンへの阻害を含
むプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターを
測定する方法に関するものである。
性化因子（以下ｔＰＡと略すことがある）及びウロキナ
ーゼプラスミノーゲン活性化因子（以下ｕＰＡと略すこ
とがある）よりなる群から選択されたプラスミノーゲン
活性化因子、及び該プラスミノーゲン活性化因子のイン
ヒビター（以下ＰＡＩと略すことがある）の測定方法に
関し、詳細にはα2-アンチプラスミン（以下α2-APと略
すことがある）とマクログロブリン（以下α2-Mと略す
ことがある）の２つのプラズマプロティンへの阻害を含
むプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターを
測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】組織プラスミノーゲン活性化因子及びウ
ロキナーゼプラスミノ−ゲン活性化因子の生理活性は、
プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと呼ばれる阻
害物質により調節されている。特に、ｔＰＡとＰＡＩは
線維素溶解の調節において非常に重要な役割を果たして
おり、従来知られているｔＰＡとＰＡＩのアッセイ方法
は、プラスミノーゲンから系統的に発生したプラスミン
を、プラスミン特異的(蛍光発色源又は好ましくは発色
源）ペプチド基質により測定するという原理に基づいて
いる。
ロキナーゼプラスミノ−ゲン活性化因子の生理活性は、
プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと呼ばれる阻
害物質により調節されている。特に、ｔＰＡとＰＡＩは
線維素溶解の調節において非常に重要な役割を果たして
おり、従来知られているｔＰＡとＰＡＩのアッセイ方法
は、プラスミノーゲンから系統的に発生したプラスミン
を、プラスミン特異的(蛍光発色源又は好ましくは発色
源）ペプチド基質により測定するという原理に基づいて
いる。
【０００３】上記線維素溶解の目的は、管壁に形成され
やすいフィブリン沈澱物を溶解することにより血管通過
性を回復することである。線維素溶解は、非常に強力な
酵素であってその不活性状態ではプラスミノーゲンとし
てプラズマ内を循環しているプラスミンにより行われ
る。
やすいフィブリン沈澱物を溶解することにより血管通過
性を回復することである。線維素溶解は、非常に強力な
酵素であってその不活性状態ではプラスミノーゲンとし
てプラズマ内を循環しているプラスミンにより行われ
る。
【０００４】プラスミノーゲンが活性化されてプラスミ
ンを形成するにあったては、いわゆる内在（又は内生）
ルートと外在（又は外生）ルートの 2つのルートがあ
り、生体内では血液の流動性が常に維持されるように、
インヒビターの作用によって線維素溶解が絶えず調節さ
れている。参考のために、図１に活性化因子とインヒビ
ターの相互作用によって行われる線維素溶解のメカニズ
ムを示す。尚図１において、太い実線の矢印は活性化を
示し、太い破線の矢印は阻害を示す。
ンを形成するにあったては、いわゆる内在（又は内生）
ルートと外在（又は外生）ルートの 2つのルートがあ
り、生体内では血液の流動性が常に維持されるように、
インヒビターの作用によって線維素溶解が絶えず調節さ
れている。参考のために、図１に活性化因子とインヒビ
ターの相互作用によって行われる線維素溶解のメカニズ
ムを示す。尚図１において、太い実線の矢印は活性化を
示し、太い破線の矢印は阻害を示す。
【０００５】ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
（ｕＰＡ）は、最初プロウロキナーゼ〔または、シング
ルチェーンウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
（scuＰＡ）と呼ばれる〕の形をとり、その後いわゆる
高分子量プロウロキナーゼ〔または、2チェーン・ウロ
キナーゼプラスミノーゲン活性化因子（tcuPA又はHMW-U
K）と呼ばれる〕として線維素溶解のメカニズム( 内在
ルート) に関与する。ｔＰＡは、 sctＰＡ〔いわゆるシ
ングルチェーン組織プラスミノーゲン活性化因子或はｔ
ＰＡ-Iと呼ばれる〕の形で、また tctＰＡ〔2チェーン
組織プラスミノーゲン活性化因子或はｔＰＡ−IIと呼ば
れる〕として線維素溶解のメカニズム（外在ルート）に
関与する。
（ｕＰＡ）は、最初プロウロキナーゼ〔または、シング
ルチェーンウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
（scuＰＡ）と呼ばれる〕の形をとり、その後いわゆる
高分子量プロウロキナーゼ〔または、2チェーン・ウロ
キナーゼプラスミノーゲン活性化因子（tcuPA又はHMW-U
K）と呼ばれる〕として線維素溶解のメカニズム( 内在
ルート) に関与する。ｔＰＡは、 sctＰＡ〔いわゆるシ
ングルチェーン組織プラスミノーゲン活性化因子或はｔ
ＰＡ-Iと呼ばれる〕の形で、また tctＰＡ〔2チェーン
組織プラスミノーゲン活性化因子或はｔＰＡ−IIと呼ば
れる〕として線維素溶解のメカニズム（外在ルート）に
関与する。
【０００６】しかしながら、生理学的には、 scuＰＡ
（内在ルート）が、線維素溶解活動に大きく関与し、ｔ
ＰＡ（外在ルート）は僅かな範囲でしか関与しないこと
が指摘されている〔ｔＰＡの約95％が放出されるとすぐ
に、PAI-1 により急速に錯体化され、ｔＰＡの約 5％の
みが遊離状態を維持し、プラズマ内で活性状態を維持す
る〕。一方、生体がなんらかの種類の攻撃を受けた場合
には、外在ルートがプラスミンの過度に形成されること
を緩和するのに重要な役割を果たす。
（内在ルート）が、線維素溶解活動に大きく関与し、ｔ
ＰＡ（外在ルート）は僅かな範囲でしか関与しないこと
が指摘されている〔ｔＰＡの約95％が放出されるとすぐ
に、PAI-1 により急速に錯体化され、ｔＰＡの約 5％の
みが遊離状態を維持し、プラズマ内で活性状態を維持す
る〕。一方、生体がなんらかの種類の攻撃を受けた場合
には、外在ルートがプラスミンの過度に形成されること
を緩和するのに重要な役割を果たす。
【０００７】ｔＰＡは、主として内皮細胞から放出され
る。この物質は、動物由来（豚の卵巣と心臓等）又は人
間由来（子宮）の種々の組織から抽出できる。しかし、
これらの組織から抽出される精製ｔＰＡの量は微小なの
で、精製ｔＰＡは人間の黒色腫（BOWES）の細胞培養か
ら得ることが好ましい。大量のｔＰＡを分泌する上記細
胞培養により、精製ｔＰＡを得て、その分子量を推定
し、その生物化学的構造を測定し、その生理学的活性を
特徴づけることができる。ｔＰＡは、プラスミノーゲン
をプラスミンに転化するものであって、平均分子量約7
0,000のセリンプロテアーゼからなる。フィブリンの存
在は、ｔＰＡによるプラスミノーゲンの最適な活性化を
可能にする。
る。この物質は、動物由来（豚の卵巣と心臓等）又は人
間由来（子宮）の種々の組織から抽出できる。しかし、
これらの組織から抽出される精製ｔＰＡの量は微小なの
で、精製ｔＰＡは人間の黒色腫（BOWES）の細胞培養か
ら得ることが好ましい。大量のｔＰＡを分泌する上記細
胞培養により、精製ｔＰＡを得て、その分子量を推定
し、その生物化学的構造を測定し、その生理学的活性を
特徴づけることができる。ｔＰＡは、プラスミノーゲン
をプラスミンに転化するものであって、平均分子量約7
0,000のセリンプロテアーゼからなる。フィブリンの存
在は、ｔＰＡによるプラスミノーゲンの最適な活性化を
可能にする。
【０００８】プラスミノーゲン活性化因子インヒビター
は、プラスミノーゲン活性化因子の調節に関与する。基
本的に、ＰＡＩは次の４種類、即ちPAI-1（プラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビター1）、PAI-2（プラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビター2）、PAI-3（プラスミノ
ーゲン活性化因子のインヒビター3）及びプロテアーゼ
・ネキシン（protease nexine）〔Thrombosis and Haem
ostrasis , 56(No.3),415〜416（1986）参照〕が知られ
ている。
は、プラスミノーゲン活性化因子の調節に関与する。基
本的に、ＰＡＩは次の４種類、即ちPAI-1（プラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビター1）、PAI-2（プラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビター2）、PAI-3（プラスミノ
ーゲン活性化因子のインヒビター3）及びプロテアーゼ
・ネキシン（protease nexine）〔Thrombosis and Haem
ostrasis , 56(No.3),415〜416（1986）参照〕が知られ
ている。
【０００９】ｔＰＡインヒビターは反活性化因子とも言
われ、主にPAI-1とPAI-2の２つのタイプがある。PAI-1
はプラズマと血小板のアルファ粒に存在し、ｔＰＡとｕ
ＰＡの両方に反応し、不活性錯体である（tPA-PAI-1）
と（uPA-PAI-1）になる。その錯体化の比率は非常に高
いので、遊離PAI-1がプラズマ中にあるという事実は、
このプラズマ内で活性遊離ｔＰＡは存在しないことを意
味する。
われ、主にPAI-1とPAI-2の２つのタイプがある。PAI-1
はプラズマと血小板のアルファ粒に存在し、ｔＰＡとｕ
ＰＡの両方に反応し、不活性錯体である（tPA-PAI-1）
と（uPA-PAI-1）になる。その錯体化の比率は非常に高
いので、遊離PAI-1がプラズマ中にあるという事実は、
このプラズマ内で活性遊離ｔＰＡは存在しないことを意
味する。
【００１０】PAI-2はマクロファージ（大食細胞）に由
来すると思われるが、妊娠の第 3期にある妊娠した女性
で最大の濃度で存在し、ｔＰＡと共に不活性な錯体を形
成するが、ｕＰＡに対してはより大きな親和性を有して
いる〔E.D. SPRENGER et al., Blood , 69(No.2), 381
〜387,（1987）参照〕。
来すると思われるが、妊娠の第 3期にある妊娠した女性
で最大の濃度で存在し、ｔＰＡと共に不活性な錯体を形
成するが、ｕＰＡに対してはより大きな親和性を有して
いる〔E.D. SPRENGER et al., Blood , 69(No.2), 381
〜387,（1987）参照〕。
【００１１】言い換えれば、ｔＰＡとｕＰＡの活性が、
内皮タイプ（PAI-1）と胎盤タイプ（PAI-2）という少な
くとも２つの特異的なインヒビターにより調節され、ま
たｔＰＡ／ＰＡＩとｕＰＡ／ＰＡＩのペアが線維素溶解
の調節において重要な役割を果たすということである。
内皮タイプ（PAI-1）と胎盤タイプ（PAI-2）という少な
くとも２つの特異的なインヒビターにより調節され、ま
たｔＰＡ／ＰＡＩとｕＰＡ／ＰＡＩのペアが線維素溶解
の調節において重要な役割を果たすということである。
【００１２】さらに、プラズマのアンチプラスミン活性
は非常に高く、主としてα1-グロブリンとα2-グロブリ
ンに存在することは周知である。精製システムにおいて
プラスミンを阻害できるプラズマプロテインとしては下
記の６種類のものが知られている。
は非常に高く、主としてα1-グロブリンとα2-グロブリ
ンに存在することは周知である。精製システムにおいて
プラスミンを阻害できるプラズマプロテインとしては下
記の６種類のものが知られている。
【００１３】 1.α1-アンチトリプシン 2.インター -α- アンチトリプシン 3.C1エステラーゼのインヒビター（C1-Inhと略す） 4.アンチトロンビンIII（AT IIIと略す） 5.α2-マクログロブリン（α2-Mと略す） 6.α2-アンチプラスミン（α2-APと略す）
【００１４】α2-APとα2-Mが通常のプラズマ濃度であ
る場合には、これ以外のプラスミンインヒビターは、プ
ラスミンの不活性化にわずかに関与するだけである。α
2-Mの役割は、遊離α2-APがなくなった時に、過剰のプ
ラスミンの生成を阻害することである。上記インヒビタ
ー（主に、α2-APとα2-M）は、ＰＡＩアッセイで有意
に干渉する［G. CONTANT et al.，Thrombosis Research
，56，377〜386，（1989）及び1988年にアテネのthe C
ongres de la Lingue Mediterraneenne de Lutte contr
e la Thromboseで配布されたW. KAUSEL et al.によるレ
ポート「プラズマのｔＰＡ及びｕＰＡ阻害能力への周知
のＰＡＩの相対的貢献」参照］。
る場合には、これ以外のプラスミンインヒビターは、プ
ラスミンの不活性化にわずかに関与するだけである。α
2-Mの役割は、遊離α2-APがなくなった時に、過剰のプ
ラスミンの生成を阻害することである。上記インヒビタ
ー（主に、α2-APとα2-M）は、ＰＡＩアッセイで有意
に干渉する［G. CONTANT et al.，Thrombosis Research
，56，377〜386，（1989）及び1988年にアテネのthe C
ongres de la Lingue Mediterraneenne de Lutte contr
e la Thromboseで配布されたW. KAUSEL et al.によるレ
ポート「プラズマのｔＰＡ及びｕＰＡ阻害能力への周知
のＰＡＩの相対的貢献」参照］。
【００１５】従来推奨されているｔＰＡとＰＡＩのアッ
セイ方法を、図１０及び図１１に示す。これらの方法
は、プラスミン特異的発色源基質により系に発生したプ
ラスミンを測定するものである。
セイ方法を、図１０及び図１１に示す。これらの方法
は、プラスミン特異的発色源基質により系に発生したプ
ラスミンを測定するものである。
【００１６】特に、従来推奨されてきたｔＰＡの生理学
的活性のアッセイ方法は、固相法と液相法であることが
知られている。
的活性のアッセイ方法は、固相法と液相法であることが
知られている。
【００１７】固相法（方法M1）では、フィブリンの網状
組織をマイクロプレートのカップ表面へ固定することを
基本とする技術が知られている。そしてｔＰＡのソース
が固定された後、プラスミンの発生を妨げる大部分の要
因を除くために、洗浄が実施される。この方法は、次の
利点を有する。
組織をマイクロプレートのカップ表面へ固定することを
基本とする技術が知られている。そしてｔＰＡのソース
が固定された後、プラスミンの発生を妨げる大部分の要
因を除くために、洗浄が実施される。この方法は、次の
利点を有する。
【００１８】・プラズマといったｔＰＡのどのソースに
ついても使用できる。 ・測定活性がｔＰＡに特異的で、scuPA（プロウロキナ
ーゼ）やtcuPA（ウロキナーゼ）から独立している［こ
れに関しては、「高フィブリン親和組織プラスミノ−ゲ
ン活性化因子に関するスペクトロフォトメトリック固相
フィブリン組織プラスミノ−ゲン活性化因子活性分析
（SOFIA-tPA）」（E. ANGLES-CANO et al.，Anal. Bioc
hem., 153 :201〜210，（1986））で説明されている物
理治療法M1を参照のこと］。
ついても使用できる。 ・測定活性がｔＰＡに特異的で、scuPA（プロウロキナ
ーゼ）やtcuPA（ウロキナーゼ）から独立している［こ
れに関しては、「高フィブリン親和組織プラスミノ−ゲ
ン活性化因子に関するスペクトロフォトメトリック固相
フィブリン組織プラスミノ−ゲン活性化因子活性分析
（SOFIA-tPA）」（E. ANGLES-CANO et al.，Anal. Bioc
hem., 153 :201〜210，（1986））で説明されている物
理治療法M1を参照のこと］。
【００１９】液相法( 方法 M2)では、過剰のプラスミノ
ーゲンと刺激剤としての溶解性フィブリノーゲンフラグ
メントが、アッセイされるｔＰＡのソースに添加され
る。発生した過剰のプラスミンは、プラスミンに特異的
な基質〔例えば、DIAGNOSTICASTAGO から販売されてい
る基質CBS 33.08（H-D-Abu-L-CHA-L-Lys-pNA）又はCBS3
3.08（H-D-Nle-L-CHA-L-Arg-pNA）の１つ〕を開裂し、
特に405nmで検知できるpNAを放出する。ｔＰＡのソース
は、検量線作成のために使用された精製ｔＰＡ（前記の
様にメラノーマから抽出されたもの）又はプラズマ真正
グロブリン（pH5.9で1/10希釈）のどちらかであり、つ
まり反応の第２段階を妨げるであろうプラスミンインヒ
ビター（特に、α2-AP）を欠いているｔＰＡのソースで
ある。
ーゲンと刺激剤としての溶解性フィブリノーゲンフラグ
メントが、アッセイされるｔＰＡのソースに添加され
る。発生した過剰のプラスミンは、プラスミンに特異的
な基質〔例えば、DIAGNOSTICASTAGO から販売されてい
る基質CBS 33.08（H-D-Abu-L-CHA-L-Lys-pNA）又はCBS3
3.08（H-D-Nle-L-CHA-L-Arg-pNA）の１つ〕を開裂し、
特に405nmで検知できるpNAを放出する。ｔＰＡのソース
は、検量線作成のために使用された精製ｔＰＡ（前記の
様にメラノーマから抽出されたもの）又はプラズマ真正
グロブリン（pH5.9で1/10希釈）のどちらかであり、つ
まり反応の第２段階を妨げるであろうプラスミンインヒ
ビター（特に、α2-AP）を欠いているｔＰＡのソースで
ある。
【００２０】方法M2は、DIAGNOSTICA STAGO 社の“STAC
HROM PA "分析（同社のカタログのNo0822参照）に関す
るパンフレットに示されている。
HROM PA "分析（同社のカタログのNo0822参照）に関す
るパンフレットに示されている。
【００２１】測定された活性は、特に、フィブリノーゲ
ンフラグメントによりｔＰＡと関与しているが、他の活
性ルート（ファクターＸII、プロウロキナーゼ、ウロキ
ナーゼ）により増幅される。従ってｔＰＡに特異的な活
性を測定するため、抗ｔＰＡ抗体を添加する必要があ
る。
ンフラグメントによりｔＰＡと関与しているが、他の活
性ルート（ファクターＸII、プロウロキナーゼ、ウロキ
ナーゼ）により増幅される。従ってｔＰＡに特異的な活
性を測定するため、抗ｔＰＡ抗体を添加する必要があ
る。
【００２２】また、リジン−セファロースのカラムへの
吸着により遊離ｔＰＡを分離するという他の方法（方法
M7）［E. GYZANDER et al.，Thromb. Res.，35，547〜5
48（1984）参照］も知られている。
吸着により遊離ｔＰＡを分離するという他の方法（方法
M7）［E. GYZANDER et al.，Thromb. Res.，35，547〜5
48（1984）参照］も知られている。
【００２３】また、ＰＡＩのアッセイに応用できる方法
は、試験されたプラズマに含まれているＰＡＩの錯体化
後の残留ｔＰＡの測定に基づくので、ｔＰＡのアッセイ
にも利用できる。これらの方法は、特に、真正グロブリ
ンを使用する方法M3［KORNINGER et al.，Thromb. Hae
m. ，46，622〜665，（1981）及び52，127 〜130、（19
84）］、酸性化プラズマを使用する方法M4［J. CHMIELE
WSKA et al.，Thromb.Res.，31，427 〜436 、(198
3)］、純粋又は希釈プラズマへの真正グロビリンの沈澱
を含む方法M5［J. H VERHELKJENA et al. ，Thromb. Re
s.，48，266〜269，(1982)］、DIAGNOSTICA STAGO社が
「STACHROM PAI」（No0824参照）の商品名で販売してい
る分析キットで使用されている、G. CONTANT et al.に
よる上記の論文で説明される方法M6等である。G. CONTA
NT et al.による上記方法では、ＰＡＩの存在しない
（つまり、少なくなったか或は使い尽くされた）プラズ
マのテストサンプルを希釈することが重要である。この
場合、プラズマに含まれている（α2-APとα2-M以外
の）プラスミンインヒビターによる干渉は無視できるよ
うになる。
は、試験されたプラズマに含まれているＰＡＩの錯体化
後の残留ｔＰＡの測定に基づくので、ｔＰＡのアッセイ
にも利用できる。これらの方法は、特に、真正グロブリ
ンを使用する方法M3［KORNINGER et al.，Thromb. Hae
m. ，46，622〜665，（1981）及び52，127 〜130、（19
84）］、酸性化プラズマを使用する方法M4［J. CHMIELE
WSKA et al.，Thromb.Res.，31，427 〜436 、(198
3)］、純粋又は希釈プラズマへの真正グロビリンの沈澱
を含む方法M5［J. H VERHELKJENA et al. ，Thromb. Re
s.，48，266〜269，(1982)］、DIAGNOSTICA STAGO社が
「STACHROM PAI」（No0824参照）の商品名で販売してい
る分析キットで使用されている、G. CONTANT et al.に
よる上記の論文で説明される方法M6等である。G. CONTA
NT et al.による上記方法では、ＰＡＩの存在しない
（つまり、少なくなったか或は使い尽くされた）プラズ
マのテストサンプルを希釈することが重要である。この
場合、プラズマに含まれている（α2-APとα2-M以外
の）プラスミンインヒビターによる干渉は無視できるよ
うになる。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらｔＰＡ及
び／又はＰＡＩの上記アッセイ方法は、ｔＰＡ- ＰＡＩ
とｕＰＡ- ＰＡＩ錯体から遊離ｔＰＡを分離する必要
と、プラズマの酸性化（方法M4を参照）、真正グロブリ
ンの沈澱（方法M5を参照）、カラムでの吸着（方法M7を
参照）等の方法により、プラスミンインヒビター（特
に、α2-APとα2-M）の作用を防止する必要とがあり、
実行するのに長時間を要し、また難しく、分析の再現性
や感度が不十分という傾向があるといった問題を有して
いる。
び／又はＰＡＩの上記アッセイ方法は、ｔＰＡ- ＰＡＩ
とｕＰＡ- ＰＡＩ錯体から遊離ｔＰＡを分離する必要
と、プラズマの酸性化（方法M4を参照）、真正グロブリ
ンの沈澱（方法M5を参照）、カラムでの吸着（方法M7を
参照）等の方法により、プラスミンインヒビター（特
に、α2-APとα2-M）の作用を防止する必要とがあり、
実行するのに長時間を要し、また難しく、分析の再現性
や感度が不十分という傾向があるといった問題を有して
いる。
【００２５】さらに、酸化によるα−アンチプラスミン
の不活性化が、特にD. JOHNSONらによる論文［J. Biol.
Chem.，254 ，4022〜4026，(1979)］及びD. LAWRENCE
らによるコミュニケーションのアブストラクトNo01358
（「血栓症と止血」会議、San Diego 、1985年）から、
クロラミン（chloramine）Tによる不活性化が、D. LAWR
ENCEらによる論文［Biochem.，25，6351〜6355（198
6）］から周知なので、α2-APの作用を阻害するため
に、クロラミンTのようなメチオニン（methionine）群
に特異的な酸化剤の添加からなる新しい方法（方法M8）
が提案されている［これに関連してT.W.STIEF et al.,
Thromb. Res., 42 ,581〜589,（1988）, 50 ,559〜573,
（1988）及び56 ,213〜220（1989）による論文、公表ヨ
ーロッパ特許出願EP-A-0 297 597及び「プラスミノ−ゲ
ン活性化因子インヒビターの機能測定」と言う表題の商
品名「PAI-TEST」でBEHRING DIAGNOSTIKA が販売してい
る分析キットに関するパンフレット（1988年11月）を参
照のこと］。しかしながら上記方法であってもクロラミ
ンT と他の酸化剤の取扱が困難なので、組織プラスミノ
ーゲン及びウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
と、これらのインヒビターを測定するための新しい技術
的解決手段の開発が要望されている。
の不活性化が、特にD. JOHNSONらによる論文［J. Biol.
Chem.，254 ，4022〜4026，(1979)］及びD. LAWRENCE
らによるコミュニケーションのアブストラクトNo01358
（「血栓症と止血」会議、San Diego 、1985年）から、
クロラミン（chloramine）Tによる不活性化が、D. LAWR
ENCEらによる論文［Biochem.，25，6351〜6355（198
6）］から周知なので、α2-APの作用を阻害するため
に、クロラミンTのようなメチオニン（methionine）群
に特異的な酸化剤の添加からなる新しい方法（方法M8）
が提案されている［これに関連してT.W.STIEF et al.,
Thromb. Res., 42 ,581〜589,（1988）, 50 ,559〜573,
（1988）及び56 ,213〜220（1989）による論文、公表ヨ
ーロッパ特許出願EP-A-0 297 597及び「プラスミノ−ゲ
ン活性化因子インヒビターの機能測定」と言う表題の商
品名「PAI-TEST」でBEHRING DIAGNOSTIKA が販売してい
る分析キットに関するパンフレット（1988年11月）を参
照のこと］。しかしながら上記方法であってもクロラミ
ンT と他の酸化剤の取扱が困難なので、組織プラスミノ
ーゲン及びウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
と、これらのインヒビターを測定するための新しい技術
的解決手段の開発が要望されている。
【００２６】本発明は上記事情に着目してなされてもの
であって、プラズマプロテインであるα2-AP及び／又は
α2-Mを阻害するか又は無効にするという新規な手段に
よって、組織プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナ
ーゼプラスミノーゲン活性化因子よりなる群から選択さ
れたプラスミノーゲン活性化因子、或は該プラスミノー
ゲン活性化因子のインヒビターの測定を行う新規な方法
を提供しようとするものである。
であって、プラズマプロテインであるα2-AP及び／又は
α2-Mを阻害するか又は無効にするという新規な手段に
よって、組織プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナ
ーゼプラスミノーゲン活性化因子よりなる群から選択さ
れたプラスミノーゲン活性化因子、或は該プラスミノー
ゲン活性化因子のインヒビターの測定を行う新規な方法
を提供しようとするものである。
【００２７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明は、組織プラスミノーゲン活性化因子及び／或いはウ
ロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、またはこれら
のインヒビターを測定する方法において、α2-アンチプ
ラスミン及び／又はα2-マクログロブリンを阻害する物
質を用いるにあたり、前記阻害する物質として、メタロ
プロテイナーゼ作用物質（metalloproteinase material
s）を用いることを要旨とする。
明は、組織プラスミノーゲン活性化因子及び／或いはウ
ロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、またはこれら
のインヒビターを測定する方法において、α2-アンチプ
ラスミン及び／又はα2-マクログロブリンを阻害する物
質を用いるにあたり、前記阻害する物質として、メタロ
プロテイナーゼ作用物質（metalloproteinase material
s）を用いることを要旨とする。
【００２８】尚本発明は、α2-AP及び／又はα2-Mを阻
害するメタロプロテイナーゼ作用物質を含むヘビ毒液
が、組織プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナーゼ
プラスミノーゲン活性化因子を、或はこれらのインヒビ
ターであるＰＡＩをも解体も破壊もしないという知見
（Hurbert PIRKLE及びFrancis S.MARKLAND Jr.による研
究「止血と動物の毒液」で公表された「プラスマ・プロ
テイナーゼインヒビターに対するヘビ毒液メタロプロテ
イナーゼの作用」と言う表題のL.F. KRESSによる論文、
出版者：MARCEL DEKKER INC., New York, Basel、335〜
348ページを参照のこと）に基づくものである。
害するメタロプロテイナーゼ作用物質を含むヘビ毒液
が、組織プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナーゼ
プラスミノーゲン活性化因子を、或はこれらのインヒビ
ターであるＰＡＩをも解体も破壊もしないという知見
（Hurbert PIRKLE及びFrancis S.MARKLAND Jr.による研
究「止血と動物の毒液」で公表された「プラスマ・プロ
テイナーゼインヒビターに対するヘビ毒液メタロプロテ
イナーゼの作用」と言う表題のL.F. KRESSによる論文、
出版者：MARCEL DEKKER INC., New York, Basel、335〜
348ページを参照のこと）に基づくものである。
【００２９】
【作用】本明細書では、便宜上次の略語を用いている。 ＜a) 線維素溶解に関するもの＞ α2-AP ＝α2-アンチプラスミン Cl-Inh ＝Clエステラーゼ（Cl esterase）のインヒビター α2-M ＝α2-マクログロブリン ｔＰＡ ＝組織プラスミノーゲン活性化因子 scｔＰＡ ＝シングルチェーン組織プラスミノーゲン活性化因子； 別の名称：tPA-I. tcｔＰＡ ＝ダブルチェーン組織プラスミノーゲン活性化因子； 別の名称：tPA-II ｕＰＡ ＝ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子； 別の名称：ウロキナーゼ 又は尿プラスミノ−ゲン活性化因子 scuPA ＝シングルチェーンウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子； 別の名称：プロウロキナーゼ tcuPA ＝ダブルチェーンウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子； 別の名称：高分子量ウロキナーゼ又はHMW-UK ＰＡＩ ＝プラズミノーゲン活性化因子インヒビター PAI-1 ＝プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1、それぞれ、ｔＰＡと ｕＰＡを有する錯合体（tPA-PAI-1）と（uPA-PAI-2）を形成する 物質 PAI-2 ＝プラスミノーゲン活性化因子のインヒビター2、ｔＰＡとuPAを有す る錯体を形成する物質 PAI-3 ＝プラスミノーゲン活性化因子のインヒビター3、uPAを有する錯体を 形成できる物質 UK ＝ウロキナーゼ（uPAの別の名称）。
【００３０】＜b) ペプチド基質に関するもの＞ Arg ＝アルギニル Abu ＝2-アミノブチリル CHA ＝3-シクロヘキシルアラニル CHT ＝3-(4-ヒドロキシルシクロヘキシル)アラニル Glu ＝グルタミニル Gly ＝グリシル Hyp ＝ヒドロキシプロリル（3Hyp又は4Hyp） 3Hyp ＝3-ヒドロキシプロリル（又は3-ヒドロキシピロリジン-2-カルボ ニル） 4Hyp ＝4-ヒドロキシプロリル（又は4-ヒドロキシピロリジン-2-カルボ ニル） Leu ＝ロイシル Lys ＝リジル Nle ＝ノルロイシル Nva ＝ノルバリル Phe ＝フェニルアラニル Phg ＝フェニルグリシル Pip ＝ピペコリノイル（pipecolinoyl） Pro ＝プロリル Pyr ＝ピログルタミニル（又はピロリド-2-ワン-5-カルボニル） Tyr ＝チロシル Val ＝バリル。
【００３１】＜c)その他＞ AMCHA ＝トラネキサム酸； 体系的な名称：4-(アミノメチル) シクロヘキサンカルボン酸 BSA ＝牛血清アルブミン Bzl ＝ベンジル EACA ＝ε-アミノカプロン酸 EM ＝エトキシマロニル（EtO-CO-CH2-CO） Et ＝エチル Me ＝メチル MM ＝メトキシマロニル（MeO-CO-CH2-CO） OD ＝光学密度 tBu ＝t-ブトキシ PEGn ＝分子量＝nのポリエチレン・グリコール残留物 MW ＝分子量 pNA ＝p-ニトロアニリノ［又は(4-NO2)C6H4NH］ RT ＝室温（15〜20℃）。
【００３２】本発明において、「メタロプロテイナーゼ
作用物質」とは、１種又は２種以上のメタロプロテイナ
ーゼからなる物質、又は少なくとも１種以上のメタロテ
イナーゼを含む物質を意味するものである。本発明にお
いて用いられるメタロプロテイナーゼ作用物質の目的
は、プラズマプロティンであるα2-AP及び／又はα2-M
を無効または阻害または破壊することにある。
作用物質」とは、１種又は２種以上のメタロプロテイナ
ーゼからなる物質、又は少なくとも１種以上のメタロテ
イナーゼを含む物質を意味するものである。本発明にお
いて用いられるメタロプロテイナーゼ作用物質の目的
は、プラズマプロティンであるα2-AP及び／又はα2-M
を無効または阻害または破壊することにある。
【００３３】本発明において好ましく用いられるメタロ
プロテイナーゼ作用物質としては、毒液を挙げることが
できる。特にヘビ又は昆虫から収集又は精製した、少な
くとも１種以上のメタロプロテイナーゼを含む毒液が使
用でき、クサリヘビ（Viperidae）とガラガラヘビ（Cro
talidae）に属するヘビの毒液を、特に挙げることがで
きる。
プロテイナーゼ作用物質としては、毒液を挙げることが
できる。特にヘビ又は昆虫から収集又は精製した、少な
くとも１種以上のメタロプロテイナーゼを含む毒液が使
用でき、クサリヘビ（Viperidae）とガラガラヘビ（Cro
talidae）に属するヘビの毒液を、特に挙げることがで
きる。
【００３４】本発明において好ましいメタロプロテイナ
ーゼ作用物質とは、分子量68,000程度のα2−アンチプ
ラスミンを開裂し、α2-AP活性を実質上欠き、分子量5
3,000程度のペプチドを生じる物質である。
ーゼ作用物質とは、分子量68,000程度のα2−アンチプ
ラスミンを開裂し、α2-AP活性を実質上欠き、分子量5
3,000程度のペプチドを生じる物質である。
【００３５】本発明において特に好ましいメタロプロテ
イナーゼ作用物質とは、Bitis arietans、Crotalus bas
iliscus 及びLachesis muta（又はLachesis mutus）の
毒液である。
イナーゼ作用物質とは、Bitis arietans、Crotalus bas
iliscus 及びLachesis muta（又はLachesis mutus）の
毒液である。
【００３６】更に本発明においては、上記のメタロプロ
テイナーゼ作用物質が、少なくとも１つのω-アミノ酸
と組み合わせて使用されることが好ましい。
テイナーゼ作用物質が、少なくとも１つのω-アミノ酸
と組み合わせて使用されることが好ましい。
【００３７】AMCHAやEACAのようなω-アミノ酸は、下記
の２つのメカニズムを通じてプラスミノーゲンのプラス
ミンへの変換を促進することが知られている。即ち、グ
ルタミン酸−プラスミノーゲン（Glu-plaminogen）から
リジン−プラスミノーゲン（Lys-plasminogen）への構
造変化を促してプラスミンを形成する様、より活性化さ
れやすくするメカニズム、及びα2-APのプラスミン阻害
効果が少なくとも10分の１以上に減少する様にプラスミ
ンのα2-APとのプラスミンの相互作用を妨害するメカニ
ズムである。
の２つのメカニズムを通じてプラスミノーゲンのプラス
ミンへの変換を促進することが知られている。即ち、グ
ルタミン酸−プラスミノーゲン（Glu-plaminogen）から
リジン−プラスミノーゲン（Lys-plasminogen）への構
造変化を促してプラスミンを形成する様、より活性化さ
れやすくするメカニズム、及びα2-APのプラスミン阻害
効果が少なくとも10分の１以上に減少する様にプラスミ
ンのα2-APとのプラスミンの相互作用を妨害するメカニ
ズムである。
【００３８】ここで特記すべきことは、α2-APに関して
使い尽くされていないプラズマを用いる際に、PAIの有
無に関係なく、上記のω-アミノ酸が、α2-APとα2-Mへ
のメタロプロテイナーゼ作用物質に望ましい影響を与え
ることが判明したということである。一方、α2-APに関
して使い尽くされたプラズマを用いる場合は、上記メタ
ロプロテイナーゼ作用物質の効果は発揮されない。した
がってこの場合は、プラスミノーゲンからのプラスミン
の生成は上記のメタロプロテイナーゼ作用物質で十分で
ある。
使い尽くされていないプラズマを用いる際に、PAIの有
無に関係なく、上記のω-アミノ酸が、α2-APとα2-Mへ
のメタロプロテイナーゼ作用物質に望ましい影響を与え
ることが判明したということである。一方、α2-APに関
して使い尽くされたプラズマを用いる場合は、上記メタ
ロプロテイナーゼ作用物質の効果は発揮されない。した
がってこの場合は、プラスミノーゲンからのプラスミン
の生成は上記のメタロプロテイナーゼ作用物質で十分で
ある。
【００３９】また本発明に係る測定方法は、（ｉ）組織
プラスミノーゲン活性化因子とウロキナーゼプラスミノ
ーゲン活性化因子よりなる群から選択されるプラスミノ
ーゲン活性化因子と、（ii）該プラスミノーゲン活性化
因子のインヒビターを測定する方法であって、プラスミ
ノーゲン活性化因子によりプラスミノーゲンをプラスミ
ンへ転換させ、前記メタロプロテイナーゼ作用物質によ
ってα2-アンチプラスミン及び／又はα2-マクログロブ
リンを阻害しつつ、前記プラスミンのアッセイを行うこ
とを要旨とする。
プラスミノーゲン活性化因子とウロキナーゼプラスミノ
ーゲン活性化因子よりなる群から選択されるプラスミノ
ーゲン活性化因子と、（ii）該プラスミノーゲン活性化
因子のインヒビターを測定する方法であって、プラスミ
ノーゲン活性化因子によりプラスミノーゲンをプラスミ
ンへ転換させ、前記メタロプロテイナーゼ作用物質によ
ってα2-アンチプラスミン及び／又はα2-マクログロブ
リンを阻害しつつ、前記プラスミンのアッセイを行うこ
とを要旨とする。
【００４０】本発明においてｔＰＡの測定又はアッセイ
を行う場合、刺激剤を含むことが推奨される。上記刺激
剤としては、先行技術の公知のものを用いればよいが、
市販されているフィブリンモノマー［例えば、商品名 D
ESASIF（des-AA-フィブリン原） BIOPOOL製］，分析キ
ット［特にSTACHROM PA，DIAGNOSTICA STAGO製］として
市販されているフィブリン原フラグメント（前述したVE
RHEIJEN による論文参照），又はGYZANDERによる上記の
論文で説明されているポリリジン（polylysine）等が例
示できる。
を行う場合、刺激剤を含むことが推奨される。上記刺激
剤としては、先行技術の公知のものを用いればよいが、
市販されているフィブリンモノマー［例えば、商品名 D
ESASIF（des-AA-フィブリン原） BIOPOOL製］，分析キ
ット［特にSTACHROM PA，DIAGNOSTICA STAGO製］として
市販されているフィブリン原フラグメント（前述したVE
RHEIJEN による論文参照），又はGYZANDERによる上記の
論文で説明されているポリリジン（polylysine）等が例
示できる。
【００４１】ｔＰＡを測定又はアッセイするにあたって
は、適切な緩衝液を用いて濃度を0.025mg/ml以上（試験
混合物の最終含有量で0.0125mg/ml以上に相当する）と
した毒液を用いることが推奨される。実際には、緩衝液
中における毒液の最大濃度は、１mg/ml以下であり、よ
り好ましくは0.05 mg/ml程度の濃度である。上記緩衝液
としてはpH7.0〜9.0のリン酸塩緩衝液であるのが望まし
く、pH7.5のリン酸塩緩衝液がより望ましい。上記の緩
衝液は、分析キットに用いられる試薬の凍結乾燥を促進
することを目的として牛アルブミン（BSA）を含有させ
てもよい。
は、適切な緩衝液を用いて濃度を0.025mg/ml以上（試験
混合物の最終含有量で0.0125mg/ml以上に相当する）と
した毒液を用いることが推奨される。実際には、緩衝液
中における毒液の最大濃度は、１mg/ml以下であり、よ
り好ましくは0.05 mg/ml程度の濃度である。上記緩衝液
としてはpH7.0〜9.0のリン酸塩緩衝液であるのが望まし
く、pH7.5のリン酸塩緩衝液がより望ましい。上記の緩
衝液は、分析キットに用いられる試薬の凍結乾燥を促進
することを目的として牛アルブミン（BSA）を含有させ
てもよい。
【００４２】ＰＡＩをアッセイ又は測定するにあたり好
ましいプラズマ中の毒液濃度は、0.1〜1mg/mlであり、
0.24mg/mlがより好ましい。
ましいプラズマ中の毒液濃度は、0.1〜1mg/mlであり、
0.24mg/mlがより好ましい。
【００４３】ｔＰＡを測定又はアッセイするにあたり最
も好ましい方法としては、(a) 緩衝液で希釈された、被
検体のプラズマに毒液（メタロプロテイナーゼ作用物
質）を混合し、(b) この混合物を、2 分間、37℃で保温
し、(c) プラスミノーゲンのプラスミンへの転換を刺激
する物質（例えば商品名STIMUGEN，DIAGNOSTOCA STAGO
製）を添加し、(d) これを、150分間、37℃で保温し、
(e) 発色源基質を添加し、(f) 得られた混合物を、5 分
間、37℃で保温する方法である。発色性物質の放出は、
最終点法と呼ばれる静的方法又は２点法と呼ばれる動的
方法（この場合、酢酸が添加される）により、特に405n
mで読み取ることができる。OD（特にトランスミッショ
ン）の読み取りは、ブランクを比較対照として行われ
る。上記ブランクは、被検体のプラズマに毒液を添加す
る代わりに、緩衝液に毒液が添加されたものである。
も好ましい方法としては、(a) 緩衝液で希釈された、被
検体のプラズマに毒液（メタロプロテイナーゼ作用物
質）を混合し、(b) この混合物を、2 分間、37℃で保温
し、(c) プラスミノーゲンのプラスミンへの転換を刺激
する物質（例えば商品名STIMUGEN，DIAGNOSTOCA STAGO
製）を添加し、(d) これを、150分間、37℃で保温し、
(e) 発色源基質を添加し、(f) 得られた混合物を、5 分
間、37℃で保温する方法である。発色性物質の放出は、
最終点法と呼ばれる静的方法又は２点法と呼ばれる動的
方法（この場合、酢酸が添加される）により、特に405n
mで読み取ることができる。OD（特にトランスミッショ
ン）の読み取りは、ブランクを比較対照として行われ
る。上記ブランクは、被検体のプラズマに毒液を添加す
る代わりに、緩衝液に毒液が添加されたものである。
【００４４】尚、上記毒液は、刺激剤とともに、段階
(c)で添加してもよい。
(c)で添加してもよい。
【００４５】さらにｔＰＡを測定又はアッセイするにあ
たり好ましい別の方法としては、(a) 緩衝液で希釈され
た、被検体のｔＰＡ又はｕＰＡに毒液を混合し、(b) こ
の混合物を、５分間、37℃で保温し、(c) これにω−ア
ミノ酸（特にAMCHA,EACA）と毒液を添加し、(d) これ
を、３分間、37℃で保温し、(e) 発色源基質を添加し、
(f) 得られた混合物を、３分間、37℃で保温する方法で
ある。ODの読み取りをおこなうにあたっては、被検体の
ｔＰＡ又はｕＰＡの代わりに緩衝液を用いれば良い。
たり好ましい別の方法としては、(a) 緩衝液で希釈され
た、被検体のｔＰＡ又はｕＰＡに毒液を混合し、(b) こ
の混合物を、５分間、37℃で保温し、(c) これにω−ア
ミノ酸（特にAMCHA,EACA）と毒液を添加し、(d) これ
を、３分間、37℃で保温し、(e) 発色源基質を添加し、
(f) 得られた混合物を、３分間、37℃で保温する方法で
ある。ODの読み取りをおこなうにあたっては、被検体の
ｔＰＡ又はｕＰＡの代わりに緩衝液を用いれば良い。
【００４６】また本発明においては、組織プラスミノー
ゲン活性化因子インヒビターを測定するにあたり、(a)
組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼプラ
スミノーゲン活性化因子に、被検体のプラズマを添加
し、(b)この混合物を２分間、37℃で保温し、(c)プラス
ミノーゲン、ω−アミノ酸及び上記メタロプロテイナー
ゼ作用物質を添加し、(d)これを３分間、37℃で保温
し、(e)プラスミン特異的発色源基質を添加し、(f)得ら
れた混合物を３分間、37℃で保温した後、前記組織プラ
スミノーゲン活性化因子又は前記ウロキナーゼプラスミ
ノーゲン活性化因子に代えて緩衝液を用いたブランクと
比較して、発色団の放出に対応する光密度の読み取りを
行うことが好ましい。
ゲン活性化因子インヒビターを測定するにあたり、(a)
組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼプラ
スミノーゲン活性化因子に、被検体のプラズマを添加
し、(b)この混合物を２分間、37℃で保温し、(c)プラス
ミノーゲン、ω−アミノ酸及び上記メタロプロテイナー
ゼ作用物質を添加し、(d)これを３分間、37℃で保温
し、(e)プラスミン特異的発色源基質を添加し、(f)得ら
れた混合物を３分間、37℃で保温した後、前記組織プラ
スミノーゲン活性化因子又は前記ウロキナーゼプラスミ
ノーゲン活性化因子に代えて緩衝液を用いたブランクと
比較して、発色団の放出に対応する光密度の読み取りを
行うことが好ましい。
【００４７】プラスミン特異的発色源基質としては、下
記のいずれかの化合物（尚最後の２つの基質は、フラン
ス特許出願No.90- 01964で説明されている）、または上
記化合物に酸（特に、HCl），酢酸又はトリフルオロ酢
酸を添加した塩のいずれかを用いれば良い。
記のいずれかの化合物（尚最後の２つの基質は、フラン
ス特許出願No.90- 01964で説明されている）、または上
記化合物に酸（特に、HCl），酢酸又はトリフルオロ酢
酸を添加した塩のいずれかを用いれば良い。
【００４８】 H-D-NVa-L-CHA-L-Lys-pNA、 H-D-Abu-L-CHT-L-Lys-pNA、 H-D-Nle-L-CHA-L-Arg-pNA、 H-D-Phe-L-Pip-L-Arg-pNA、 H-D-Val-Leu-Lys-pNA、 MM-L-Phe-L-Arg-pNA 、 MM-L-4Hyp-L-Arg-pNA、 MM-L-3Hyp-L-Arg-pNA、 MM-L-Tyr-L-Arg-pNA 、 MM-L-Phg-L-Arg-pNA 、 MM-L-Hyp-L-Lys-pNA 、 MM-L-Pro-L-Lys-pNA 、 MM-L-Tyr-L-Lys-pNA 、 MM-L-Hyp(OtBu)-L-Arg-pNA 、 EM-L-Pro-L-Arg-pNA 、 EM-L-Tyr-L-Arg-pNA 、 EM-L-Phe-L-Arg-pNA 、 EM-L-Phg-L-Arg-pNA 、 PEG200 [CO-D-Glu(OBzl)-L-Pro-L-Arg-PNA]2 、 PEG400 [CO-D-Leu-Gly-L-Arg-PNA]2 。
【００４９】本発明において分析キットは、組織プラス
ミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼプラスミノーゲ
ン活性化因子、或はプラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビターを測定するためのキットであって、少なくとも１
種以上のメタロプロテイナーゼ作用物質を含有している
キットを用いてなることが好ましく、更に分析キット
は、Bitis arietans、Crotalus basiliscus 、Lachesis
muta の毒液及びその混合物から選ばれた少なくとも１
つ以上のメタロプロテイナーゼ作用物質を含有していれ
ば良く、純粋ｔＰＡ、ｕＰＡ及び／又はＰＡＩサンプル
を含むものが好ましい。
ミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼプラスミノーゲ
ン活性化因子、或はプラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビターを測定するためのキットであって、少なくとも１
種以上のメタロプロテイナーゼ作用物質を含有している
キットを用いてなることが好ましく、更に分析キット
は、Bitis arietans、Crotalus basiliscus 、Lachesis
muta の毒液及びその混合物から選ばれた少なくとも１
つ以上のメタロプロテイナーゼ作用物質を含有していれ
ば良く、純粋ｔＰＡ、ｕＰＡ及び／又はＰＡＩサンプル
を含むものが好ましい。
【００５０】
【実施例】実験例１ −ｔＰＡの測定− 図１０に示された手順を、下記の表１に示された条件に
従って、37℃の温度に保持されたプラスチック溶血チュ
ーブ内で実施する。
従って、37℃の温度に保持されたプラスチック溶血チュ
ーブ内で実施する。
【００５１】
【表１】
【００５２】実験例２ −ＰＡＩの測定− 図１１に示された手順を、下記の表２に示された条件に
従って、37℃の温度に保持されたプラスチック溶血チュ
ーブ内で実施する。
従って、37℃の温度に保持されたプラスチック溶血チュ
ーブ内で実施する。
【００５３】
【表２】
【００５４】実験例３ −α2- APへのメタロプロテイナーゼ作用物質の影響− 通常のプラズマのα2-AP含有量を、B.arietans、C.basi
liscus又はL.mutaの毒液から成るメタロプロテイナーゼ
作用物質の存在下或は非存在下において、DIAGNOSTICA
STAGO 社により販売されている分析キット「STACHROM
α2-AP」により測定した。尚該毒液は希釈緩衝液内のプ
ラズマにおいて0.50mg/ml以上の濃度である（例えば、
プラスミン含有混合物において0.0125mg/ml以上の含有
量）。
liscus又はL.mutaの毒液から成るメタロプロテイナーゼ
作用物質の存在下或は非存在下において、DIAGNOSTICA
STAGO 社により販売されている分析キット「STACHROM
α2-AP」により測定した。尚該毒液は希釈緩衝液内のプ
ラズマにおいて0.50mg/ml以上の濃度である（例えば、
プラスミン含有混合物において0.0125mg/ml以上の含有
量）。
【００５５】B. arietans の毒液の 4種類のバッチ、C.
basiliscusの毒液の4 種類のバッチ、L. muta の毒液の
4 種類のバッチで測定されたα2 -AP 阻害活性は、B.ar
ietansの場合はプラズマにおいて0.5 〜1 g/ml( 即ち、
緩衝液において0.025 〜0.050 g/l)の範囲の濃度、一方
C. basiliscus 又はL.mutaの場合はプラズマにおいて0.
5mg/ml（つまり、緩衝液において0.025mg/ml）の濃度で
得られた。
basiliscusの毒液の4 種類のバッチ、L. muta の毒液の
4 種類のバッチで測定されたα2 -AP 阻害活性は、B.ar
ietansの場合はプラズマにおいて0.5 〜1 g/ml( 即ち、
緩衝液において0.025 〜0.050 g/l)の範囲の濃度、一方
C. basiliscus 又はL.mutaの場合はプラズマにおいて0.
5mg/ml（つまり、緩衝液において0.025mg/ml）の濃度で
得られた。
【００５６】上記の毒液の１つの存在下で通常のプラズ
マ中のα2-AP（α2-AP含有量が100％とみなされる）を
アッセイする時、約25％（20〜30％）の（相対）α2-AP
含有量が測定された。そしてそのことはB. arietans 、
C.basiliscus又はL.mutaの毒液に含まれるメタロプロテ
イナーゼ作用物質によるα2-APのに対する阻害作用を明
らかにする。
マ中のα2-AP（α2-AP含有量が100％とみなされる）を
アッセイする時、約25％（20〜30％）の（相対）α2-AP
含有量が測定された。そしてそのことはB. arietans 、
C.basiliscus又はL.mutaの毒液に含まれるメタロプロテ
イナーゼ作用物質によるα2-APのに対する阻害作用を明
らかにする。
【００５７】図２において縦軸にＯＤ（405nm）、横軸
に毒液（B.arietans）の濃度（mg/ml）を示す。曲線2A
は緩衝液とプラスミンを含むサンプルに対応し、曲線2B
はプラズマとプラスミンを含むサンプルに対応し、曲線
2Cはプラスミンなしの緩衝液を含むサンプルに対応する
ものであり、上記の毒液によるα2-APの阻害が確認され
た。
に毒液（B.arietans）の濃度（mg/ml）を示す。曲線2A
は緩衝液とプラスミンを含むサンプルに対応し、曲線2B
はプラズマとプラスミンを含むサンプルに対応し、曲線
2Cはプラスミンなしの緩衝液を含むサンプルに対応する
ものであり、上記の毒液によるα2-APの阻害が確認され
た。
【００５８】実験例４ −プラスミノーゲン及びプラスミンへの メタロプロテイナーゼ作用物質の影響− メタロプロテイナーゼ作用物質（特に、B.arietans、C.
basiliscus 又はL. muta の毒液）がプラスミノーゲン
に影響せず、プラスミンに対して統計的に有意な効果を
持っていないことが観察された。
basiliscus 又はL. muta の毒液）がプラスミノーゲン
に影響せず、プラスミンに対して統計的に有意な効果を
持っていないことが観察された。
【００５９】プラスミンにメタロプロテイナーゼ作用物
質を添加した後、37℃で保温した場合には、メタロプロ
テイナーゼ作用物質が合成プラスミン特異的基質［特
に、基質CBS 30.41 とCBS 10.65（夫々H-D-Abu-L-Lys-p
NA.AcOHとMM-Hyp-Arg- pNA.AcOHである）］を加水分解
することができることが認められる。この加水分解は、
毒液の濃度に相関関係があり、比較的低濃度の毒液（媒
体において0.0125mg/ml）を使用する時、プラスミンの9
5％が基質に有効である。従ってプラスミンへの毒液の
作用は、統計的に有意ではない。
質を添加した後、37℃で保温した場合には、メタロプロ
テイナーゼ作用物質が合成プラスミン特異的基質［特
に、基質CBS 30.41 とCBS 10.65（夫々H-D-Abu-L-Lys-p
NA.AcOHとMM-Hyp-Arg- pNA.AcOHである）］を加水分解
することができることが認められる。この加水分解は、
毒液の濃度に相関関係があり、比較的低濃度の毒液（媒
体において0.0125mg/ml）を使用する時、プラスミンの9
5％が基質に有効である。従ってプラスミンへの毒液の
作用は、統計的に有意ではない。
【００６０】実験例５ −ｕＰＡとｔＰＡへのメタロプロテイナーゼ作用物質の
影響− 特異的基質で直接測定されたｕＰＡ（ウロキナーゼ）の
活性が、毒液の存在で変化しないことが認められた。即
ち、図３は縦軸にＯＤ（405nm）、横軸に毒液(B.arieta
ns の) の濃度（mg/ml ) を示すものであり、曲線3A
（ｕＰＡ 100IU/ml）、曲線3B（ｕＰＡ 40IU/ml）及び
曲線3C（緩衝液のみ）は、ほぼ直線である。
影響− 特異的基質で直接測定されたｕＰＡ（ウロキナーゼ）の
活性が、毒液の存在で変化しないことが認められた。即
ち、図３は縦軸にＯＤ（405nm）、横軸に毒液(B.arieta
ns の) の濃度（mg/ml ) を示すものであり、曲線3A
（ｕＰＡ 100IU/ml）、曲線3B（ｕＰＡ 40IU/ml）及び
曲線3C（緩衝液のみ）は、ほぼ直線である。
【００６１】STACHROM PA により測定されたｔＰＡの活
性度が、毒液の存在で変化しないことが認められた。即
ち図４は縦軸にＯＤ（405nm）、横軸にｔＰＡの濃度（m
g/ml）を示すものであり、曲線4A（B.arietansの毒液0.
24mg/mlを含む緩衝液）、4B（B.arietansの毒液0.50mg/
mlを含む緩衝液）及び曲線4C（毒液なしの緩衝液）は、
事実上同一の直線である。
性度が、毒液の存在で変化しないことが認められた。即
ち図４は縦軸にＯＤ（405nm）、横軸にｔＰＡの濃度（m
g/ml）を示すものであり、曲線4A（B.arietansの毒液0.
24mg/mlを含む緩衝液）、4B（B.arietansの毒液0.50mg/
mlを含む緩衝液）及び曲線4C（毒液なしの緩衝液）は、
事実上同一の直線である。
【００６２】実験例６ −ＰＡＩへのメタロプロテイナーゼ作用物質の影響− 図５よりＰＡＩの豊富なプラズマが、メタロプロテイナ
ーゼ作用物質（B. arietans、C.basiliscus又はL. muta
の毒液）の存在下で保温される時、測定されたＰＡＩ
の活性が、上記メタロプロテイナーゼ作用物質が存在し
ない場合に上記プラズマにおいて測定された結果と同じ
であることが認められる。またプラズマとメタロプロテ
イナーゼ作用物質（B. arietans、C. basiliscus 又は
L.mutaの毒液）の混合物に精製ｔＰＡを添加する時、添
加されたｔＰＡは上記のメタロプロテイナーゼ作用物質
の有無に関係なく、プラズマ内のＰＡＩにより完全に阻
害される（図６参照）。上記２つの結果は、メタロプロ
テイナーゼ作用物質がＰＡＩを阻害しないことを明らか
に証明している。
ーゼ作用物質（B. arietans、C.basiliscus又はL. muta
の毒液）の存在下で保温される時、測定されたＰＡＩ
の活性が、上記メタロプロテイナーゼ作用物質が存在し
ない場合に上記プラズマにおいて測定された結果と同じ
であることが認められる。またプラズマとメタロプロテ
イナーゼ作用物質（B. arietans、C. basiliscus 又は
L.mutaの毒液）の混合物に精製ｔＰＡを添加する時、添
加されたｔＰＡは上記のメタロプロテイナーゼ作用物質
の有無に関係なく、プラズマ内のＰＡＩにより完全に阻
害される（図６参照）。上記２つの結果は、メタロプロ
テイナーゼ作用物質がＰＡＩを阻害しないことを明らか
に証明している。
【００６３】尚図５において、縦軸にＯＤ（405nm）、
横軸にＰＡＩの濃度（IU/ml）を示す。曲線５Ａ（B. ar
ietans の毒液を含まないＰＡＩ）と曲線５Ｂ（B. arie
tansの毒液を含むＰＡＩ）は平行な直線である。図６に
おいて、縦軸にＯＤ（405nm）、横軸に毒液（B. arieta
nsの）の濃度（mg/ml）を示す。ｔＰＡは0 〜0.50 mg/m
lの毒液濃度において、ＰＡＩを欠くプラズマＰＯ（０I
U/mlのＰＡＩ）又はＰＡＩで豊富なプラズマP1（7.7IU/
mlのＰＡＩ）に添加された。曲線６Ａ（ｔＰＡなしのプ
ラズマＰＯ) は、直線６Ｂ（プラズマＰＯと5.2IU/mlの
ｔＰＡ）にほぼ平行な直線である。直線６Ｃ（ｔＰＡな
しのプラズマＰ１）と６Ｄ（プラズマＰ１と5.2IU/mlの
ｔＰＡ）は、同一である。これは、ＰＡＩで豊富なプラ
ズマ（Ｐ１）に添加されたｔＰＡが、毒液の有無に関係
なく阻害されることを示している。
横軸にＰＡＩの濃度（IU/ml）を示す。曲線５Ａ（B. ar
ietans の毒液を含まないＰＡＩ）と曲線５Ｂ（B. arie
tansの毒液を含むＰＡＩ）は平行な直線である。図６に
おいて、縦軸にＯＤ（405nm）、横軸に毒液（B. arieta
nsの）の濃度（mg/ml）を示す。ｔＰＡは0 〜0.50 mg/m
lの毒液濃度において、ＰＡＩを欠くプラズマＰＯ（０I
U/mlのＰＡＩ）又はＰＡＩで豊富なプラズマP1（7.7IU/
mlのＰＡＩ）に添加された。曲線６Ａ（ｔＰＡなしのプ
ラズマＰＯ) は、直線６Ｂ（プラズマＰＯと5.2IU/mlの
ｔＰＡ）にほぼ平行な直線である。直線６Ｃ（ｔＰＡな
しのプラズマＰ１）と６Ｄ（プラズマＰ１と5.2IU/mlの
ｔＰＡ）は、同一である。これは、ＰＡＩで豊富なプラ
ズマ（Ｐ１）に添加されたｔＰＡが、毒液の有無に関係
なく阻害されることを示している。
【００６４】実験例７ −ｕＰＡ−ＰＡＩ錯体へのメタロプロテイナーゼの影響
− ｕＰＡ（ウロキナーゼ）と共にＰＡＩに豊富なプラズマ
（10IU/mlの濃度のＰＡＩを含むプラズマＰ２）を0.25
時間、37℃で保温して形成されたｕＰＡ−ＰＡＩ錯体と
メタロプロテイナーゼ作用物質（牧畜農場により収集・
供給された、B.arietans の粗毒液）との相互作用は、
実験例６で使用したＰＡＩを欠くプラズマＰ０との比較
により評価した。
− ｕＰＡ（ウロキナーゼ）と共にＰＡＩに豊富なプラズマ
（10IU/mlの濃度のＰＡＩを含むプラズマＰ２）を0.25
時間、37℃で保温して形成されたｕＰＡ−ＰＡＩ錯体と
メタロプロテイナーゼ作用物質（牧畜農場により収集・
供給された、B.arietans の粗毒液）との相互作用は、
実験例６で使用したＰＡＩを欠くプラズマＰ０との比較
により評価した。
【００６５】B. arietans の毒液で得られた結果を、下
記の表３と表４にまとめた。表に示されるように、プラ
ズマＰ０はＰＡＩが存在しないので錯体の形成がなく、
従って残留ｕＰＡがあり、プラズマＰ２はＰＡＩ10IU/m
lを含むので、ｕＰＡとの錯体形成があり、添加ｕＰＡ
の一部のみが残っている。またこれらの結果は、毒液が
ｕＰＡ−ＰＡＩとｔＰＡ- ＰＡＩ錯体の解離に影響しな
いことを示している。
記の表３と表４にまとめた。表に示されるように、プラ
ズマＰ０はＰＡＩが存在しないので錯体の形成がなく、
従って残留ｕＰＡがあり、プラズマＰ２はＰＡＩ10IU/m
lを含むので、ｕＰＡとの錯体形成があり、添加ｕＰＡ
の一部のみが残っている。またこれらの結果は、毒液が
ｕＰＡ−ＰＡＩとｔＰＡ- ＰＡＩ錯体の解離に影響しな
いことを示している。
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】実験例８ −ｕＰＡ又はｔＰＡによるプラスミノーゲンのプラスミ
ンへの転換に対するメタロプロテイナーゼ作用物質とAM
CHA の作用−第一に、基準のω−アミノ酸であるAMCHA
が、ウロキナーゼの存在する場合におけるＰＡＩのアッ
セイにおいてプラスミンの生成を増大させることを確認
した。図７に結果を示す。図７において、縦軸にＯＤ
（405nm）、横軸にＰＡＩの濃度（IU/ml ) を示す。得
られた曲線、即ち7A（AMCHAなし）、7B（試薬中に1.3mm
ol/lのAMCHAを含む）及び7C（試薬中に2.6mmol/lのAMCH
Aを含む）は直線であり、AMCHA が実際にプラスミノ−
ゲンのプラスミンへの転換を増大させることを示してい
る。
ンへの転換に対するメタロプロテイナーゼ作用物質とAM
CHA の作用−第一に、基準のω−アミノ酸であるAMCHA
が、ウロキナーゼの存在する場合におけるＰＡＩのアッ
セイにおいてプラスミンの生成を増大させることを確認
した。図７に結果を示す。図７において、縦軸にＯＤ
（405nm）、横軸にＰＡＩの濃度（IU/ml ) を示す。得
られた曲線、即ち7A（AMCHAなし）、7B（試薬中に1.3mm
ol/lのAMCHAを含む）及び7C（試薬中に2.6mmol/lのAMCH
Aを含む）は直線であり、AMCHA が実際にプラスミノ−
ゲンのプラスミンへの転換を増大させることを示してい
る。
【００６９】第二に、AMCHA が通常のプラズマ（つま
り、100％のα2-APを含むプラズマ）の効果を減少する
ことを確認することを試みた。前記の「STACHROM α2-
AP」法を用いることによって、平均α2-APレベルが30％
であり希釈緩衝液における0.88mol/lの濃度であること
がわかった。
り、100％のα2-APを含むプラズマ）の効果を減少する
ことを確認することを試みた。前記の「STACHROM α2-
AP」法を用いることによって、平均α2-APレベルが30％
であり希釈緩衝液における0.88mol/lの濃度であること
がわかった。
【００７０】第三に、粗毒液（B. arietansの毒液）
が、直接又はα2-AP／プラスミンとの相互作用のどちら
かを干渉することにより、プラズマ内のα2-APを阻害で
きるが、この効果がAMCHAにより強化されるかどうか
を、次の方法で確認した。
が、直接又はα2-AP／プラスミンとの相互作用のどちら
かを干渉することにより、プラズマ内のα2-APを阻害で
きるが、この効果がAMCHAにより強化されるかどうか
を、次の方法で確認した。
【００７１】「STACHROM α2-AP」法によるα2-APの測
定によって、５％未満のα2-APが、同時に添加される、
毒液とAMCHA の存在下で保温されたプラズマ内に認めら
れた。この観察により、AMCHAは毒液のα2-APに対する
阻害作用を強化すると結論できる。
定によって、５％未満のα2-APが、同時に添加される、
毒液とAMCHA の存在下で保温されたプラズマ内に認めら
れた。この観察により、AMCHAは毒液のα2-APに対する
阻害作用を強化すると結論できる。
【００７２】ＰＡＩの分析において、毒液がプラスミン
の生成の増加に非常に大きな作用を示し、この作用はAM
CHAの作用よりも大きいことがみとめられた（下記の表
５、表６及び表７を参照）。同様に毒液の作用は、ＰＡ
Ｉの有無に関係なく、AMCHAにより高められることが認
められた。
の生成の増加に非常に大きな作用を示し、この作用はAM
CHAの作用よりも大きいことがみとめられた（下記の表
５、表６及び表７を参照）。同様に毒液の作用は、ＰＡ
Ｉの有無に関係なく、AMCHAにより高められることが認
められた。
【００７３】
【表５】
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】α2-APが不十分なプラズマを使用する時、
プラスミンの生成は毒液の存在する場合大きく、AMCHA
の存在する場合はさらに大きい。この結果はGlu-プラス
ミンのLys-プラスミンへの転換と関連しており、AMCHA
がこの場合、毒液の作用高めないことが認められた（下
記の表８参照）。
プラスミンの生成は毒液の存在する場合大きく、AMCHA
の存在する場合はさらに大きい。この結果はGlu-プラス
ミンのLys-プラスミンへの転換と関連しており、AMCHA
がこの場合、毒液の作用高めないことが認められた（下
記の表８参照）。
【００７７】
【表８】
【００７８】実験例９ −α2-Mに対するメタロプロテイナーゼ作用物質の作用
− EACAのような物質は、生体内におけるプラズマ内にトロ
ンビンの生成を刺激するが、α2-Mの作用を阻害するこ
とが知られている〔 I.G. SLOAN et al.，Thromb. Re
s.，44，761〜769、(1986)参照〕。この現象は、EACAと
AMCHA のようなω−アミノ酸は末端アミングループを有
し、そしてメチルアミンのような化合物はこのような作
用を有すること知られているので、該末端アミングルー
プによりα2-APを阻害できると説明できる。
− EACAのような物質は、生体内におけるプラズマ内にトロ
ンビンの生成を刺激するが、α2-Mの作用を阻害するこ
とが知られている〔 I.G. SLOAN et al.，Thromb. Re
s.，44，761〜769、(1986)参照〕。この現象は、EACAと
AMCHA のようなω−アミノ酸は末端アミングループを有
し、そしてメチルアミンのような化合物はこのような作
用を有すること知られているので、該末端アミングルー
プによりα2-APを阻害できると説明できる。
【００７９】更にある種の毒液がα2-Mと共に保温され
る時、蛋白質加水分解活性を失うと言われている。しか
しまた、毒液プロテイナーゼとα2-Mとの錯体化を、α2
-Mのようなプロテイナーゼの基質の存在で阻止できるこ
とが知られている〔L.F.KRESS による上記の論文を参
照〕。
る時、蛋白質加水分解活性を失うと言われている。しか
しまた、毒液プロテイナーゼとα2-Mとの錯体化を、α2
-Mのようなプロテイナーゼの基質の存在で阻止できるこ
とが知られている〔L.F.KRESS による上記の論文を参
照〕。
【００８０】これらの状況を考慮すると、毒液（B. ari
etansの原毒液）のようなメタロプロテイナーゼ作用物
質が、ω−アミノ酸（AMCHA）と組み合わせて適当であ
れば、ＰＡＩの分析において有利な効果を有し得るかど
うか確認することが望まれた。このことを留意して、ア
プロチニンによる阻害後の残留プラズマを測定し、次の
ことが確認された。
etansの原毒液）のようなメタロプロテイナーゼ作用物
質が、ω−アミノ酸（AMCHA）と組み合わせて適当であ
れば、ＰＡＩの分析において有利な効果を有し得るかど
うか確認することが望まれた。このことを留意して、ア
プロチニンによる阻害後の残留プラズマを測定し、次の
ことが確認された。
【００８１】・アプロチニン（0.1TIU/ml）は精製プラ
スミンを阻害するが、毒液を阻害しない ・アプロチニンの存在によって生成したプラスミンは、
緩衝液系中で約 3％である ・プラズマ培地で生成し、α2-Mに結合したプラスミン
は、α2-APが存在しない場合でも、５％未満である。
スミンを阻害するが、毒液を阻害しない ・アプロチニンの存在によって生成したプラスミンは、
緩衝液系中で約 3％である ・プラズマ培地で生成し、α2-Mに結合したプラスミン
は、α2-APが存在しない場合でも、５％未満である。
【００８２】従って、α2-Mによる干渉は、α2-APの存
在しない場合でも、無視できることがわかった。
在しない場合でも、無視できることがわかった。
【００８３】得られた結果を下記表９と表１０にまため
た。表９は、α2-APは普通だが、ＰＡＩが欠けているプ
ラズマ内での、ウロキナーゼ（UPA）の存在する場合、
及びアプロチニンの存在下或は非存在下において生成し
たプラスミンの測定に関するものである。表１０は、α
2-APが欠けているプラズマ内での、ウロキナーゼ（UP
A）の存在する場合、及びアプロチニンの存在下或は非
存在下において生成したプラスミンの測定に関するもの
である。
た。表９は、α2-APは普通だが、ＰＡＩが欠けているプ
ラズマ内での、ウロキナーゼ（UPA）の存在する場合、
及びアプロチニンの存在下或は非存在下において生成し
たプラスミンの測定に関するものである。表１０は、α
2-APが欠けているプラズマ内での、ウロキナーゼ（UP
A）の存在する場合、及びアプロチニンの存在下或は非
存在下において生成したプラスミンの測定に関するもの
である。
【００８４】
【表９】
【００８５】
【表１０】
【００８６】実験例１０ −ｔＰＡ測定の至適条件ー ｔＰＡ測定の至適条件は毒液の濃度（牧畜農場により収
集され、供給されたB. artietansの粗毒液）によって得
られる。該濃度は ・反応混合物中で0.0125mg/mlを超える濃度（つまり、
緩衝液内で0.025mg/mlを超える濃度）、 ・特に望ましくは、反応混合物中で0.025mg/mlを超える
濃度（つまり、緩衝液内で0.050 mg/ mlを超える濃度）
である。
集され、供給されたB. artietansの粗毒液）によって得
られる。該濃度は ・反応混合物中で0.0125mg/mlを超える濃度（つまり、
緩衝液内で0.025mg/mlを超える濃度）、 ・特に望ましくは、反応混合物中で0.025mg/mlを超える
濃度（つまり、緩衝液内で0.050 mg/ mlを超える濃度）
である。
【００８７】プラスミンの最適な生成は、ガラス又はプ
ラスチックチューブ内の０〜４IU/mlのｔＰＡ範囲で、
2.50時間で得られる。その結果得られた検量線は線形で
ある（図８の曲線8Aを参照）。また、ｔＰＡが豊富なプ
ラズマを、ｔＰＡとＰＡＩを欠くプラズマで希釈されて
得られる曲線も線形である（図 8の曲線8Bを参照）。尚
図８において縦軸にＯＤ（405nm）、横軸にｔＰＡの濃
度（IU/ml）を示す。
ラスチックチューブ内の０〜４IU/mlのｔＰＡ範囲で、
2.50時間で得られる。その結果得られた検量線は線形で
ある（図８の曲線8Aを参照）。また、ｔＰＡが豊富なプ
ラズマを、ｔＰＡとＰＡＩを欠くプラズマで希釈されて
得られる曲線も線形である（図 8の曲線8Bを参照）。尚
図８において縦軸にＯＤ（405nm）、横軸にｔＰＡの濃
度（IU/ml）を示す。
【００８８】静脈鬱血後得られた毒液の存在する場合の
プラズマに関して認められた結果は、毒液の存在しない
場合の真正グロブリンに関して認められた結果と類似し
ている（下記の表１１を参照）。
プラズマに関して認められた結果は、毒液の存在しない
場合の真正グロブリンに関して認められた結果と類似し
ている（下記の表１１を参照）。
【００８９】
【表１１】
【００９０】静脈鬱血前は、ｔＰＡの測定値は他のプラ
スミノーゲン活性化因子、特にファクターＸIIに依存す
るルートに関連するものと共に評価されるので、結果は
真正グロブリンの方が高い。これらの他の活性化因子
は、真正グロブリンの生産中において活性化される。
スミノーゲン活性化因子、特にファクターＸIIに依存す
るルートに関連するものと共に評価されるので、結果は
真正グロブリンの方が高い。これらの他の活性化因子
は、真正グロブリンの生産中において活性化される。
【００９１】実験例１１ −ＰＡＩ分析の至適条件− ＰＡＩ分析の至適条件は、次の濃度で得られる。 ・10〜50 IU/mlのｕＰＡ（特に、１０IU/ml）又はｔＰ
Ａ（「STACHROM PAI」による分析通りの） ・プラスミノーゲンのバッチにかかわらず、反応混合物
において１〜４U/ml（特に、３U/ml）のプラスミノーゲ
ン ・反応混合物において0.4〜４mmol/l（好ましくは0.8mm
ol/l）のAMCHAまたは他のω−アミノ酸 ・プラズマにおいて0.1〜１mg/ml好ましくは0.24mg/ml
の毒液（好ましくはB.arietans の粗毒液） ・プラズマにおいて１〜５μmol/ml好ましくは3.5μmol
/mlの基質（プラスミン特異的な）。
Ａ（「STACHROM PAI」による分析通りの） ・プラスミノーゲンのバッチにかかわらず、反応混合物
において１〜４U/ml（特に、３U/ml）のプラスミノーゲ
ン ・反応混合物において0.4〜４mmol/l（好ましくは0.8mm
ol/l）のAMCHAまたは他のω−アミノ酸 ・プラズマにおいて0.1〜１mg/ml好ましくは0.24mg/ml
の毒液（好ましくはB.arietans の粗毒液） ・プラズマにおいて１〜５μmol/ml好ましくは3.5μmol
/mlの基質（プラスミン特異的な）。
【００９２】これらの条件で、プラスミンの最適な生成
は3 分間で得られ、基質の加水分解は３分間で実施され
る。プラズマがＰＡＩを欠いている〔ＰＡＩ含有量がゼ
ロである（PAI＝0 IU/ml）〕状態及びＰＡＩが豊富なプ
ラズマにおいて作成された検量線は、線形である（図９
参照）。図９は縦軸にＯＤ（405nm）、横軸にＰＡＩの
濃度（IU/ml）を示すものであり、直線9A、9B、9C及び9
Dは、B. arietans の毒液の 4種類のバッチにより得ら
れた。
は3 分間で得られ、基質の加水分解は３分間で実施され
る。プラズマがＰＡＩを欠いている〔ＰＡＩ含有量がゼ
ロである（PAI＝0 IU/ml）〕状態及びＰＡＩが豊富なプ
ラズマにおいて作成された検量線は、線形である（図９
参照）。図９は縦軸にＯＤ（405nm）、横軸にＰＡＩの
濃度（IU/ml）を示すものであり、直線9A、9B、9C及び9
Dは、B. arietans の毒液の 4種類のバッチにより得ら
れた。
【００９３】通常のプラズマと病理学上のプラズマ( 妊
娠している女性と術後の患者) に関して認められた結果
は、「STACHROM PAI」を用いた方法により認められたも
のと類似している。表１２において単位は、毒液が存在
する場合のウロキナーゼに対するＰＡＩのIU/ml とｔＰ
Ａに対する「STACHROM PAI」をもちいて測定されるＰＡ
ＩのIU/ml である。しかし、PAI-2 がアンチ-tPA活性よ
り大きいアンチ-uPA活性を有するので、妊娠をした女性
で小さい相違が認められる（プラズマFを参照）。
娠している女性と術後の患者) に関して認められた結果
は、「STACHROM PAI」を用いた方法により認められたも
のと類似している。表１２において単位は、毒液が存在
する場合のウロキナーゼに対するＰＡＩのIU/ml とｔＰ
Ａに対する「STACHROM PAI」をもちいて測定されるＰＡ
ＩのIU/ml である。しかし、PAI-2 がアンチ-tPA活性よ
り大きいアンチ-uPA活性を有するので、妊娠をした女性
で小さい相違が認められる（プラズマFを参照）。
【００９４】
【表１２】
【００９５】試薬の用法 本発明を実施するにあたり次の通りの試薬を使用するこ
とが好ましい。
とが好ましい。
【００９６】−ｔＰＡ分析− ・DIAGNOSTICA STAGO からの分析キット「STACHROM PA
」の試薬 ・単独で凍結乾燥されるか又は、「STIMUGEN」で凍結乾
燥される（ヘビの毒液から成る）メタロプロテイナーゼ
作用物質 したがって、ビンの再構成は「STACHROM PA 」のパンフ
レットで説明されるものは同じである。メタロプロテイ
ナーゼの凍結乾燥用の賦形剤は、「STIMUNGEN 」に関し
て説明されたものである。
」の試薬 ・単独で凍結乾燥されるか又は、「STIMUGEN」で凍結乾
燥される（ヘビの毒液から成る）メタロプロテイナーゼ
作用物質 したがって、ビンの再構成は「STACHROM PA 」のパンフ
レットで説明されるものは同じである。メタロプロテイ
ナーゼの凍結乾燥用の賦形剤は、「STIMUNGEN 」に関し
て説明されたものである。
【００９７】−ＰＡＩ分析− ・ｔＰＡ : DIAGNOSTICA STAGOからの分析キット「STAC
HROM PA 」の試薬 ・ｕＰＡ( ウロギナーゼ) : 蒸留水2 mlと混合された、
20 IU/ボトル ・凍結乾燥結合剤 :リン酸塩緩衝液（100mM; pH9.0）及
び5g/lのBS ・防腐剤 : 50mg/lのゲンタマイシン ・蒸留水２mlと混合される、試薬 : −1 体積のpH7.5のリン酸塩緩衝液中の精製プラスミン −3 体積の蒸留水中の0.15mg/mlの濃度のメタロプロテ
イナーゼ作用物質（へびの毒液） −2 体積のリン酸塩緩衝液（50mM; pH7.5）、グリシン3
％及びNaCl0.9％を含む希釈溶液内において４mmol/lの
AMCHA（防腐剤：50mg/lのゲンタマイシン） ・基質：蒸留水２mlと混合される16.5μmol/ボトル（通
常のグリシン賦形剤を含む） ・グリシン３％、ラクトース１％、シュークロース１％
及びゲンタマイシン 50mg/lから成る媒体内で凍結乾燥された標準又は基準プ
ラズマ。
HROM PA 」の試薬 ・ｕＰＡ( ウロギナーゼ) : 蒸留水2 mlと混合された、
20 IU/ボトル ・凍結乾燥結合剤 :リン酸塩緩衝液（100mM; pH9.0）及
び5g/lのBS ・防腐剤 : 50mg/lのゲンタマイシン ・蒸留水２mlと混合される、試薬 : −1 体積のpH7.5のリン酸塩緩衝液中の精製プラスミン −3 体積の蒸留水中の0.15mg/mlの濃度のメタロプロテ
イナーゼ作用物質（へびの毒液） −2 体積のリン酸塩緩衝液（50mM; pH7.5）、グリシン3
％及びNaCl0.9％を含む希釈溶液内において４mmol/lの
AMCHA（防腐剤：50mg/lのゲンタマイシン） ・基質：蒸留水２mlと混合される16.5μmol/ボトル（通
常のグリシン賦形剤を含む） ・グリシン３％、ラクトース１％、シュークロース１％
及びゲンタマイシン 50mg/lから成る媒体内で凍結乾燥された標準又は基準プ
ラズマ。
【００９８】
【発明の効果】本発明は以上のように構成されておりプ
ラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの活性
を測定するにあたり、該測定を阻害するα2-アンチプラ
スミン及び／またはα2-マクログロブリンを特異的に阻
害することができるメタロプロテイナーゼ作用物質を添
加することにより、上記活性化因子及びその阻害剤の活
性を簡易にしかも正確に測定することができるようにな
った。
ラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの活性
を測定するにあたり、該測定を阻害するα2-アンチプラ
スミン及び／またはα2-マクログロブリンを特異的に阻
害することができるメタロプロテイナーゼ作用物質を添
加することにより、上記活性化因子及びその阻害剤の活
性を簡易にしかも正確に測定することができるようにな
った。
【図１】線維素溶解のメカニズムを示す図。
【図２】α2-APへのメタロプロテイナーゼの影響を示す
グラフ。
グラフ。
【図３】ｕＰＡ活性へのメタロプロテイナーゼの影響を
示すグラフ。
示すグラフ。
【図４】ｔＰＡ活性へのメタロプロテイナーゼの影響を
示すグラフ。
示すグラフ。
【図５】ＰＡＩへのメタロプロテイナーゼの影響を示す
グラフ。
グラフ。
【図６】メタロプロテイナーゼ存在下におけるＰＡＩの
ｔＰＡへの阻害作用を示すグラフ。
ｔＰＡへの阻害作用を示すグラフ。
【図７】AMCHA のプラスミン生成への影響を示すグラ
フ。
フ。
【図８】ｔＰＡの検量線を示すグラフ。
【図９】ＰＡＩの検量線を示すグラフ。
【図１０】ｔＰＡの分析手順を示す図。
【図１１】ＰＡＩの分析手順を示す図。
フロントページの続き (72)発明者 ジェラール・ケンタン フランス国 コロンベ 92700 リュ・ デ・ルヌイリエール 145 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/37 C12Q 1/56 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子及び／
或いはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、また
はこれらのインヒビターを測定する方法において、α 2 -
アンチプラスミン及び／又はα 2 -マクログロブリンを阻
害する物質を用いるにあたり、 前記阻害する物質として、メタロプロテイナーゼ作用物
質（metalloproteinase materials）を用いる ことを特
徴とするプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビ
ターの測定方法。 - 【請求項２】 上記のメタロプロテイナーゼ作用物質
が、少なくとも１つのω-アミノ酸と組み合わせて使用
される請求項１記載のプラスミノーゲン活性化因子及び
そのインヒビターの測定方法。 - 【請求項３】 （ｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子
とウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子よりなる群
から選択されるプラスミノーゲン活性化因子と、（ii）
該プラスミノーゲン活性化因子のインヒビターを測定す
る方法であって、プラスミノーゲン活性化因子によりプラスミノーゲンを
プラスミンへ転換させ、 メタロプロテイナーゼ作用物質によってα 2 -アンチプラ
スミン及び／又はα 2 -マクログロブリンを阻害しつつ、
前記プラスミンのアッセイを行うことを特徴とする プラ
スミノーゲン活性化因子及びそのインヒビタターの測定
方法。 - 【請求項４】 前記メタロプロテイナーゼ作用物質が、
分子量68,000のα2-アンチプラスミンを開裂し、α2-ア
ンチプラスミン活性を実質上欠く分子量約53,000のペプ
チドを生じる物質から選択される請求項１〜３のいずれ
かに記載のプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒ
ビターの測定方法。 - 【請求項５】 前記メタロプロテイナーゼ作用物質が毒
液（venoms）から選択される請求項１〜４のいずれかに
記載のプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビタ
ーの測定方法。 - 【請求項６】 前記メタロプロテイナーゼ作用物質がク
サリヘビ科及びガラガラヘビ科（families of the Vipe
ridae and Crotalidae）に属するヘビの毒液から選択さ
れる請求項１〜５のいずれかに記載のプラスミノーゲン
活性化因子及びそのインヒビターの測定方法。 - 【請求項７】 前記メタロプロテイナーゼ作用物質がBi
tis arietans、Crotalus basiliscus 及びLachesis mut
a の毒液から選択される請求項１〜６のいずれかに記載
のプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの
測定方法。 - 【請求項８】 組織プラスミノーゲン活性化因子を測定
するにあたり、(a)被検体のプラズマを緩衝液で希釈し
てこれにメタロプロテイナーゼ作用物質を添加し、(b)
得られた混合物を２分間、37℃で保温し、(c)プラスミ
ノーゲンのプラスミンへの転換を刺激する物質を添加
し、(d)これを150分間、37℃で保温し、(e)プラスミン
特異的発色源基質を添加し、(f)混合物を５分間37℃で
保温した後、前記被検体のプラズマに代えて緩衝液を用
いたブランクと比較して、発色団の放出に対応する光密
度の読み取りを行う請求項１〜７のいずれかに記載のプ
ラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの測定
方法。 - 【請求項９】 前記(a)段階の代わりに前記(c)段階でメ
タロプロテイナーゼ作用物質が添加される請求項８記載
の測定方法。 - 【請求項１０】 組織プラスミノーゲン活性化因子イン
ヒビターを測定するにあたり、(a)組織プラスミノーゲ
ン活性化因子又はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化
因子に、被検体のプラズマを添加し、(b)この混合物を
２分間、37℃で保温し、(c)プラスミノーゲン、ω−ア
ミノ酸及び上記メタロプロテイナーゼ作用物質を添加
し、(d)これを３分間、37℃で保温し、(e)プラスミン特
異的発色源基質を添加し、(f)得られた混合物を３分
間、37℃で保温した後、前記組織プラスミノーゲン活性
化因子又は前記ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因
子に代えて緩衝液を用いたブランクと比較して、発色団
の放出に対応する光密度の読み取りを行う請求項１〜７
のいずれかに記載の測定方法。 - 【請求項１１】 組織プラスミノーゲン活性化因子又は
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、或はプラス
ミノーゲン活性化因子インヒビターを測定するためのキ
ットであって、少なくとも１種以上のメタロプロテイナ
ーゼ作用物質を含有しているキットを用いることを特徴
とするプラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビタ
ーの測定用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9005808 | 1990-05-10 | ||
| FR9005808A FR2661920B1 (fr) | 1990-05-10 | 1990-05-10 | Procede de determination d'un activateur du plasminogene et de son inhibiteur. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328997A JPH05328997A (ja) | 1993-12-14 |
| JP2966968B2 true JP2966968B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=9396452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3135977A Expired - Fee Related JP2966968B2 (ja) | 1990-05-10 | 1991-05-10 | プラスミノーゲン活性化因子及びそのインヒビターの測定方法、並びにその測定用キット |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5472851A (ja) |
| EP (1) | EP0456567B1 (ja) |
| JP (1) | JP2966968B2 (ja) |
| DE (1) | DE69128557T2 (ja) |
| FR (1) | FR2661920B1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1277904B1 (it) * | 1995-08-07 | 1997-11-12 | Polifarma Spa | Metodo per determinare l'attivita' terapeutica di composti inibitori di metalloproteinasi, nuovi composti inibitori, e loro impiego |
| US6057297A (en) * | 1996-08-06 | 2000-05-02 | Polifarma S.P.A. | Inhibitor compounds of zinc-dependent metalloproteinases associated with pathological conditions, and therapeutic use thereof |
| WO2000065349A2 (en) * | 1999-04-28 | 2000-11-02 | Cardiogenics Inc. | Method for determining plasminogen activator inhibitor |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2440254A1 (de) * | 1973-08-27 | 1975-03-06 | Pentapharm Ag | Unloesliches enzympraeparat und verfahren zu dessen herstellung |
| JPS5569595A (en) * | 1978-11-20 | 1980-05-26 | Suguru Abe | Novel substance having fibrinolytic activity, remedy for thrombotic embolic disease comprising it, and its preparation |
| NL8003402A (nl) * | 1980-06-11 | 1982-01-04 | Leuven Res & Dev Vzw | Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. |
| US4640835A (en) * | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
| US4629694A (en) * | 1983-07-12 | 1986-12-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detecting and distinguishing between plasminogen activators |
| US4661453A (en) * | 1984-06-19 | 1987-04-28 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Production of tissue plasminogen activator factor |
| ATE83153T1 (de) * | 1985-09-10 | 1992-12-15 | Eisai Co Ltd | Einen gewebe-plasminogen-aktivator enthaltende zusammensetzung. |
| US4999194A (en) * | 1988-01-14 | 1991-03-12 | Collaborative Research, Inc. | Two-chain urokinase plasminogen activators for treatment of thrombotic disease |
| US5073626A (en) * | 1988-11-09 | 1991-12-17 | Monsanto Company | Affinity purification of plasminogen activator inhibitor I using a modified urokinase |
-
1990
- 1990-05-10 FR FR9005808A patent/FR2661920B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-06 EP EP91401181A patent/EP0456567B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-06 DE DE69128557T patent/DE69128557T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-10 US US07/698,314 patent/US5472851A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-10 JP JP3135977A patent/JP2966968B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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