FI93494B - Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi - Google Patents

Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI93494B
FI93494B FI894303A FI894303A FI93494B FI 93494 B FI93494 B FI 93494B FI 894303 A FI894303 A FI 894303A FI 894303 A FI894303 A FI 894303A FI 93494 B FI93494 B FI 93494B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
aptt
plasma
blood
glycylglycine
coagulation factors
Prior art date
Application number
FI894303A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI93494C (fi
FI894303A0 (fi
FI894303A (fi
Inventor
Masayasu Enomoto
Original Assignee
Nippon Shoji Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Shoji Kk filed Critical Nippon Shoji Kk
Publication of FI894303A0 publication Critical patent/FI894303A0/fi
Publication of FI894303A publication Critical patent/FI894303A/fi
Publication of FI93494B publication Critical patent/FI93494B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI93494C publication Critical patent/FI93494C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/106664—Blood serum or blood plasma standard or control
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2525—Stabilizing or preserving

Description

t 93494
Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi.
5 On tunnettua, että veren hyytyminen sisältää sekä sisäsyntyisiä että ulkoisia reaktioita ja että monet hyytymistekijät osallistuvat näihin reaktioihin. Ja hyytymistekijöiden reaktioiden tarkka määritys näytteessä on eräs kliinisten kokeiden tärkeistä kohdista. Mutta monet 10 näistä hyytymistekijöistä ovat proteiineja ja saattavat helposti denaturoitua. Näissä erityisesti tekijöiden V ja VIII tiedetään inaktivoituvan helposti. Monissa tapauksissa tekijöiden pysymättömyys aiheuttaa ongelmia kliinisissä kokeissa. Esimerkiksi on sanottu, että hyytymis-15 kokeeseen tarkoitettua näytettä tulisi säilyttää 2-8 °C:ssa ja että koe tulisi suorittaa neljän tunnin sisällä verinäytteen otosta. Lisäksi kokeessa käytettävä kaupallisesti saatavissa oleva kontrolliplasma (kylmäkuivattu tuote) säilyy vain yhden päivän jääkaapissa säilytettynä 20 sen jälkeen, kun se on liuotettu. Koereagensseinä käytettävien erilaisten hyytymistekijöitä sisältämättömien plasmojen pysyvyydet ovat hyvin huonoja, ja monet niistä säilyvät vain muutamia tunteja jääkaapissa säilytettynä, eikä niitä saa jäädyttää.
'*;25 Jos näitä pysymättömiä veren hyytymistekijöitä voi daan stabiloida, on mahdollista helpottaa näytteen säilytysolosuhteiden ja säilytysajan rajoituksia verinäytteen oton jälkeen samoin kuin kontrolliplasman ja erilaisten hyytymistekijöitä sisältämättömien plasmojen säilytys-30 olosuhteiden ja säilyvyysajan rajoituksia. Tämä on erit-•i täin edullista kliinisten kokeiden sekä teollisten tarkoi tusten kannalta. Niinpä on ollut kysyntää kehittää menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi.
Toisaalta monien erilaisten proteiinien, mukaan 35 lukien entsyymit, stabilointia koskevia tutkimuksia on tehty. Kuitenkin aineet, joilla on stabiloivia vaikutuk- 2 93494 siä proteiineihin, eroavat huomattavasti toisistaan proteiinien lajin ja alkuperän mukaan ja tällä hetkellä kullakin proteiinilla on itsenäisesti omat spesifiset aineensa, jotka niitä stabiloivat.
5 Veren hyytymistekijöiden stabilointia koskien on ehdotettu tiettyjä tekijöitä, esimerkiksi tekijöitä VIII, IX ja XIII, sisältäviä hyytymistekijävalmisteita, joissa nämä tekijät on stabiloitu käyttäen albumiinia, dekstraa-nia, sokereita, aminohappoja, orgaanisia karboksyylihap-10 poja ja neutraaleja suoloja, kuten NaCl:a, KCl:a ja vastaavia (JP-patenttijulkaisut Kokai nrot 56-127 308, 56- 135 418, 58-74 617, 59-134 730, 60-199 829, 61-60 414, 62-10 019 ja 62-195 331). Ne on kuitenkin tarkoitettu stabiloimaan hyytymistekijöitä valmisteessa olevien virusten 15 inaktivoimiseksi suoritetun lämpökäsittelyn aikana, ja niinpä niitä lisätään erittäin korkeita pitoisuuksia. Jos tällaista ainetta, esim. aminohappoa, kuten glysiiniä, alaniinia tai vastaavia, lisätään vereen tai plasmaan suuri pitoisuus, esimerkiksi 10 % tai enemmän, itse hyytymis-20 reaktio inhiboituu veren hyytymiskokeessa, eikä haluttua hyytymiskoetta voida suorittaa. Lisäksi yllä oleva ehdotus koskee vain tiettyjä hyytymistekijöitä, eivätkä valmisteet sisällä monia muita veren komponentteja. Siten ehdotus ei koske plasmaa eikä verta, jotka sisältävät •;25 kaikki tai osan hyytymisreaktioihin osallistuvista tekijöistä tai joista osa niistä puuttuu.
Tämän keksinnön keksijät ovat tehneet ahkerasti tutkimustyötä löytääkseen menetelmän veren tai plasman monien veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi, jolla 30 menetelmällä ei olisi epäsuotuisaa vaikutusta hyytymis-·: reaktioon. Tuloksena on keksitty, että hyytymistekijöitä voidaan huomattavasti stabiloida lisäämällä dipeptidiä glysyyliglysiini ja/tai tripeptidiä glysyyliglysyyligly-siini vereen tai plasmaan.
35 Tämän keksinnön tärkein kohde on antaa käyttöön menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi.
3 93494 Tämä kohde samoin kuin muut tämän keksinnön kohteet ja edut selviävät alan asiantuntijoille seuraavasta kuvauksesta.
Tämän keksinnön mukaisesti käyttöön annetaan mene-5 telmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että vereen tai plasmaan lisätään stabiloivaksi aineeksi 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyy-liglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä. Määrä on sellainen, ettei sillä ole vaikutusta veren hyytymisai-10 kaan.
Edelleen tämä keksintö antaa käyttöön kontrolli-plasman, joka sisältää veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä.
15 Lisäksi tämä keksintöä antaa käyttöön reagenssin veren hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi, joka reagenssi sisältää plasmaa, josta hyytymistekijät puuttuvat tai josta ne on poistettu ja joka sisältää veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena 0,1 20 - 4,0 % (w/v) glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyli glysiiniä.
Tässä keksinnössä käytettävät glysyyliglysiini ja glysyyliglysyyliglysiini ovat peptidejä, joissa kaksi ja vastaavasti kolme aminohappoa on sitoutunut yhteen, ja ne ''.25 eroavat aineista, joita on käytetty tunnetuissa stabiloin-timenetelmissä. Tähän asti ei alalla aikaisemmin ole ollut tunnettua, että näitä aineita voidaan käyttää ei vain tiettyjen hyytymistekijöiden vaan myös kaikkien hyytymistekijöiden stabilointiin.
30 Veren hyytymistekijät jaetaan sisäsyntyiseen hyy- •j tymisreaktioreittiin, jossa hyytymisreaktio alkaa koske tuksesta vieraan aineen pinnan kanssa, osallistuviin tekijöihin ja ulkoiseen hyytymisreaktioreittiin, jossa hyy-tymisreaktion aloittaa kudoksen tromboplastiini, osallis-35 tuviin tekijöihin. Tämä keksintö pyrkii stabiloimaan kaikki molempiin reaktioreitteihin osallistuvat tekijät, ja 4 93494 nämä tekijät stabiloidaan lisäämällä vereen tai plasmaan glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä.
Tämä tarkoittaa, että tämän keksinnön mukainen sta-bilointimenetelmä suoritetaan lisäämällä glysyyliglysii-5 niä, glysyyliglysyyliglysiiniä tai molempia stabiloitavaan systeemiin. Näiden aineiden pitoisuus on esimerkiksi 0,1 - 2,0 % (w/v), edullisesti 0,5 - 1,0 % (w/v) silloin, kun stabiloitava systeemi on veri (kokoveri). Kun pitoisuus on alle 0,1 %, stabiloivaa vaikutusta ei saada. Toisaalta 10 1,5 %:n pitoisuudella havaitaan lievää hemolyysiä ja hemo- lyysi tulee merkittävämmäksi pitoisuutta lisättäessä. Lisäksi hyytymisaika (protrombiiniaika, (PT) tai aktivoitu partiaalinen hyytymisaika (APTT)) pyrkii myös pitenemään asteittain 1,5 %:n tai sitä suuremmalla pitoisuudella.
15 Niinpä 2 %:a suurempi pitoisuus ei ole edullinen. Kun molempia aineita käytetään yhdessä, kunkin aineen määrä voidaan valita sopivasti ja yllä määritelty pitoisuus vastaa niiden summaa. Silloin kun stabiloitava systeemi on plasma, pitoisuus on 0,1 - 4,0 % (w/v), edullisesti 0,5 -20 2,0% (w/v). Kun pitoisuus on alle 0,1 %, stabiloivaa vai kutusta ei saada. Vaikka hyytymisaika asteittain pitenee 2,0 %:n tai sitä korkeammalla pitoisuudella, stabiloiva vaikutus havaitaan yhä. Stabiloinnin tarkoituksesta riippuen ei edes 4,0 %:n (w/v) pitoisuus aiheuta ongelmia. Kun : 25 pitoisuus on suurempi kuin 4,0 %, hyytymisaika pitenee liikaa, eikä se ole edullista. Samoin plasman ollessa kyseessä, kun molempia aineita käytetään yhdessä, kummankin aineen määrä voidaan valita sopivasti ja yllä määritelty pitoisuus vastaa niiden summaa.
30 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamisek- : si glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini lisä tään vereen esimerkiksi yhdessä verinäytteen otossa hyytymistä ehkäisevänä aineena käytetyn aineen kanssa tai lisätään vereen liuottamalla ne hyytymistä ehkäisevän ai-35 neen liuokseen. Vaihtoehtoisesti glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini voidaan lisätä vereen, johon hyy- 5 93494 tyrnistä ehkäisevä aine on jo lisätty. Esimerkkejä verinäytteen otossa käytetyistä hyytymistä ehkäisevistä aineita ovat natriumsitraatti, oksaanihappo, EDTA ja vastaavat. Glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini 5 kiinteässä muodossa tai vesiliuoksena voidaan myös lisätä plasmaan, joka saadaan sentrifugoimalla veri, johon hyytymistä ehkäisevä aine on jo lisätty.
Tämän keksinnön mukaista menetelmää käytetään pääasiassa otettaessa verinäyte potilaasta hyytymiskokeen 10 suorituspaikassa tai sen jälkeen, kun verinäyte on otettu potilaasta hyytymiskokeen suorittamiseksi. Edelleen glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini voidaan lisätä vereen tai plasmaan valmistettaessa teollisesti kont-rolliplasmaa ja erilaisia hyytymistekijöitä sisältämät-15 tömiä plasmoja käytettäväksi reagensseina hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Niitä voidaan esimerkiksi käyttää valmistettaessa normaalia ja epänormaalia kontrolliplasmaa, erilaisia hyytymistekijöitä sisältämättömiä plasmoja, kuten tekijöitä I, II, V, VII, 20 VIII, IX, X, XI, XII ja vastaavasti XIII sisältämättömiä plasmoja, plasmaa, josta on poistettu proteiini C, plasmaa, josta on poistettu antitrombiini III, ja vastaavia plasmoja.
Niinpä tämä keksintö antaa käyttöön myös kontrol-25 liplasman ja reagenssin veren hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi, jotka kontrolliplasma ja reagenssi sisältävät glysyyliglysiiniä ja/tai glysyy-liglysyyliglysiiniä veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena. Nämä kontrolliplasmat ja reagenssit voidaan val-30 mistaa sekoittamalla glysyyliglysiini ja/tai glysyyligly-syyliglysiini muiden tavanomaisten komponenttien kanssa yllä kuvattuna pitoisuutena tavanomaisen menetelmän mukaisesti. Ne voivat olla nestemäisinä valmisteina, konsentroituina nestemäisinä valmisteina, kylmäkuivattuina 35 tuotteina ja vastaavissa muodoissa. Lisäksi ne voivat olla testipakkausten muodossa.
6 93494 Tämän keksinnön mukaisesti näyteplasman käsittely paikassa, jossa kliininen koe suoritetaan, helpottuu. Lisäksi erilaisten hyytymistekijöitä sisältämättömien plasmojen säilyvyysaikaa voidaan pienentää tappioiden mini-5 moimiseksi.
Seuraavat esimerkit valaisevat edelleen tätä keksintöä yksityiskohtaisesti, mutta niitä ei tule pitää sen suoja-alaa rajoittavina.
Esimerkki 1 10 Lisäys plasmaan (1) Glysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus
Normaalihenkilöltä otettuun vereen (9 tilavuutta) sekoitettiin 3,2 % trinatriumsitraattiliuosta (1 tilavuus) ja seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 3 000 -15 rpm kymmenen minuuttia, jolloin saatiin plasma. Plasmaan lisättiin 0 %:sta (kontrolli) 4 %:iin (w/v) glysyyligly-siiniä ja hyytymisaika mitattiin stabiloivan vaikutuksen hyytymistekijöihin määrittämiseksi. Protrombiiniajan (PT) mittaus ulkoisten hyytymistekijöiden (II, V, VII ja X) in-20 aktivoitumisen määrittämiseksi sekä aktivoidun partiaali-sen tromboplastiiniajan (APTT) mittaus sisäsyntyisten hyytymistekijöiden (XII, XI, IX, VIII, prekallikreiini ja suurimolekyylinen kininogeeni) inaktivoitumisen määrittämiseksi suoritettiin päivinä 0, 4, 8 ja 12.
: 25 Tulokset on esitetty taulukossa 1.
PT:n ja APTT:n mittaus suoritettiin seuraavasti: PT:n mittaus
Plasmaan (0,1 ml), jota oli aikaisemmin kuumennettu 37 °C:ssa kaksi minuuttia, lisättiin tromboplastiini-30 reagenssia (Thrombomat, bioMdrieux S.A. -yhtiö. Ranska), : joka oli lämmitetty 37 °C:ksi, (0,2 ml) hyytymisreaktion aloittamiseksi ja hyytymisaika (sekunteina) mitattiin.
APTT:n mittaus
Plasma (0,1 ml) ja APTT-reagenssi (Actimat, bio-35 Mörieux S. A. -yhtiö, Ranska) (0,1 ml) sekoitettiin ja seosta kuumennettiin 37 eC:ssa kolme minuuttia. Tähän lisättiin 25 mmol/1 kalsiumkloridia, joka oli lämmitetty 7 93494 37 eC:ksi, (0,1 ml) hyytymisreaktion aloittamiseksi ja hyytymisaika (sekunteina) mitattiin.
Hyytymisajan mittaus suoritettiin käyttäen Option 8 -veren hyytymisen mittauslaitetta (bioM6rieux S. A.-5 yhtiö. Ranska), joka toteaa hyytymisen loppupisteen mittaamalla optisesti turbiditeetin muutosta.
TAULUKKO 1
Glysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus 10 (säilytys 25 °C:ssa)
Pitoisuus Määri- (%) tys Päivä 0 Päivä 4 Päivä 8 Päivä 10 o PT 11,4 14,6 17,9 22.4 15 APTT 37,3 55,1 77J9 131,8 0,02 PT 11,3 13,7 16,8 22,1 APTT 37,4 54,7 79,8 127,3 0,05 PT 11,3 14,1 17,4 23,9 APTT 37,0 56,1 61,9 134,3 20 0,1 PT 11,3 13,5 15,9 19,7 APTT 36,5 54,3 63,4 99,7 0,2 PT 11,1 12,7 14,8 19,0 APTT 35,5 54,6 60,2 91,4 0,5 PT 11,3 11,8 12,5 15,2 : 25 APTT 33,0 48,1 50,9 75,4 1.0 PT 11,5 12,3 12,7 14,2 APTT 33,2 44,1 38,3 60,1 2.0 PT 12,4 12,6 11,8 11,9 APTT 37,1 43,7 43,6 58,9 30 3,0 PT 13,5 13,2 11,7 11,9 • APTT 46,5 50,5 52,4 63,6 4.0 PT 14,7 14,5 12,9 11,9 APTT 58,7 58,3 51,4 63,6 (sekuntia) 8 93494
Kuten taulukosta 1 nähdään, kontrollin PT (glysyy-liglysiiniä 0 %) pitenl 11,4 sekunnista 22,4 sekuntiin 25 eC:ssa 12 päivän aikana ja sen APTT piteni 37,4 sekunnista 131,8 sekuntiin. Hyytymistekijöiden inaktivoitumista 5 havaittiin. Samoin stabiloivaa vaikutusta ei havaittu alle 0,1 %:n pitoisuudella. Toisaalta stabiloiva vaikutus havaittiin yli 2 %:n pitoisuudella. Hyytymisaika kuitenkin piteni glysyyliglysiinin lisäyksen johdosta. Nimittäin päivän 0 kontrollin (glysyyliglysiini 0 %) PT oli 11,4 10 sekuntia ja sen APTT oli 37,3 sekuntia. Lisättäessä 3 % glysyyliglysiiniä PT piteni 13,5 sekuntiin ja APTT piteni 46,5 sekuntiin. Tästä pidentymisestä johtuen yli 4 %:n pitoisuus ei ole edullinen. Lisättäessä 1 % glysyyliglysiiniä PT piteni 11,5 sekunnista 14,2 sekuntiin 25 eC:ssa 15 12 päivän aikana ja APTT piteni 33,2 sekunnista 60,1 se kuntiin. Kuitenkin kontrolliin verrattuna tämä piteneminen oli vähäistä ja todettiin, että hyytymistekijöiden in-aktivoituminen inhiboitui.
Näiden hyytymisaikojen mukaisesti todetaan, että 20 kontrolliin verrattuna hyytymistekijät stabiloituvat kolminkertaisesti tai enemmän PT:ssä ja kaksinkertaisesti tai enemmän APTT:ssä.
(2) Glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus
Esimerkin 1 (1) mukaisella tavalla mitattiin PT ja . 25 APTT glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutuksen määrittämiseksi .
Tulokset on esitetty taulukossa 2.
• · 9 93494 TAULUKKO 2
Glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus (säilytys 25 °C:ssa)
Pitoi- 5 suu8 Määri- («) tys Päivä 0 Päivä 4 Päivä 8 Päivä 10 0 PT 10.5 13,6 16.1 21,9 APTT 29,9 43,7 54,5 101,1 0,02 PT 10,4 13,1 15,5 21,3 10 APTT 29,8 45,0 56,0 109,5 0,05 PT 10.4 13,4 15,7 22,3 APTT 28|3 43,4 40,5 93,5 0,1 PT 10,2 12,8 14,5 20.1 APTT 28,1 44,1 39,2 81,5 15 0.2 PT 10,4 12,5 14,1 18,9 APTT 27,3 40,2 42,8 77,5 0,5 PT 10,5 12,3 13,2 14,4 APTT 26,2 37,8 37,9 51,8 1.0 PT 10,8 11,4 11,6 13,1 20 APTT 25,8 37,0 38,8 45,7 2.0 PT 12-0 12,5 11,0 11,7 APTT 29,4 37,5 40,8 43,1 3.0 PT 13,2 12,1 11,1 12,1 APTT 36,8 40,4 43,4 58,2 : or 4t° PT 14,3 13i° 14»8 16,7 ' APTT 46,0 44,5 39,6 54,7 (sekuntia)
Kuten taulukossa 2 nähdään, kontrollin (glysyyli-30 glysyyliglysiini 0 %) PT piteni 10,5 sekunnista 21,9 sekuntiin 25 °C:ssa 12 päivän aikana ja sen APTT piteni 29,9 sekunnista 101,1 sekuntiin. Toisaalta lisättäessä 1 % gly-syyliglysyyliglysiiniä PT piteni 10,8 sekunnista 13,1 sekuntiin ja APTT piteni 25,8 sekunnista 45,7 sekuntiin.
35 Kontrolliin verrattuna tämä piteneminen on vähäistä ja todettiin, että hyytymistekijöiden inaktivoituminen inhiboitu!. Stabiloivaa vaikutusta ei havaittu alle 0,1 %:n 10 93494 pitoisuudella. Pitenemisen johdosta yli 4 %:n pitoisuus ei ollut edullinen.
Näiden hyytymisaikojen mukaisesti todetaan, että kontrolliin verrattuna hyytymistekijät stabiloituvat kol-5 minkertaisesti tai enemmän PT:ssä ja kaksinkertaisesti tai enemmän APTT:ssä.
Näiden tulosten mukaan on selvää, että glysyyli-glysiiniä ja glysyyliglysyyliglysiiniä voidaan käyttää kaikkien veren hyytymistekijöiden stabilointiin plasmassa. 10 Esimerkki 2
Lisäys vereen (1) Glysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus
Normaalihenkilöltä otettuun vereen (9 tilavuutta) sekoitettiin 3,2 % trlnatriumsitraattia (1 tilavuus) ja 15 saatuun kokovereen lisättiin glysyyliglysiiniä. Liuotuksen jälkeen seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 3 000 rpm 10 minuuttia, jolloin saatiin plasma. Kontrolleiksi saman kokoveren sentrifugoinnin jälkeen plasman saamiseksi tähän plasmaan lisättiin glysyyliglysiiniä. Esimerkin 1 mukai-20 sella tavalla määritettiin vaikutukset hyytymisaikoihin (PT ja APTT).
Tulokset esitetty taulukossa 3.
TAULUKKO 3 25 Glysyyli- * glysiini Kokoveri (Plasma) Kokoveren (% w/v) (s) (s) hemolyysi 0 PT 10,2 10,3 ei hemolyysiä APTT 26,6 26,3 30 0,2 PT 10,0 10,2 ei hemolyysiä APTT 25,6 24,8 • · 0,5 PT 10.3 10,4 ei hemolyysiä APTT 24,7 24,7 1,5 PT 11,6 11,4 lievä hemolyysi 35 APTT 26,2 27,0 4,0 PT 15,0 13,8 voimakas hemo- APTT 46,9 42,9 lyysi
II
11 93494
Kuten taulukossa 3 nähdään, lisättäessä kokovereen 4.0 % glysyyliglysilnlä havaittiin voimakas hemolyysi ja hyytymisajat pitenivät. Tämän pitenemisen katsottiin johtuvan hemolyysistä. Havaittiin melkein samanlainen stabi- 5 loiva vaikutus kuin esimerkissä 1.
(2) Glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus Esimerkin 2 (1) mukaisella tavalla glysyyliglysyy-liglysiiniä lisättiin kokovereen ja sen vaikutus hyytymis-aikoihin (PT ja APTT) määritettiin.
10 Tulokset on esitetty taulukossa 4.
TAULUKKO 4
Glysyyli- glysyyli 15 glysiini Kokoveri (Plasma) Kokoveren (% w/v) (s) (s) hemolyysi 0 PT li,i 11,2 ei hemolyysiä APTT 36)5 35,0 0,2 PT 11,2 11.2 ei hemolyysiä 20 APTT 36,2 34,3 0,5 PT 11.3 11,4 ei hemolyysiä APTT 35,6 33,8 1,5 PT 12,6 12,6 lievä hemolyysi APTT 36,3 36,7 25 4,0 PT 16,6 15,8 voimakas hemo- APTT 63,7 64,6 lyysi
Kuten taulukosta 4 nähdään, lisättäessä kokovereen 4.0 % glysyyliglysyyliglysiiniä havaittiin voimakas hemo-30 lyysi. Havaittiin melkein samanlainen stabiloiva vaikutus * kuin esimerkissä 1.
Esimerkki 3
Glysyyllglysiinin ja glysyyliglysyyliglysiinin yhdistelmän vaikutus 35 Kun kaupallisesti saatavissa oleva jäätynyt plasma oli sulatettu huoneenlämpötilassa, sitä sentrifugoitiin 12 93494 kierrosnopeudella 3 000 rpm 10 minuuttia sakan poistamiseksi. Saatuun plasmaan lisättiin glysyyliglysiinin ja glysyyliglysyyliglysiinin seos suhteessa 3:0, 2:1, 1:2 tai 0:3 siten, että seoksen pitoisuudeksi plasmassa tuli 1,5 % 5 (w/v) ja seos liuotettiin.
Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla mitattiin hyytymis-ajat (PT ja APTT) käyttäen plasmaa, johon ei lisätty gly-syyliglysiiniä eikä glysyyliglysyyliglysilniä, kontrollina näiden aineiden yhdistelmän vaikutuksen määrittämiseksi. 10 Tulokset on esitetty taulukossa 5.
TAULUKKO 5
Yhdistelmän vaikutus (säilytys 25 °C:ssa) 15 Glysyyligly- Päivä 0 Päivä 6 Päivä 10 siini:gly-syyliglysyyli-
glysiini PT APTT PT APTT PT APTT
Kontrolli 20 ei lisäystä) 12,4 36,9 15,2 45,6 17,4 89,4 3 : 0 13,2 38,6 13,2 37,6 13,0 38,6 2 ; 1 12,9 38,0 13,3 37,3 13,3 37,0 25 1*2 12,9 36,3 13,1 36,6 12,5 38,9 0:3 12,7 36,7 13,0 37,0 13,7 37,6 (sekuntia)
Kuten taulukosta 5 nähdään stabiloiva vaikutus ha-30 vaittiin yhdistämällä glysyyliglysiini ja glysyyliglysyy-*: liglysiini (2:1 tai 1:2) samoin kuin käytettäessä näitä aineita yksinään (3:0 tai 0:3).
Esimerkki 4 0,5 % (w/v) glysyyliglysiiniä lisättiin plasmaan, 35 josta antitrombiini lii (AT III) oli poistettu, käytettäväksi antitrombiini III:n (PCT/JP89/00173) biologisen ak-
II
13 93494 tiivisuuden määrityksessä ja sen stabiilius määritettiin seuraavasti.
Plasma, josta AT lii oli poistettu, jäädytettiin ja säilytettiin pakastimessa. Se sulatettiin jokaisena 5 mittauspäivänä.
Analyytin (AT III) sijasta lisättiin Michaelis-pus-kuria (50 μΐ) plasmaan, josta AT III oli poistettu, (100 μΐ) ja saatua seosta inkuboitiin 37 eC:ssa kaksi minuuttia. Erikseen kaupallisesti saatavissa oleva PT-rea-10 genssi laimennettiin 10-kertaisesti 25 mmol/1 kaliumklori-diliuoksella, joka sisälsi 10 U/ml hepariinia, reaktion aloitusliuoksen saamiseksi. Tämä liuos 37 °C:ksi lämmitettynä (200 μΐ) lisättiin yllä olevaan plasmaan ja hyytymis-aika määritettiin.
15 Tulokset on esitetty taulukossa 6.
TAULUKKO 6
Plasman, josta AT III on poistettu, stabilointi Näyte Päivä 0 Päivä 1 Päivä 4 Päivä 7 20 Ei lisäystä 29,1 35,9 40,4 77,4
Glysyyligly- siini 0,5 % 28,9 32,5 29,4 28,1 (sekuntia) 25 Kuten taulukosta 6 nähdään, kun glysyyliglysiiniä ei lisätty, hyytymisaika piteni 29,1 sekunnista 77,4 sekuntiin seitsemän päivän aikana. Toisaalta kun 0,5 glysyyliglysiiniä lisättiin, hyytymisajan ei havaittu pitenevän ja huomattava stabiloiva vaikutus havaittiin.
30 Tämä osoittaa, että reagenssin ominaisuudet säily vät stabiileina.
• Esimerkki 5 Tämä esimerkki suoritettiin sen tutkimiseksi, saataisiinko vai eikö saataisi esimerkeissä 1-4 esitetty 35 huomattava glysyyliglysiinin ja glysyyliglysyyliglysiinin 93494 14 stabiloiva vaikutus hyytymistekijöihin aminohapoilla ja sokerilla.
0,5 % (w/v) glysiiniä, alaniinia tai natriumas- partaattia tai 1,0 % (w/v) mannitolia, maltoosia tai sak-5 karoosia lisättiin kaupallisesti saatavissa olevaan säilytettyyn plasmaan ja verrattiin kontrolliin (ei lisäystä) ja glysyyliglysiiniin (0,5 %). Tässä esimerkissä jäädytys ja sulatus toistettiin joka päivä stabiiliuden määrittämiseksi .
10 Tulokset on esitetty taulukossa 7.
TAULUKKO 7
Erilaisten aineiden lisäyksen vaikutuksen vertailu Aine Päivä 0 Päivä 7 Päivä 14
15 PT APTT PT APTT PT APTT
Kontrolli 13,1 47,9 14,1 52,9 17,6 >70
Glysyyliglysiini 13>3 45>6 45>2 13>e 53;0
Glysiini 0,5 % 13,0 47,0 13,3 52,0 14,9 >70 20 Alaniini 0,5 % 13,1 47,6 13,5 52,4 15,2 >70
Natrium- 13,0 50,9 13,6 56,6 15,9 >70 aspartaatti 0,5 % '
Manni toi i 1,0 % 13,2 47,2 14,1 53,2 16,8 >70
Maltoosi 1,0 % 13,6 47j8 14^4 54 9 17,7 >7o 25 Sakkaroosi 1,0 % 13,6 48,4 14,1 54,1 16,7 >70 (sekuntia)
Kuten taulukossa 7 nähdään, glysyyliglysiini stabiloi merkittävästi kontrolliin verrattuna. Mutta muiden 30 aineiden ollessa kyseessä APTT oli yli 70 sekuntia 14. päivänä ja oli sama kuin kontrollin. Siten stabiloivaa . .j vaikutusta ei havaittu. Lisäksi vaikka aminohappoja käy- • tettäessä havaittiin lievä stabiloiva vaikutus, vaikutus ei ollut yhtä merkittävä kuin glysyyliglysiinillä.
35 Niinpä todetaan, että glysyyliglysiinin ja glysyy- liglysyyliglysiinin vaikutus on spesifinen.

Claims (6)

93494
1. Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimi-seksi, tunnettu siitä, että vereen tai plasmaan 5 lisätään stabiloivaksi aineeksi 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyy-liglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabiloivaa ainetta lisätään vereen 0,5 - 1,0 % (w/v).
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabiloivaa ainetta lisätään plasmaan 0,5 - 2,0 % (w/v).
4. Kontrolliplasma, tunnettu siitä, että se sisältää veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena 15 0,1-4,0% (w/v) glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyy liglysiiniä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kontrolliplasma, tunnettu siitä, että stabiloivan aineen pitoisuus on 0,5 - 2,0 % (w/v).
6. Reagenssi veren hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseen, tunnettu siitä, että se sisältää plasmaa, josta hyytymistekijät puuttuvat tai josta ne on poistettu ja joka sisältää veren hyytymisin tekijöitä stabiloivana aineena 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyyli- 25 glysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä. t 93494
FI894303A 1988-09-12 1989-09-12 Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi FI93494C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP22794088 1988-09-12
JP63227940A JPH0650999B2 (ja) 1988-09-12 1988-09-12 血液凝固因子安定化法

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI894303A0 FI894303A0 (fi) 1989-09-12
FI894303A FI894303A (fi) 1990-03-13
FI93494B true FI93494B (fi) 1994-12-30
FI93494C FI93494C (fi) 1995-04-10

Family

ID=16868667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI894303A FI93494C (fi) 1988-09-12 1989-09-12 Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5147803A (fi)
EP (1) EP0359201B1 (fi)
JP (1) JPH0650999B2 (fi)
DE (1) DE68905117T2 (fi)
DK (1) DK447489A (fi)
ES (1) ES2053897T3 (fi)
FI (1) FI93494C (fi)
NO (1) NO178682C (fi)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0650999B2 (ja) * 1988-09-12 1994-07-06 日本商事株式会社 血液凝固因子安定化法
CA2080428C (en) * 1991-10-22 2004-01-27 Ray F. Ebert A method for preparing a thromboplastin reagent from cultured cells that is suitable for use in the prothrombin time test
JPH08224227A (ja) * 1995-02-22 1996-09-03 Internatl Reagents Corp 血液採血管
DE59702207D1 (de) * 1996-03-08 2000-09-21 Octapharma Ag Lachen Verfahren zur eignungsprüfung von faktor viii-haltigen proteinfraktionen
DE19858278A1 (de) * 1998-12-17 2000-06-21 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren zum Lokalisieren von Defekten im Gerinnungssystem
AU7137900A (en) * 1999-07-23 2001-02-13 Medical Analysis Systems, Inc. Stabilized coagulation control reagent and method of making same
AU6558400A (en) * 1999-08-17 2001-03-13 Novo Nordisk A/S Stabilisation of freeze-dried cake
US6586574B1 (en) 1999-08-17 2003-07-01 Nn A/S Stabilization of freeze-dried cake
US6248353B1 (en) 1999-12-10 2001-06-19 Dade Behring Inc. Reconstitution of purified membrane proteins into preformed liposomes
US6465202B1 (en) * 2000-02-17 2002-10-15 Biosafe Laboratories, Inc. Method for stabilizing aminotransferase activity in a biological fluid
GB0305133D0 (en) * 2003-03-06 2003-04-09 Sinvent As Product
EP2405275B1 (en) * 2009-03-05 2018-10-10 BML, Inc. Method for measuring glycated albumin contained in serum or plasma using mannitol as stabiliser for a control serum or plasma.
EP2722675B1 (en) 2011-06-17 2017-01-11 School Juridical Person Higashi-Nippon-Gakuen Method of measuring blood coagulation time to detect lupus anticoagulants
ES2652495T3 (es) 2011-06-17 2018-02-02 School Juridical Person Higashi-Nippon-Gakuen Método para detectar anticoagulantes lúpicos
JP6116231B2 (ja) * 2012-12-25 2017-04-19 株式会社Ｌｓｉメディエンス 組織トロンボプラスチン含有血液凝固能測定試薬及び測定方法
EP3154338B1 (en) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
ES2812201T3 (es) * 2014-06-10 2021-03-16 Biomatrica Inc Estabilización de células metabólicamente activas en una muestra de sangre a temperaturas ambiente
CN104181313B (zh) * 2014-09-04 2015-11-18 中国医学科学院输血研究所 凝血因子ⅸ质控品制备方法
CN105353141B (zh) * 2015-11-17 2018-04-10 北京美创新跃医疗器械有限公司 检测试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒
EP4242628A3 (en) 2015-12-08 2023-11-08 Biomatrica, INC. Reduction of erythrocyte sedimentation rate
US10793327B2 (en) 2017-10-09 2020-10-06 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container and method of using same
US11609042B2 (en) 2019-03-14 2023-03-21 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Multi-part lyophilization container and method of use
WO2024080372A1 (ja) * 2022-10-14 2024-04-18 積水メディカル株式会社 凝固第ｖｉｉｉ、ｉｘ又はｘｉ因子欠乏血液検体の血液凝固時間調節剤、及び活性化部分トロンボプラスチン時間測定のための試薬
JP7473282B1 (ja) * 2022-10-14 2024-04-23 積水メディカル株式会社 凝固第ｘｉｉ因子欠乏血液検体の血液凝固時間短縮剤
WO2024080373A1 (ja) * 2022-10-14 2024-04-18 積水メディカル株式会社 活性化部分トロンボプラスチン時間測定のための試薬、及びループスアンチコアグラント陽性血液検体又はヘパリン含有血液検体の血液凝固時間調節剤

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL275394A (fi) * 1961-02-28
US3323995A (en) * 1963-05-20 1967-06-06 Univ Northwestern Method of inhibiting the crosslinking of fibrin in blood
DE2461969A1 (de) * 1974-12-31 1976-07-08 Behringwerke Ag Stabiles blutplasma, verfahren zu dessen herstellung und seine verwendung als vergleichsplasma bei gerinnungs- untersuchungen
US4271122A (en) * 1978-04-27 1981-06-02 Hoffmann-La Roche Inc. Control plasma
JPS56135418A (en) * 1980-03-27 1981-10-22 Green Cross Corp:The Heat treatment of aqueous solution containing 8 factor of coagulation of blood derived from human
JPS57112367A (en) * 1980-12-29 1982-07-13 Sankyo Co Ltd Preparation of stable aqueous solution of compound having thiol group
JPS59134730A (ja) * 1983-01-20 1984-08-02 Green Cross Corp:The 血液凝固第８因子の加熱処理法
JPS59192961A (ja) * 1983-04-15 1984-11-01 Green Cross Corp:The 血液凝固第「じ」因子測定用試薬
DE3413311A1 (de) * 1984-04-09 1985-10-17 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Reagenz zur bestimmung der thromboplastinzeit
GR870129B (en) * 1987-01-27 1987-02-04 Giatzidis Ippokratis Stable bicarbonate - glycylglycine dialysate for hemodialysis and peritoneal dialysis
JPH0650999B2 (ja) * 1988-09-12 1994-07-06 日本商事株式会社 血液凝固因子安定化法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0359201B1 (en) 1993-03-03
DE68905117T2 (de) 1993-08-05
NO893637D0 (no) 1989-09-11
JPH0650999B2 (ja) 1994-07-06
DK447489A (da) 1990-03-13
DK447489D0 (da) 1989-09-11
US5147803A (en) 1992-09-15
NO893637L (no) 1990-03-13
FI93494C (fi) 1995-04-10
ES2053897T3 (es) 1994-08-01
FI894303A0 (fi) 1989-09-12
DE68905117D1 (de) 1993-04-08
JPH0275953A (ja) 1990-03-15
NO178682B (no) 1996-02-05
FI894303A (fi) 1990-03-13
EP0359201A2 (en) 1990-03-21
EP0359201A3 (en) 1991-01-09
NO178682C (no) 1996-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI93494B (fi) Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi
FI57421B (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett preparat ur maenniskoblodplasma med blodets koagulation befraemjande verkan
Heimburger et al. Proteinase inhibitors of human plasma
Laki et al. Chemistry and physiology of the fibrinogen-fibrin transition
Lundblad et al. The activation of antihemophilic factor (factor VIII) by activated Christmas factor (activated factor IX)
US6039945A (en) Pharmaceutical preparation for treating blood coagulation disorders
US4784944A (en) Prothrombin time determining reagent and methods of using and preparing the same
JP3055933B2 (ja) 改良された安定な凝固対照
Perry et al. Serum-carnosinase deficiency in carnosinaemia
CA2279376A1 (en) Methods and compositions for producing dried, storage-stable platelets
Esnouf et al. Enzymology and the blood clotting mechanism
EP0041173B2 (en) Blood-coagulation-promoting products and methods of preparing them
CN108220274A (zh) 一种高活性凝血因子xi突变体及其基因治疗/编辑载体、重组/融合蛋白的制备与应用
KR100296395B1 (ko) 단백질 c 또는 활성화 단백질 c 를 안정화시키는방법및안정화된조성물
Colucci et al. Influence of the fast-acting inhibitor of plasminogen activator on in vivo thrombolysis induced by tissue-type plasminogen activator in rabbits. Interference of tissue-derived components.
JP5192647B2 (ja) 安定な発色性試験用試薬および凝固診断試験におけるその使用
EP0041174B1 (en) Blood coagulation promoting product and process of preparing same
JP2778086B2 (ja) 第ｘ▲ｉｉｉ▼因子のアフイニテイクロマトグラフイーによる精製法
Beck et al. A stabilising factor for γ-glutamyl transpeptidase in urine
NO175622B (fi)
JPH04198195A (ja) Ｃｐｂ―ｉの安定化方法及び製剤組成物
Váradi et al. Purification and properties of human factor IXa
Galanakis Plasma cryoprecipitation studies: major increase in fibrinogen yield by albumin enrichment of plasma
ES2204924T3 (es) Procedimiento para la reactivacion mediante congelacion de proteinas de membrana purificadas.
Landaburu et al. Prothrombin activation with trypsin as enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
MM Patent lapsed

Owner name: NIPPON SHOJI KABUSHIKI KAISHA