FI93494B - Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi - Google Patents

Description

t 93494

Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi.

5 On tunnettua, että veren hyytyminen sisältää sekä sisäsyntyisiä että ulkoisia reaktioita ja että monet hyytymistekijät osallistuvat näihin reaktioihin. Ja hyytymistekijöiden reaktioiden tarkka määritys näytteessä on eräs kliinisten kokeiden tärkeistä kohdista. Mutta monet 10 näistä hyytymistekijöistä ovat proteiineja ja saattavat helposti denaturoitua. Näissä erityisesti tekijöiden V ja VIII tiedetään inaktivoituvan helposti. Monissa tapauksissa tekijöiden pysymättömyys aiheuttaa ongelmia kliinisissä kokeissa. Esimerkiksi on sanottu, että hyytymis-15 kokeeseen tarkoitettua näytettä tulisi säilyttää 2-8 °C:ssa ja että koe tulisi suorittaa neljän tunnin sisällä verinäytteen otosta. Lisäksi kokeessa käytettävä kaupallisesti saatavissa oleva kontrolliplasma (kylmäkuivattu tuote) säilyy vain yhden päivän jääkaapissa säilytettynä 20 sen jälkeen, kun se on liuotettu. Koereagensseinä käytettävien erilaisten hyytymistekijöitä sisältämättömien plasmojen pysyvyydet ovat hyvin huonoja, ja monet niistä säilyvät vain muutamia tunteja jääkaapissa säilytettynä, eikä niitä saa jäädyttää.

'*;25 Jos näitä pysymättömiä veren hyytymistekijöitä voi daan stabiloida, on mahdollista helpottaa näytteen säilytysolosuhteiden ja säilytysajan rajoituksia verinäytteen oton jälkeen samoin kuin kontrolliplasman ja erilaisten hyytymistekijöitä sisältämättömien plasmojen säilytys-30 olosuhteiden ja säilyvyysajan rajoituksia. Tämä on erit-•i täin edullista kliinisten kokeiden sekä teollisten tarkoi tusten kannalta. Niinpä on ollut kysyntää kehittää menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi.

Toisaalta monien erilaisten proteiinien, mukaan 35 lukien entsyymit, stabilointia koskevia tutkimuksia on tehty. Kuitenkin aineet, joilla on stabiloivia vaikutuk- 2 93494 siä proteiineihin, eroavat huomattavasti toisistaan proteiinien lajin ja alkuperän mukaan ja tällä hetkellä kullakin proteiinilla on itsenäisesti omat spesifiset aineensa, jotka niitä stabiloivat.

5 Veren hyytymistekijöiden stabilointia koskien on ehdotettu tiettyjä tekijöitä, esimerkiksi tekijöitä VIII, IX ja XIII, sisältäviä hyytymistekijävalmisteita, joissa nämä tekijät on stabiloitu käyttäen albumiinia, dekstraa-nia, sokereita, aminohappoja, orgaanisia karboksyylihap-10 poja ja neutraaleja suoloja, kuten NaCl:a, KCl:a ja vastaavia (JP-patenttijulkaisut Kokai nrot 56-127 308, 56- 135 418, 58-74 617, 59-134 730, 60-199 829, 61-60 414, 62-10 019 ja 62-195 331). Ne on kuitenkin tarkoitettu stabiloimaan hyytymistekijöitä valmisteessa olevien virusten 15 inaktivoimiseksi suoritetun lämpökäsittelyn aikana, ja niinpä niitä lisätään erittäin korkeita pitoisuuksia. Jos tällaista ainetta, esim. aminohappoa, kuten glysiiniä, alaniinia tai vastaavia, lisätään vereen tai plasmaan suuri pitoisuus, esimerkiksi 10 % tai enemmän, itse hyytymis-20 reaktio inhiboituu veren hyytymiskokeessa, eikä haluttua hyytymiskoetta voida suorittaa. Lisäksi yllä oleva ehdotus koskee vain tiettyjä hyytymistekijöitä, eivätkä valmisteet sisällä monia muita veren komponentteja. Siten ehdotus ei koske plasmaa eikä verta, jotka sisältävät •;25 kaikki tai osan hyytymisreaktioihin osallistuvista tekijöistä tai joista osa niistä puuttuu.

Tämän keksinnön keksijät ovat tehneet ahkerasti tutkimustyötä löytääkseen menetelmän veren tai plasman monien veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi, jolla 30 menetelmällä ei olisi epäsuotuisaa vaikutusta hyytymis-·: reaktioon. Tuloksena on keksitty, että hyytymistekijöitä voidaan huomattavasti stabiloida lisäämällä dipeptidiä glysyyliglysiini ja/tai tripeptidiä glysyyliglysyyligly-siini vereen tai plasmaan.

35 Tämän keksinnön tärkein kohde on antaa käyttöön menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi.

3 93494 Tämä kohde samoin kuin muut tämän keksinnön kohteet ja edut selviävät alan asiantuntijoille seuraavasta kuvauksesta.

Tämän keksinnön mukaisesti käyttöön annetaan mene-5 telmä veren hyytymistekijöiden stabiloimiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että vereen tai plasmaan lisätään stabiloivaksi aineeksi 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyy-liglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä. Määrä on sellainen, ettei sillä ole vaikutusta veren hyytymisai-10 kaan.

Edelleen tämä keksintö antaa käyttöön kontrolli-plasman, joka sisältää veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä.

15 Lisäksi tämä keksintöä antaa käyttöön reagenssin veren hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi, joka reagenssi sisältää plasmaa, josta hyytymistekijät puuttuvat tai josta ne on poistettu ja joka sisältää veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena 0,1 20 - 4,0 % (w/v) glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyli glysiiniä.

Tässä keksinnössä käytettävät glysyyliglysiini ja glysyyliglysyyliglysiini ovat peptidejä, joissa kaksi ja vastaavasti kolme aminohappoa on sitoutunut yhteen, ja ne ''.25 eroavat aineista, joita on käytetty tunnetuissa stabiloin-timenetelmissä. Tähän asti ei alalla aikaisemmin ole ollut tunnettua, että näitä aineita voidaan käyttää ei vain tiettyjen hyytymistekijöiden vaan myös kaikkien hyytymistekijöiden stabilointiin.

30 Veren hyytymistekijät jaetaan sisäsyntyiseen hyy- •j tymisreaktioreittiin, jossa hyytymisreaktio alkaa koske tuksesta vieraan aineen pinnan kanssa, osallistuviin tekijöihin ja ulkoiseen hyytymisreaktioreittiin, jossa hyy-tymisreaktion aloittaa kudoksen tromboplastiini, osallis-35 tuviin tekijöihin. Tämä keksintö pyrkii stabiloimaan kaikki molempiin reaktioreitteihin osallistuvat tekijät, ja 4 93494 nämä tekijät stabiloidaan lisäämällä vereen tai plasmaan glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä.

Tämä tarkoittaa, että tämän keksinnön mukainen sta-bilointimenetelmä suoritetaan lisäämällä glysyyliglysii-5 niä, glysyyliglysyyliglysiiniä tai molempia stabiloitavaan systeemiin. Näiden aineiden pitoisuus on esimerkiksi 0,1 - 2,0 % (w/v), edullisesti 0,5 - 1,0 % (w/v) silloin, kun stabiloitava systeemi on veri (kokoveri). Kun pitoisuus on alle 0,1 %, stabiloivaa vaikutusta ei saada. Toisaalta 10 1,5 %:n pitoisuudella havaitaan lievää hemolyysiä ja hemo- lyysi tulee merkittävämmäksi pitoisuutta lisättäessä. Lisäksi hyytymisaika (protrombiiniaika, (PT) tai aktivoitu partiaalinen hyytymisaika (APTT)) pyrkii myös pitenemään asteittain 1,5 %:n tai sitä suuremmalla pitoisuudella.

15 Niinpä 2 %:a suurempi pitoisuus ei ole edullinen. Kun molempia aineita käytetään yhdessä, kunkin aineen määrä voidaan valita sopivasti ja yllä määritelty pitoisuus vastaa niiden summaa. Silloin kun stabiloitava systeemi on plasma, pitoisuus on 0,1 - 4,0 % (w/v), edullisesti 0,5 -20 2,0% (w/v). Kun pitoisuus on alle 0,1 %, stabiloivaa vai kutusta ei saada. Vaikka hyytymisaika asteittain pitenee 2,0 %:n tai sitä korkeammalla pitoisuudella, stabiloiva vaikutus havaitaan yhä. Stabiloinnin tarkoituksesta riippuen ei edes 4,0 %:n (w/v) pitoisuus aiheuta ongelmia. Kun : 25 pitoisuus on suurempi kuin 4,0 %, hyytymisaika pitenee liikaa, eikä se ole edullista. Samoin plasman ollessa kyseessä, kun molempia aineita käytetään yhdessä, kummankin aineen määrä voidaan valita sopivasti ja yllä määritelty pitoisuus vastaa niiden summaa.

30 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamisek- : si glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini lisä tään vereen esimerkiksi yhdessä verinäytteen otossa hyytymistä ehkäisevänä aineena käytetyn aineen kanssa tai lisätään vereen liuottamalla ne hyytymistä ehkäisevän ai-35 neen liuokseen. Vaihtoehtoisesti glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini voidaan lisätä vereen, johon hyy- 5 93494 tyrnistä ehkäisevä aine on jo lisätty. Esimerkkejä verinäytteen otossa käytetyistä hyytymistä ehkäisevistä aineita ovat natriumsitraatti, oksaanihappo, EDTA ja vastaavat. Glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini 5 kiinteässä muodossa tai vesiliuoksena voidaan myös lisätä plasmaan, joka saadaan sentrifugoimalla veri, johon hyytymistä ehkäisevä aine on jo lisätty.

Tämän keksinnön mukaista menetelmää käytetään pääasiassa otettaessa verinäyte potilaasta hyytymiskokeen 10 suorituspaikassa tai sen jälkeen, kun verinäyte on otettu potilaasta hyytymiskokeen suorittamiseksi. Edelleen glysyyliglysiini ja/tai glysyyliglysyyliglysiini voidaan lisätä vereen tai plasmaan valmistettaessa teollisesti kont-rolliplasmaa ja erilaisia hyytymistekijöitä sisältämät-15 tömiä plasmoja käytettäväksi reagensseina hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Niitä voidaan esimerkiksi käyttää valmistettaessa normaalia ja epänormaalia kontrolliplasmaa, erilaisia hyytymistekijöitä sisältämättömiä plasmoja, kuten tekijöitä I, II, V, VII, 20 VIII, IX, X, XI, XII ja vastaavasti XIII sisältämättömiä plasmoja, plasmaa, josta on poistettu proteiini C, plasmaa, josta on poistettu antitrombiini III, ja vastaavia plasmoja.

Niinpä tämä keksintö antaa käyttöön myös kontrol-25 liplasman ja reagenssin veren hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi, jotka kontrolliplasma ja reagenssi sisältävät glysyyliglysiiniä ja/tai glysyy-liglysyyliglysiiniä veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena. Nämä kontrolliplasmat ja reagenssit voidaan val-30 mistaa sekoittamalla glysyyliglysiini ja/tai glysyyligly-syyliglysiini muiden tavanomaisten komponenttien kanssa yllä kuvattuna pitoisuutena tavanomaisen menetelmän mukaisesti. Ne voivat olla nestemäisinä valmisteina, konsentroituina nestemäisinä valmisteina, kylmäkuivattuina 35 tuotteina ja vastaavissa muodoissa. Lisäksi ne voivat olla testipakkausten muodossa.

6 93494 Tämän keksinnön mukaisesti näyteplasman käsittely paikassa, jossa kliininen koe suoritetaan, helpottuu. Lisäksi erilaisten hyytymistekijöitä sisältämättömien plasmojen säilyvyysaikaa voidaan pienentää tappioiden mini-5 moimiseksi.

Seuraavat esimerkit valaisevat edelleen tätä keksintöä yksityiskohtaisesti, mutta niitä ei tule pitää sen suoja-alaa rajoittavina.

Esimerkki 1 10 Lisäys plasmaan (1) Glysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus

Normaalihenkilöltä otettuun vereen (9 tilavuutta) sekoitettiin 3,2 % trinatriumsitraattiliuosta (1 tilavuus) ja seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 3 000 -15 rpm kymmenen minuuttia, jolloin saatiin plasma. Plasmaan lisättiin 0 %:sta (kontrolli) 4 %:iin (w/v) glysyyligly-siiniä ja hyytymisaika mitattiin stabiloivan vaikutuksen hyytymistekijöihin määrittämiseksi. Protrombiiniajan (PT) mittaus ulkoisten hyytymistekijöiden (II, V, VII ja X) in-20 aktivoitumisen määrittämiseksi sekä aktivoidun partiaali-sen tromboplastiiniajan (APTT) mittaus sisäsyntyisten hyytymistekijöiden (XII, XI, IX, VIII, prekallikreiini ja suurimolekyylinen kininogeeni) inaktivoitumisen määrittämiseksi suoritettiin päivinä 0, 4, 8 ja 12.

: 25 Tulokset on esitetty taulukossa 1.

PT:n ja APTT:n mittaus suoritettiin seuraavasti: PT:n mittaus

Plasmaan (0,1 ml), jota oli aikaisemmin kuumennettu 37 °C:ssa kaksi minuuttia, lisättiin tromboplastiini-30 reagenssia (Thrombomat, bioMdrieux S.A. -yhtiö. Ranska), : joka oli lämmitetty 37 °C:ksi, (0,2 ml) hyytymisreaktion aloittamiseksi ja hyytymisaika (sekunteina) mitattiin.

APTT:n mittaus

Plasma (0,1 ml) ja APTT-reagenssi (Actimat, bio-35 Mörieux S. A. -yhtiö, Ranska) (0,1 ml) sekoitettiin ja seosta kuumennettiin 37 eC:ssa kolme minuuttia. Tähän lisättiin 25 mmol/1 kalsiumkloridia, joka oli lämmitetty 7 93494 37 eC:ksi, (0,1 ml) hyytymisreaktion aloittamiseksi ja hyytymisaika (sekunteina) mitattiin.

Hyytymisajan mittaus suoritettiin käyttäen Option 8 -veren hyytymisen mittauslaitetta (bioM6rieux S. A.-5 yhtiö. Ranska), joka toteaa hyytymisen loppupisteen mittaamalla optisesti turbiditeetin muutosta.

TAULUKKO 1

Glysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus 10 (säilytys 25 °C:ssa)

Pitoisuus Määri- (%) tys Päivä 0 Päivä 4 Päivä 8 Päivä 10 o PT 11,4 14,6 17,9 22.4 15 APTT 37,3 55,1 77J9 131,8 0,02 PT 11,3 13,7 16,8 22,1 APTT 37,4 54,7 79,8 127,3 0,05 PT 11,3 14,1 17,4 23,9 APTT 37,0 56,1 61,9 134,3 20 0,1 PT 11,3 13,5 15,9 19,7 APTT 36,5 54,3 63,4 99,7 0,2 PT 11,1 12,7 14,8 19,0 APTT 35,5 54,6 60,2 91,4 0,5 PT 11,3 11,8 12,5 15,2 : 25 APTT 33,0 48,1 50,9 75,4 1.0 PT 11,5 12,3 12,7 14,2 APTT 33,2 44,1 38,3 60,1 2.0 PT 12,4 12,6 11,8 11,9 APTT 37,1 43,7 43,6 58,9 30 3,0 PT 13,5 13,2 11,7 11,9 • APTT 46,5 50,5 52,4 63,6 4.0 PT 14,7 14,5 12,9 11,9 APTT 58,7 58,3 51,4 63,6 (sekuntia) 8 93494

Kuten taulukosta 1 nähdään, kontrollin PT (glysyy-liglysiiniä 0 %) pitenl 11,4 sekunnista 22,4 sekuntiin 25 eC:ssa 12 päivän aikana ja sen APTT piteni 37,4 sekunnista 131,8 sekuntiin. Hyytymistekijöiden inaktivoitumista 5 havaittiin. Samoin stabiloivaa vaikutusta ei havaittu alle 0,1 %:n pitoisuudella. Toisaalta stabiloiva vaikutus havaittiin yli 2 %:n pitoisuudella. Hyytymisaika kuitenkin piteni glysyyliglysiinin lisäyksen johdosta. Nimittäin päivän 0 kontrollin (glysyyliglysiini 0 %) PT oli 11,4 10 sekuntia ja sen APTT oli 37,3 sekuntia. Lisättäessä 3 % glysyyliglysiiniä PT piteni 13,5 sekuntiin ja APTT piteni 46,5 sekuntiin. Tästä pidentymisestä johtuen yli 4 %:n pitoisuus ei ole edullinen. Lisättäessä 1 % glysyyliglysiiniä PT piteni 11,5 sekunnista 14,2 sekuntiin 25 eC:ssa 15 12 päivän aikana ja APTT piteni 33,2 sekunnista 60,1 se kuntiin. Kuitenkin kontrolliin verrattuna tämä piteneminen oli vähäistä ja todettiin, että hyytymistekijöiden in-aktivoituminen inhiboitui.

Näiden hyytymisaikojen mukaisesti todetaan, että 20 kontrolliin verrattuna hyytymistekijät stabiloituvat kolminkertaisesti tai enemmän PT:ssä ja kaksinkertaisesti tai enemmän APTT:ssä.

(2) Glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus

Esimerkin 1 (1) mukaisella tavalla mitattiin PT ja . 25 APTT glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutuksen määrittämiseksi .

Tulokset on esitetty taulukossa 2.

• · 9 93494 TAULUKKO 2

Glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus (säilytys 25 °C:ssa)

Pitoi- 5 suu8 Määri- («) tys Päivä 0 Päivä 4 Päivä 8 Päivä 10 0 PT 10.5 13,6 16.1 21,9 APTT 29,9 43,7 54,5 101,1 0,02 PT 10,4 13,1 15,5 21,3 10 APTT 29,8 45,0 56,0 109,5 0,05 PT 10.4 13,4 15,7 22,3 APTT 28|3 43,4 40,5 93,5 0,1 PT 10,2 12,8 14,5 20.1 APTT 28,1 44,1 39,2 81,5 15 0.2 PT 10,4 12,5 14,1 18,9 APTT 27,3 40,2 42,8 77,5 0,5 PT 10,5 12,3 13,2 14,4 APTT 26,2 37,8 37,9 51,8 1.0 PT 10,8 11,4 11,6 13,1 20 APTT 25,8 37,0 38,8 45,7 2.0 PT 12-0 12,5 11,0 11,7 APTT 29,4 37,5 40,8 43,1 3.0 PT 13,2 12,1 11,1 12,1 APTT 36,8 40,4 43,4 58,2 : or 4t° PT 14,3 13i° 14»8 16,7 ' APTT 46,0 44,5 39,6 54,7 (sekuntia)

Kuten taulukossa 2 nähdään, kontrollin (glysyyli-30 glysyyliglysiini 0 %) PT piteni 10,5 sekunnista 21,9 sekuntiin 25 °C:ssa 12 päivän aikana ja sen APTT piteni 29,9 sekunnista 101,1 sekuntiin. Toisaalta lisättäessä 1 % gly-syyliglysyyliglysiiniä PT piteni 10,8 sekunnista 13,1 sekuntiin ja APTT piteni 25,8 sekunnista 45,7 sekuntiin.

35 Kontrolliin verrattuna tämä piteneminen on vähäistä ja todettiin, että hyytymistekijöiden inaktivoituminen inhiboitu!. Stabiloivaa vaikutusta ei havaittu alle 0,1 %:n 10 93494 pitoisuudella. Pitenemisen johdosta yli 4 %:n pitoisuus ei ollut edullinen.

Näiden hyytymisaikojen mukaisesti todetaan, että kontrolliin verrattuna hyytymistekijät stabiloituvat kol-5 minkertaisesti tai enemmän PT:ssä ja kaksinkertaisesti tai enemmän APTT:ssä.

Näiden tulosten mukaan on selvää, että glysyyli-glysiiniä ja glysyyliglysyyliglysiiniä voidaan käyttää kaikkien veren hyytymistekijöiden stabilointiin plasmassa. 10 Esimerkki 2

Lisäys vereen (1) Glysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus

Normaalihenkilöltä otettuun vereen (9 tilavuutta) sekoitettiin 3,2 % trlnatriumsitraattia (1 tilavuus) ja 15 saatuun kokovereen lisättiin glysyyliglysiiniä. Liuotuksen jälkeen seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 3 000 rpm 10 minuuttia, jolloin saatiin plasma. Kontrolleiksi saman kokoveren sentrifugoinnin jälkeen plasman saamiseksi tähän plasmaan lisättiin glysyyliglysiiniä. Esimerkin 1 mukai-20 sella tavalla määritettiin vaikutukset hyytymisaikoihin (PT ja APTT).

Tulokset esitetty taulukossa 3.

TAULUKKO 3 25 Glysyyli- * glysiini Kokoveri (Plasma) Kokoveren (% w/v) (s) (s) hemolyysi 0 PT 10,2 10,3 ei hemolyysiä APTT 26,6 26,3 30 0,2 PT 10,0 10,2 ei hemolyysiä APTT 25,6 24,8 • · 0,5 PT 10.3 10,4 ei hemolyysiä APTT 24,7 24,7 1,5 PT 11,6 11,4 lievä hemolyysi 35 APTT 26,2 27,0 4,0 PT 15,0 13,8 voimakas hemo- APTT 46,9 42,9 lyysi

II

11 93494

Kuten taulukossa 3 nähdään, lisättäessä kokovereen 4.0 % glysyyliglysilnlä havaittiin voimakas hemolyysi ja hyytymisajat pitenivät. Tämän pitenemisen katsottiin johtuvan hemolyysistä. Havaittiin melkein samanlainen stabi- 5 loiva vaikutus kuin esimerkissä 1.

(2) Glysyyliglysyyliglysiinin lisäyksen vaikutus Esimerkin 2 (1) mukaisella tavalla glysyyliglysyy-liglysiiniä lisättiin kokovereen ja sen vaikutus hyytymis-aikoihin (PT ja APTT) määritettiin.

10 Tulokset on esitetty taulukossa 4.

TAULUKKO 4

Glysyyli- glysyyli 15 glysiini Kokoveri (Plasma) Kokoveren (% w/v) (s) (s) hemolyysi 0 PT li,i 11,2 ei hemolyysiä APTT 36)5 35,0 0,2 PT 11,2 11.2 ei hemolyysiä 20 APTT 36,2 34,3 0,5 PT 11.3 11,4 ei hemolyysiä APTT 35,6 33,8 1,5 PT 12,6 12,6 lievä hemolyysi APTT 36,3 36,7 25 4,0 PT 16,6 15,8 voimakas hemo- APTT 63,7 64,6 lyysi

Kuten taulukosta 4 nähdään, lisättäessä kokovereen 4.0 % glysyyliglysyyliglysiiniä havaittiin voimakas hemo-30 lyysi. Havaittiin melkein samanlainen stabiloiva vaikutus * kuin esimerkissä 1.

Esimerkki 3

Glysyyllglysiinin ja glysyyliglysyyliglysiinin yhdistelmän vaikutus 35 Kun kaupallisesti saatavissa oleva jäätynyt plasma oli sulatettu huoneenlämpötilassa, sitä sentrifugoitiin 12 93494 kierrosnopeudella 3 000 rpm 10 minuuttia sakan poistamiseksi. Saatuun plasmaan lisättiin glysyyliglysiinin ja glysyyliglysyyliglysiinin seos suhteessa 3:0, 2:1, 1:2 tai 0:3 siten, että seoksen pitoisuudeksi plasmassa tuli 1,5 % 5 (w/v) ja seos liuotettiin.

Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla mitattiin hyytymis-ajat (PT ja APTT) käyttäen plasmaa, johon ei lisätty gly-syyliglysiiniä eikä glysyyliglysyyliglysilniä, kontrollina näiden aineiden yhdistelmän vaikutuksen määrittämiseksi. 10 Tulokset on esitetty taulukossa 5.

TAULUKKO 5

Yhdistelmän vaikutus (säilytys 25 °C:ssa) 15 Glysyyligly- Päivä 0 Päivä 6 Päivä 10 siini:gly-syyliglysyyli-

glysiini PT APTT PT APTT PT APTT

Kontrolli 20 ei lisäystä) 12,4 36,9 15,2 45,6 17,4 89,4 3 : 0 13,2 38,6 13,2 37,6 13,0 38,6 2 ; 1 12,9 38,0 13,3 37,3 13,3 37,0 25 1*2 12,9 36,3 13,1 36,6 12,5 38,9 0:3 12,7 36,7 13,0 37,0 13,7 37,6 (sekuntia)

Kuten taulukosta 5 nähdään stabiloiva vaikutus ha-30 vaittiin yhdistämällä glysyyliglysiini ja glysyyliglysyy-*: liglysiini (2:1 tai 1:2) samoin kuin käytettäessä näitä aineita yksinään (3:0 tai 0:3).

Esimerkki 4 0,5 % (w/v) glysyyliglysiiniä lisättiin plasmaan, 35 josta antitrombiini lii (AT III) oli poistettu, käytettäväksi antitrombiini III:n (PCT/JP89/00173) biologisen ak-

II

13 93494 tiivisuuden määrityksessä ja sen stabiilius määritettiin seuraavasti.

Plasma, josta AT lii oli poistettu, jäädytettiin ja säilytettiin pakastimessa. Se sulatettiin jokaisena 5 mittauspäivänä.

Analyytin (AT III) sijasta lisättiin Michaelis-pus-kuria (50 μΐ) plasmaan, josta AT III oli poistettu, (100 μΐ) ja saatua seosta inkuboitiin 37 eC:ssa kaksi minuuttia. Erikseen kaupallisesti saatavissa oleva PT-rea-10 genssi laimennettiin 10-kertaisesti 25 mmol/1 kaliumklori-diliuoksella, joka sisälsi 10 U/ml hepariinia, reaktion aloitusliuoksen saamiseksi. Tämä liuos 37 °C:ksi lämmitettynä (200 μΐ) lisättiin yllä olevaan plasmaan ja hyytymis-aika määritettiin.

15 Tulokset on esitetty taulukossa 6.

TAULUKKO 6

Plasman, josta AT III on poistettu, stabilointi Näyte Päivä 0 Päivä 1 Päivä 4 Päivä 7 20 Ei lisäystä 29,1 35,9 40,4 77,4

Glysyyligly- siini 0,5 % 28,9 32,5 29,4 28,1 (sekuntia) 25 Kuten taulukosta 6 nähdään, kun glysyyliglysiiniä ei lisätty, hyytymisaika piteni 29,1 sekunnista 77,4 sekuntiin seitsemän päivän aikana. Toisaalta kun 0,5 glysyyliglysiiniä lisättiin, hyytymisajan ei havaittu pitenevän ja huomattava stabiloiva vaikutus havaittiin.

30 Tämä osoittaa, että reagenssin ominaisuudet säily vät stabiileina.

• Esimerkki 5 Tämä esimerkki suoritettiin sen tutkimiseksi, saataisiinko vai eikö saataisi esimerkeissä 1-4 esitetty 35 huomattava glysyyliglysiinin ja glysyyliglysyyliglysiinin 93494 14 stabiloiva vaikutus hyytymistekijöihin aminohapoilla ja sokerilla.

0,5 % (w/v) glysiiniä, alaniinia tai natriumas- partaattia tai 1,0 % (w/v) mannitolia, maltoosia tai sak-5 karoosia lisättiin kaupallisesti saatavissa olevaan säilytettyyn plasmaan ja verrattiin kontrolliin (ei lisäystä) ja glysyyliglysiiniin (0,5 %). Tässä esimerkissä jäädytys ja sulatus toistettiin joka päivä stabiiliuden määrittämiseksi .

10 Tulokset on esitetty taulukossa 7.

TAULUKKO 7

Erilaisten aineiden lisäyksen vaikutuksen vertailu Aine Päivä 0 Päivä 7 Päivä 14

15 PT APTT PT APTT PT APTT

Kontrolli 13,1 47,9 14,1 52,9 17,6 >70

Glysyyliglysiini 13>3 45>6 45>2 13>e 53;0

Glysiini 0,5 % 13,0 47,0 13,3 52,0 14,9 >70 20 Alaniini 0,5 % 13,1 47,6 13,5 52,4 15,2 >70

Natrium- 13,0 50,9 13,6 56,6 15,9 >70 aspartaatti 0,5 % '

Manni toi i 1,0 % 13,2 47,2 14,1 53,2 16,8 >70

Maltoosi 1,0 % 13,6 47j8 14^4 54 9 17,7 >7o 25 Sakkaroosi 1,0 % 13,6 48,4 14,1 54,1 16,7 >70 (sekuntia)

Kuten taulukossa 7 nähdään, glysyyliglysiini stabiloi merkittävästi kontrolliin verrattuna. Mutta muiden 30 aineiden ollessa kyseessä APTT oli yli 70 sekuntia 14. päivänä ja oli sama kuin kontrollin. Siten stabiloivaa . .j vaikutusta ei havaittu. Lisäksi vaikka aminohappoja käy- • tettäessä havaittiin lievä stabiloiva vaikutus, vaikutus ei ollut yhtä merkittävä kuin glysyyliglysiinillä.

35 Niinpä todetaan, että glysyyliglysiinin ja glysyy- liglysyyliglysiinin vaikutus on spesifinen.

Claims (6)

93494

1. Menetelmä veren hyytymistekijöiden stabiloimi-seksi, tunnettu siitä, että vereen tai plasmaan 5 lisätään stabiloivaksi aineeksi 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyy-liglysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabiloivaa ainetta lisätään vereen 0,5 - 1,0 % (w/v).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabiloivaa ainetta lisätään plasmaan 0,5 - 2,0 % (w/v).

4. Kontrolliplasma, tunnettu siitä, että se sisältää veren hyytymistekijöitä stabiloivana aineena 15 0,1-4,0% (w/v) glysyyliglysiiniä ja/tai glysyyliglysyy liglysiiniä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kontrolliplasma, tunnettu siitä, että stabiloivan aineen pitoisuus on 0,5 - 2,0 % (w/v).

6. Reagenssi veren hyytymistekijöiden biologisen aktiivisuuden määrittämiseen, tunnettu siitä, että se sisältää plasmaa, josta hyytymistekijät puuttuvat tai josta ne on poistettu ja joka sisältää veren hyytymisin tekijöitä stabiloivana aineena 0,1 - 4,0 % (w/v) glysyyli- 25 glysiiniä ja/tai glysyyliglysyyliglysiiniä. t 93494