CN105353141B - 检测试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒。该检测试剂包括白陶土、脑磷脂、缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、葡聚糖、NaN3。本技术相比现有技术具有以下优点，本发明APTT试剂盒通过调整保护液的组分和比例，使APTT试剂的稳定性很好，4℃放置可以稳定18个月，37℃放置可以稳定15天，开瓶后置于4℃可以稳定50天，在产品的稳定性上显著(P＜0.05)优于一般的市售产品，为医院节约了成本,提供了很好的试剂来源。

Description

检测试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒。
背景技术
在临床检验方面，医院各科室对于止血和血栓方面的检测取得了广泛的认识，止血和血栓方面的检测已经给临床医师对于疾病的诊断、疗效的观察、抗凝剂用量的检测和预后提够了大量可靠的数据支持，随着国内人们对于这方面的了解和重视，越来越多的检测手段被用于其中。
人体凝血途径分为内源性凝血途径和外源性凝血途径，而活化部分凝血活酶时间(APTT)是用于检测人体内源性凝血途径是否正常的一个重要指标，如果部分内源性凝血因子(如VII,VIII,IX,XI)缺乏，就会导致APTT延长。APTT也同样用于对于抗凝血药物肝素用量的监测。
APTT测定原理是将待测血浆和APTT试剂一起37℃混匀预温一定时间，然后加入钙离子，启动内源性凝血途径，促使纤维蛋白原转变成纤维蛋白而凝固，测定凝固时间即为活化部分凝血酶时间。现有市场上常用的液体APTT试剂多用鞣花酸作为激活剂，此类物质对于肝素的敏感性较低，且稳定性不好。因此，提供一种APTT的检测试剂具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒，该活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂，具有高稳定，同时对凝血因子的缺乏具有高灵敏度的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测试剂，包括白陶土、脑磷脂、缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、葡聚糖、NaN3。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测试剂中所述白陶土、脑磷脂、缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、葡聚糖、NaN3的质量比为(0.5～10)：(0.2×10-3～1.0×10-3)：(0.05～2)：(1～20)：(4～40)：(0.1～1)：(0.1～1)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测试剂还包括水。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测试剂中所述脑磷脂选自兔脑磷脂、猪脑磷脂或牛脑磷脂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测试剂中所述缓冲液为Tris-Hcl缓冲液、hepes缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或硼酸盐缓冲溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测试剂中所述葡聚糖的分子量为40000。
在本发明的一些具体实施方案中，1L所述检测试剂中包括如下组分：
本发明还提供了所述检测试剂在制备检测活化部分凝血活酶时间(APTT)的检测工具中的应用。
本发明还提供了一种检测活化部分凝血活酶时间的试剂盒，包括所述检测试剂。
本发明还提供了所述检测试剂或所述试剂盒的使用方法，取待测血浆与所述检测试剂混合，再与钙离子混合，测定凝固所需时间，即得待测血浆的活化部分凝血酶时间。
本发明提供的检测试剂的制备方法为称取白陶土溶于去离子水中，搅拌后，15～35℃下静止5-15h，抽取上清混悬液100ml备用。将上述静置好的混悬液加入到Tris-HCL缓冲液中，搅拌，直到整个液体呈现均一的白色混悬液，然后加入磷脂，葡聚糖4w，叠氮钠，BSA，Gly搅拌混匀，该液体即为APTT试剂。
在本发明的一些具体实施方案中，检测试剂的制备方法为称取5-20克白陶土溶于100ml水中，搅拌2-4h后，常温下静止5-15h备用。将上述静置好的混悬液100ml加入到900ml50-300mmol/L的pH为7.0的Tris-HCL缓冲液中，搅拌30～60min，直到整个液体呈现均一的白色混悬液，然后加入0.6-2.0g磷脂，0.5-1.5g葡聚糖4w，0.5-1.0g叠氮钠5-15gBSA，4-20gGly搅拌20-60min混匀，该液体即为APTT试剂。
本发明提供了一种检测试剂，包括白陶土、脑磷脂、缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、葡聚糖、NaN3。本技术相比现有技术具有以下优点，本发明APTT试剂盒通过调整保护液的组分和比例，使APTT试剂的稳定性很好，4℃放置可以稳定18个月，37℃放置可以稳定15天，开瓶后置于4℃可以稳定50天，在产品的稳定性上显著(P＜0.05)优于一般的市售产品，为医院节约了成本,提供了很好的试剂来源。
具体实施方式
本发明公开了一种活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的APTT试剂是由下述原料配制而成：0.5-10g/l白陶土，兔脑磷脂0.2-1.0mg/l，Tris-Hcl缓冲液0.05-2g/l；BSA 1-20g/l；甘氨酸4-40g/l；葡聚糖4w 0.1-1g/l，0.1-1g/l NaN3，其余是水。本技术相比现有技术具有以下优点，本发明APTT试剂盒通过调整保护液的组分和比例，使APTT试剂的稳定性很好，4℃放置可以稳定18个月，37℃放置可以稳定15天，开瓶后置于4℃可以稳定50天，在产品的稳定性上优于一般的市售产品，为医院节约了成本,提供了很好的试剂来源。
该试剂检测原理：待测血浆加入适量的APTT激活剂，预温3min后加入钙离子，启动内源性凝血途径，使维蛋白原转变成纤维蛋白而凝固，测定凝固所需时间，即为待测血浆的活化部分凝血酶时间(APTT)。
表1 为本试剂使用操作步骤
本发明提供的测定试剂及其应用及含有该试剂的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、称取1～20克白陶土溶于100ml去离子水中，搅拌2-4h后，15～35℃下静止5-15h，备用。
2、将上述静置好的混悬液100ml加入到900ml(0.05-2g)pH为7.0的Tris-HCL缓冲液、hepes缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或硼酸盐缓冲溶液中，搅拌30～60min，直到整个液体呈现均一的白色混悬液，然后加入0.2～1mg脑磷脂，0.1～1g葡聚糖4w，0.1～1.0g叠氮钠，1～20gBSA，4～40g Gly搅拌20～60min混匀，该液体即为APTT试剂。
实施例2
1、称取1g白陶土溶于100ml去离子水中，搅拌2-4h后，15～35℃下静止5-15h，备用。
2、将上述静置好的混悬液100ml加入到900ml 80mmol/l的pH为7.0的Tris-HCL缓冲液中(对应Tris-HCL0.5g)，搅拌30～60min，直到整个液体呈现均一的白色混悬液，然后加入0.6mg兔脑磷脂，0.1g葡聚糖4w，0.1g叠氮钠，1g BSA，40g Gly搅拌20～60min混匀，该液体即为APTT试剂。
实施例3
1、称取20g白陶土溶于100ml去离子水中，搅拌2-4h后，15～35℃下静止5-15h，备用。
2、将上述静置好的混悬液100ml加入到900ml 300mmol/L的pH为7.0的Tris-HCL缓冲液(对应Tris-HCL2g)中，搅拌30～60min，直到整个液体呈现均一的白色混悬液，然后加入0.2mg猪脑磷脂，1g葡聚糖4w，0.5g叠氮钠，1g BSA，22g Gly搅拌20～60min混匀，该液体即为APTT试剂。
实施例4
1、称取5g白陶土溶于100ml去离子水中，搅拌2-4h后，15～35℃下静止5-15h，备用。
2、将上述静置好的混悬液100ml加入到900ml 160mmol/L的pH为7.0的Tris-HCL缓冲液(对应Tris-HCL1g)中，搅拌30～60min，直到整个液体呈现均一的白色混悬液，然后加入1.0mg牛脑磷脂，0.1g葡聚糖4w，1g叠氮钠，20g BSA，4g Gly搅拌20～60min混匀，该液体即为APTT试剂。
实施例5本发明APTT试剂盒和市售APTT试剂盒开瓶稳定性对比试验
1、本发明实施例2提供的APTT试剂盒和市售APTT试剂盒开封后在4℃条件下的稳定性
将本发明实施例2提供的APTT试剂盒和市售APTT试剂盒开封后置于4℃条件下保存，每天在MC1000血凝仪上用同一正常质控(24-38s)进行测试，结果见表2。
表2 与市售APTT开瓶稳定性对比
表2表明本发明实施例2提供的APTT试剂开瓶后的稳定性显著(P＜0.05)优于市售APTT试剂，本发明APTT试剂开瓶后可以稳定50天而市售APTT试剂只能放置25天左右。
将本发明实施例1、实施例3、实施例4制备的APTT试剂进行上述试验，结果与实施例2制备的试剂的结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
表明本分买那个提供的APTT试剂的稳定性显著提高。
2、本发明实施例2提供的APTT试剂盒和市售APTT试剂37℃加速热稳定性相比较
本发明实施例2提供的APTT试剂保存在37℃下连续测定十五天，对质控血浆进行检测，结果仍较稳定，而市售的APTT试剂在第五天就发生了变化，结果说明本发明实施例2的APTT试剂稳定性较好，为医院降低了一定的成本和开销。(结果见表3)。
表3 本发明APTT试剂和市售APTT试剂37℃加速热稳定性对比试验
将本发明实施例1、实施例3、实施例4制备的APTT试剂进行上述试验，结果与实施例2制备的试剂的结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
表明本发明提供的APTT试剂的稳定性较好，为医院降低了一定的成本和开销。
3、本发明实施例2提供的APTT试剂与市售APTT试剂在4℃下稳定性对比试验
将本发明实施例2提供的APTT试剂与市售APTT试剂保存在4℃下进行稳定性对比试验(见表4)，结果表明本发明实施例2提供的的APTT试剂在4℃条件下放置18个月，结果较稳定，而市售的APTT试剂只能在4℃条件下放置12个月，这样的结果说明本试剂盒的稳定期可以达到18月，优于市售试剂12个月。
表4 与市售APTT试剂在4℃下稳定性对比试验
将本发明实施例1、实施例3、实施例4制备的APTT试剂进行上述试验，结果与实施例2制备的试剂的结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
表明本发明提供的APTT试剂的稳定性较好，稳定期可以达到18月，显著(P＜0.05)优于市售试剂12个月。
4、本发明实施例2提供的试剂和市售试剂对不同凝血因子的缺乏检出的敏感性对比试验
配制50％、25％、0％的F VIII活性水平的血浆，用定标血浆1ml倍比稀释乏FVIII血浆，活性为100～1.54％，其他乏因子血浆配制同上。
用MC1000血凝仪测各组的APTT，以APTT比值(APTT测定值/定标血浆值)报告，见表5。
表5 试验结果
1为市售APTT试剂 2为本发明APTT试剂。
表5结果表明，本发明实施例2提供的APTT对于内源性凝血途径中F VIII、FIX、FXI、FXII四种凝血因子的缺乏具有更高的敏感性，与市售试剂相比具有显著差异(P＜0.05)。(APTT的比值越高表明试剂对于因子的缺乏越敏感)。
将本发明实施例1、实施例3、实施例4制备的APTT试剂进行上述试验，结果与实施例2制备的试剂的结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
表明本发明提供的APTT试剂对于内源性凝血途径中F VIII、FIX、FXI、FXII四种凝血因子的缺乏具有更高的敏感性，与市售试剂相比具有显著差异(P＜0.05)。(APTT的比值越高表明试剂对于因子的缺乏越敏感)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种检测试剂，其特征在于，包括白陶土、脑磷脂、缓冲液、牛血清白蛋白、甘氨酸、分子量为40000的葡聚糖、NaN3；所述白陶土、脑磷脂、缓冲液、牛血清白蛋白、甘氨酸、葡聚糖、NaN3的质量比为(1～20)：(0.2×10-3～1.0×10-3)：(0.05～2)：(1～20)：(4～40)：(0.1～1)：(0.1～1)。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，还包括水。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述脑磷脂选自兔脑磷脂、猪脑磷脂或牛脑磷脂。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述缓冲液为Tris-Hcl缓冲液、hepes缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或硼酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，1L所述检测试剂中包括如下组分：
6.根据权利要求1至5任一项所述的检测试剂在制备检测活化部分凝血活酶时间的检测工具中的应用。
7.一种检测活化部分凝血活酶时间的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的检测试剂。
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