CN104076156A

CN104076156A - 活化部分凝血活酶时间测定法和活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒

Info

Publication number: CN104076156A
Application number: CN201410122913.0A
Authority: CN
Inventors: 奥田昌宏; 木下英美; 铃木健史
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2014-10-01
Also published as: US20140295470A1; EP2790024A1; JP2014190954A

Abstract

本发明提供活化部分凝血活酶时间测定方法。此方法包括：将被检血浆和含活化剂及25μg/mL以上的磷脂酰甘油的第1试剂混合的第1混合步骤,将第1混合步骤中得到的样品和含钙盐的第2试剂混合的第2混合步骤，和测定第2混合步骤中得到的样品的凝固时间的步骤。

Description

活化部分凝血活酶时间测定法和活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒

技术领域

本发明涉及活化部分凝血活酶时间（APTT）的测定方法、及APTT测定用试剂盒。

背景技术

在临床检查的领域中，已知通过测定血液的凝固时间来研究血液凝固因子的异常等的检查。作为一般的血液凝固能力的临床检查之一，可举出APTT测定。APTT是指反映出血时血液通过与有阴性电荷的异物接触而开始的内因性凝固途径的功能的凝固时间。APTT的测定不仅是在内因性凝固因子的缺乏或异常的筛选检查中利用，还在肝素疗法的监测等中利用。

APTT测定很早就确立为临床检查中利用的凝固时间测定法。此方法中使用有阴性电荷的活化剂，作为血小板第3因子的代替物的磷脂，和用于供给钙离子的钙盐。其测定原理如下。首先，向血浆加磷脂及活化剂，由活化剂活化血浆中的接触因子系统。向其中添加钙盐，则由于活化的接触因子系统及磷脂的作用而凝固反应被促进，最终纤维蛋白析出到血浆中。在APTT测定中，将纤维蛋白的析出看作凝固，将自钙盐的添加至纤维蛋白析出的时间测定为凝固时间。

至今已开发了各种APTT测定用试剂，任何试剂均含磷脂主要的成分。在APTT测定用试剂中使用的磷脂有天然来源磷脂及合成磷脂的，出于临床灵敏度、疾病鉴别或品质升高的目的，近年，将多种合成磷脂混合使用（参照例如，US2011/159597）。另外，作为合成磷脂的种类，将磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）及磷脂酰丝氨酸（PS）的3种混合而含在试剂中成为主流。

另一方面已知，在使用如上述一样的APTT测定用试剂的测定中，在从受试者得到的血液样品中含作为抗磷脂抗体之一种的LA时，由于LA抑制对于血液凝固必要的磷脂，凝固时间延长。近年利用此凝固时间的延长，进行由含磷脂的APTT测定用试剂的LA的筛选检查。在此筛选检查中，通过使用磷脂浓度低的APTT测定用试剂，使由LA的向磷脂的抑制反应容易显现。另外，为了LA的检测，也存在将磷脂浓度不同的2种APTT试剂组合的试剂盒。

发明概述

本发明的范围仅由随附的权利要求定义，不受此发明概述的任何影响。

在疑患血友病或凝固因子异常症等的与凝固因子的缺乏或异常关联的疾病的受试者的血液中存在LA时，通过由以往的APTT测定用试剂的测定无法判别凝固时间的延长起因于凝固因子的缺乏或异常，还是起因于LA。为了进行此判别，通常，有再进行由LA检测用试剂盒的检查，或者组合进行多种不同的检查的必要。因此，也存在由APTT测定进行与凝固因子的缺乏或异常关联的疾病的筛选检查的需求。

为了降低LA对APTT测定用试剂的灵敏度，尝试了提高试剂中的磷脂含有量，或特别是提高六角形型磷脂酰乙醇胺（PE）或有阴性荷电的PS的浓度。但是，至今尚不知明确显示有效地降低对LA的灵敏度，或者不受LA的影响的试剂。

鉴于上述情况，本发明旨在提供使降低样品中的LA的影响，并且正确地测定APTT成为可能的试剂盒及使用其的APTT测定方法。另外，本发明旨在提供非源于LA的血液凝固异常的判断方法。

本发明提供活化部分凝血活酶时间测定方法。此方法包括：将被检血浆和含活化剂及25μg/mL以上的磷脂酰甘油的第1试剂混合的第1混合步骤、将第1混合步骤中得到的样品和含钙盐的第2试剂混合的第2混合步骤，和测定第2混合步骤中得到的样品的凝固时间的步骤。

另外，本发明提供活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒。此试剂盒含有：含磷脂酰甘油的第1试剂和含钙盐的第2试剂。第1试剂中的磷脂酰甘油的浓度是25μg/mL以上。

使用本发明的试剂盒可使降低LA的影响地测定APTT成为可能，并且可抑制试剂的白色混浊或沉淀。另外，本发明提供使降低LA的影响地测定APTT成为可能的方法。再者，本发明提供判断非源于LA的血液凝固异常的有无的方法。

发明详述

以下说明本发明的优选的实施方式。

本发明的方法中使用的APTT测定用试剂（以下，也简称为“试剂”）以25μg/mL以上的浓度含PG。PG只要是生物学或制剂学等的领域中一般使用的PG，就不特别限定。另外，PG可为合成磷脂，也可为从动物的大脑或植物的组织或微生物的菌体膜等得到的天然来源PG，但从试剂的品质的观点来看，使用合成的PG是优选的。再有，PG的脂肪酸侧链不特别限定，可举出例如棕榈酸、油酸、硬脂酸等。

PG的试剂中的浓度是25μg/mL以上就不特别限定，如果使PG浓度成200μg/mL以上，则PG不完全溶解而在试剂中可发生白色混浊或沉淀。从而，从试剂的品质的观点来看，PG浓度在试剂中不发生白色混浊或沉淀的范围内是优选的，具体而言150μg/mL以下是优选的。在本发明是优选的实施方式中，PG浓度是25μg/mL以上，设定为在2～8℃在试剂中不发生白色混浊或沉淀的150μg/mL以下。更具体而言，试剂的PG浓度在50～150μg/mL是特别优选的。

试剂的溶剂只要是可溶解PG，并且不妨碍APTT测定的溶剂就不特别限定，优选为，APTT测定用试剂中通常使用的缓冲液。作为那样的缓冲液，可举出例如，HEPES、TRIS、MOPS等。再有，试剂的pH是通常5～9，优选为6～8。

在本发明是优选的实施方式中，试剂再含活化剂。活化剂只要是活化接触因子系统的物质就不特别限制，例如，可使用从鞣花酸、高岭土、硅藻土、胶体氧化硅、硅酸等酐选择的至少1种。在它们之中，鞣花酸及胶体氧化硅是特别优选的。

试剂中的活化剂的浓度不特别限制，可根据活化剂的种类或APTT的测定条件等适宜设定。例如，作为活化剂的浓度，通常为5～1000μg/mL，优选为20～500μg/mL。当作为活化剂使用鞣花酸时，作为试剂的鞣花酸浓度，通常为5～100μg/mL，优选为20～50μg/mL。

在本发明是优选的实施方式中，试剂再含PG以外的磷脂。那样的磷脂只要是APTT测定用试剂中通常使用的磷脂就不特别限定，例如，可使用从PE、PC及PS选择的至少1种。PG以外的磷脂可为合成磷脂，也可为从兔大脑、牛大脑、人胎盘、大豆、卵黄等提取的天然来源磷脂，但从试剂的反应特性或品质的观点来看，使用合成磷脂是优选的。

试剂中的PG以外的磷脂的浓度不特别限制，可根据磷脂的种类或APTT的测定条件等适宜设定。例如，作为PG以外的磷脂的浓度，通常为30～2000μg/mL，优选为100～600μg/mL。作为PG以外的磷脂，含PE、PC及PS的3种时，本发明的试剂中的PE浓度是通常为10～700μg/mL，优选为30～300μg/mL，PC浓度通常是20～1000μg/mL，优选为30～500μg/mL，PS浓度通常是3～300μg/mL，优选为5～150μg/mL。

试剂也可再含用于升高保存性或稳定性的添加剂。作为那样的添加剂，只要是APTT测定用试剂中通常使用的添加剂即可，可举出例如，防腐剂、抗氧化剂、稳定化剂等。作为防腐剂，可举出例如，叠氮化钠、苯酚、公知的抗生物质（例如环丙沙星）等。作为抗氧化剂，可举出例如，丁基羟基苯甲醚等。作为稳定化剂，可举出例如，高分子聚合物化合物，特别优选聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮。

在本发明的范围内包括利用上述的本发明的试剂的试剂盒。

本发明的APTT测定用试剂盒（以下，也简称为“试剂盒”）含有：含活化剂及25μg/mL以上的PG的第1试剂，和含钙盐的第2试剂。

在本发明的实施方式中，作为第1试剂，可适宜地使用含活化剂的本发明的APTT测定用试剂。从而，第1试剂中含的PG与本发明的试剂中含的PG同样。即，第1试剂中含的PG可为合成的PG或天然来源PG之任何，但优选为合成的PG。另外，第1试剂中的PG的浓度是25μg/mL以上，并且可在得到无白色混浊或沉淀的第1试剂的范围内适宜确定，50～150μg/mL是特别优选的。

第1试剂中含的活化剂与上述的本发明的试剂中使用的活化剂同样，例如，可使用从鞣花酸、高岭土、硅藻土、胶体氧化硅、硅酸等酐选择的至少1种。在它们之中，鞣花酸及胶体氧化硅是特别优选的。

在本发明的实施方式中，第1试剂的溶剂只要是可溶解PG及活化剂，并且不妨碍APTT测定的溶剂就不特别限定，优选为，APTT测定用试剂中通常使用的缓冲液。作为那样的缓冲液，可举出例如，HEPES、TRIS、MOPS等。再有，第1试剂的pH通常是5～9，优选为6～8。

在本发明的实施方式中，第1试剂再含PG以外的磷脂是优选的。那样的磷脂与上述的本发明的试剂中使用的磷脂同样，例如，可使用从PE、PC及PS选择的至少1种。另外，第1试剂中的PG以外的磷脂的浓度与对于本发明的试剂描述的相同。

在本发明的实施方式中，第1试剂也可再含用于升高保存性或稳定性的添加剂。那样的添加剂与上述的本发明的试剂中使用的添加剂相同。

第2试剂中含的钙盐只要是APTT测定中通常使用的钙盐就不特别限定，可从钙和无机酸或有机酸的盐适宜选择。作为那样的钙盐，可举出例如，氯化钙、硫酸钙、亚硝酸钙、碳酸钙、乳酸钙、酒石酸钙等。在它们之中，氯化钙是特别优选的。第2试剂中含的钙盐的浓度可根据钙盐的种类或APTT的测定条件等适宜设定，通常是15～50mM，优选为20～30mM。当作为钙盐使用氯化钙时，在第2试剂中的浓度为15～30mM是优选的，20～25mM是更优选的。

本发明的试剂盒，除了第1试剂及第2试剂以外，也可作为其他试剂再含APTT测定中通常使用的参照用血浆等。作为那样的参照用血浆，可举出例如，正常血浆、精度管理用血浆、缺乏各种凝固因子的血浆、LA阳性血浆、含有第VIII因子抑制剂的血浆等。

在上述的试剂及试剂盒中，由PG的添加降低对LA的灵敏度，对凝固因子的灵敏度，在一般APTT测定条件之下，与以往的APTT测定用试剂同程度。另外，此试剂及试剂盒的使用方法无需在以往的APTT测定用试剂的使用方法的基础上进行特别变更。从而，将此试剂及试剂盒，在一般APTT测定条件之下，对正常血浆适宜地使用时，可得到与以往的APTT测定用试剂同样的测定结果。

在本发明的范围内包括，利用上述的本发明的试剂盒的APTT测定方法。在本发明的APTT测定方法（以下，也简称为“测定方法”）中，首先，作为第1混合步骤，将被检血浆与含活化剂及25μg/mL以上的PG的第1试剂混合。再有，对于第1试剂而言，与对于上述的本发明的试剂盒中含的第1试剂所描述的相同。

被检血浆只要是从全血除去血细胞而得到的血浆就不特别限定。作为那样的被检血浆，可举出例如，由从受试者采集的血液得到的血浆、上述的参照用血浆及它们的混合物。再有，从全血得到血浆的方法在所述技术中公知。例如，通过以不使血液溶血的方式离心分离而除去血细胞成分，可得血浆。另外，在从受试者采集的血液中，也可添加有血液凝固能力的临床检查中通常使用的公知的抗凝固剂。作为那样的抗凝固剂，可举出例如柠檬酸3钠。

被检血浆和第1试剂的混合比例（体积比）通常是8:2～2:8，优选为6:4～4:6，更优选为5:5。另外，被检血浆和第1试剂的反应时间通常是1～10分钟，优选为3～5分钟。温度条件通常为25～45℃，优选为35～38℃。

在第2混合步骤中，将上述的第1混合步骤中得到的样品和第2试剂混合。其中，对于第2试剂而言，与对于上述的本发明的试剂盒中含的第2试剂所描述的同样。样品和第2试剂的混合比例（体积比）通常是8:2～5:5，优选为7:3～6:4，更优选为2:1。再有，温度条件与第1混合步骤同样。

在测定凝固时间的步骤中，测定上述的第2混合步骤中得到的样品的凝固时间。在本发明的实施方式中，可为人使用秒表等目测测定至纤维蛋白析出的时间，也可使用自动分析装置测定。作为那样的装置，可举出例如，测定从样品得到的透射光的变化或散射光的变化等的光学信息的装置。作为测定装置，可适宜地使用具备光学信息检测部的市售的自动分析装置，可举出例如，Sysmex株式会社制的CS-2000i及CS-5000。

在本发明的范围包括，利用上述的APTT测定方法，判断非源于LA的血液凝固异常的有无。在本发明的非源于LA的血液凝固异常的有无的判断方法（以下，也简称为“判断方法”）中，首先，作为第1混合步骤，将被检血浆与含活化剂及25μg/mL以上的PG的第1试剂混合。再有，此第1混合步骤可与上述的本发明的APTT测定方法同样地进行。另外，被检血浆及第1试剂分别与对于上述的本发明的测定方法及试剂盒所描述的相同。

其中，非源于LA的血液凝固异常只要是由于被检血浆中存在LA以外的原因而APTT延长的凝固异常就不特别限定，可举出例如，与凝固因子的缺乏或异常或凝固因子的抑制剂关联的疾病。作为具体性的疾病，可举出例如，血友病A、血友病B、Von Willebrand病、第XI因子缺乏症、第XII因子缺乏症、高分子激肽原缺乏症、前激肽释放酶缺乏症、维生素K缺乏症、后天性血友病等。

在本发明的别的实施方式中，当由交叉混合试验进行LA以外的血液凝固异常的有无的判断时，作为被检血浆，使用受试者的血浆、正常血浆及将它们以指定的比例混合的血浆（混合血浆）的3种。作为混合血浆，至少使用将受试者的血浆和正常血浆以体积比表示而以1:1混合的血浆。优选为，使用将受试者的血浆和正常血浆以体积比表示而以8:2、5:5及2:8混合的3种血浆。将受试者的血浆和正常血浆混合之后温育是优选的。温育时间可根据作为对象的血液凝固异常或混合比等适宜确定。例如，在疑似存在如后天性血友病一样的凝固因子的抑制剂的被检血浆的情况中，作为温育时间，通常为0.5～4小时、优选为1～3小时。另外，温育时的温度条件通常为25～45℃，优选为35～38℃。

本发明的判断方法中的第2混合步骤及测定凝固时间的步骤可与上述的本发明的APTT测定方法同样地进行。再有，对于第2试剂而言，与对于上述的本发明的试剂盒所描述的相同。

在本发明的判断方法中，基于测定步骤中得到的凝固时间，判断被验血浆中是否有非源于LA的血液凝固异常。用本发明的试剂盒，由于对LA的灵敏度降低，当对被验血浆测定的APTT超过指定的阈值时，也可判断为其被检血浆中疑有非源于LA的血液凝固异常。那样的阈值可根据从健康人得到的正常血浆的APTT数据的蓄积而定，例如，可使用正常基准值。再有，正常基准值的上限是对于100例以上的健康人血浆的APTT数据进行统计计算而得到的“平均值+1.96SD（标准偏差）”。或者，也可蓄积由本发明的试剂的正常血浆的APTT数据，从该数据定APTT的正常范围，当超出此范围时，判断为被检血浆中疑有非源于LA的血液凝固异常。

当作为被检血浆，使用如CoagtrolN（Sysmex株式会社）一样的正常标准血浆时，算出APTT比，当此比超过指定的阈值时，作为疑有非源于LA的血液凝固异常。再有，APTT比通过受试者的血浆的APTT的值除以正常血浆的APTT的值来算出。APTT比的阈值可根据从健康人得到的正常血浆的APTT数据的蓄积而定，例如，可将阈值设定为1.2以上。

当由交叉混合试验进行非源于LA的血液凝固异常的有无的判断时，将被检者的血浆和正常血浆的混合比作为横轴，由以APTT作为纵轴的折线坐标图，可判别2种非源于LA的血液凝固异常。即，只要折线坐标图的形状在视觉上向下凸，就疑有凝固因子的缺乏或异常，向上凸就疑有凝固因子的抑制剂的存在。

在本发明的实施方式中，判断方法的各步骤可用手动方法进行，但为了进行精度更高的判断，将全部的步骤由自动分析装置进行是优选的。作为那样的装置，只要是可自动地测定APTT，并且比较测定值和阈值而显示判断结果的装置就不特别限定，例如，可适宜地使用全自动血液凝固测定装置CS-2000i（Sysmex株式会社）。

接下来，通过实施例详细地说明本发明，本发明不限于这些实施例。

实施例

实施例1：添加磷脂酰甘油对LA的灵敏度的影响的检查

（1-1）APTT测定用试剂的制备

制备不含PG的以往的APTT测定用试剂（试剂A）。再有，试剂A中确认不到白色混浊及沉淀。

<试剂A>

试剂A，作为活化剂含0.1mmol/L鞣花酸（岸田化学株式会社），作为磷脂含140μg/mL L-α-磷脂酰乙醇胺（Avanti Polar Lipids，Inc.）、160μg/mL L-α-磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，Inc.）及40μg/mL L-α-磷脂酰丝氨酸（Avanti Polar Lipids，Inc.），作为缓冲液含50mM HEPES缓冲液（pH7.35）、作为防腐剂含0.1%叠氮化钠、作为抗氧化剂含3-t-丁基-4-羟基苯甲醚（Nacalai tesque株式会社）。

作为本发明的试剂，制备含PG的APTT测定用试剂（试剂B～E）。再有，任何试剂中均确认不到白色混浊及沉淀。

<试剂B～E>

试剂B～E分别是向上述的试剂A以25、50、75及100μg/mL的浓度添加L-α-磷脂酰甘油（Avanti Polar Lipids，Inc.）的试剂。

上述的试剂A～E之外，作为对照，使用作为市售的APTT测定用试剂的肌动蛋白FSL（Siemens公司）。再有，此试剂中含的磷脂是从家免的大脑及大豆提取的天然来源磷脂。

（1-2）APTT的测定（i）样品

作为样品，使用正常血浆（29例）、疑含LA的血浆（6例）及凝固因子缺乏血浆（8例）。另外，为了算出Rosner指数值，使用作为市售的正常血浆的CoagtrolN（Sysmex株式会社）。

（ii）APTT的测定

将样品（50μL）分注于反应比色杯中，于37℃加温1分钟。向其中添加预先于37℃加温的上述的APTT测定用试剂（50μL），于37℃反应3分钟。然后，混合25mM氯化钙液（50μL）而测定凝固时间。另外，为了得到对各试剂的LA的灵敏度的指标，基于Rosner.E等的方法（Thromb.Haemast.1987、57:144-147），算出Rosner指数值。即，对于将疑含LA的血浆和正常血浆（CoagtrolN）以1:1混合的血浆（1:1混合血浆）也同样地测定凝固时间，根据下述的式（1）算出。再有，在凝固时间的测定中，使用全自动血液凝固测定装置CS-2000i（Sysmex株式会社）。另外，对各样品进行各2次测定，得到凝固时间的平均值。

Rosner指数值=［（(1:1混合血浆的APTT)-(正常血浆的APTT)）/（疑含LA的血浆的APTT）］×100…式（1）

将结果与各试剂的磷脂组成一同示于表1。再有，在表1中，“LA阳性血浆”是在疑含LA的血浆6例之中被确证含LA的血浆。另外，“测试（秒）”表示LA阳性血浆的凝固时间，“1:1混合（秒）”表示将LA阳性血浆和正常血浆以1:1混合的血浆的凝固时间。

表1

（1-3）性能评价

从表1可知，正常血浆的凝固时间，无论使用任何试剂时，均在27～30秒钟的范围内。其中，在所述技术领域中，作为APTT测定用试剂的性能一般地要求正常血浆的APTT在26.0～30.0秒钟的范围内。从而知，即使向APTT测定用试剂添加PG也不给正常血浆的测定带来影响。

从表1知，含LA的血浆的APTT及Rosner指数值以试剂中的PG浓度依赖性地降低。从而显示，用本发明的APTT测定试剂可使对LA的灵敏度降低。对此显示，用不含PG的试剂A及市售品时APTT及Rosner指数值大，对LA的灵敏度高。再有，由凝固因子缺乏血浆的测定结果知，即使向APTT测定用试剂添加PG，也不给对凝固因子的灵敏度带来影响（数据未显示）。

实施例2：磷脂的组成的调节对LA的灵敏度的影响的检查

（2-1）APTT测定用试剂的制备

制备不含PG，并且分别以各种浓度含PE、PC及PS的APTT测定用试剂（试剂F～N）。再有，任何试剂均，作为活化剂含0.1mmol/L鞣花酸（岸田化学株式会社），作为缓冲液含50mM HEPES缓冲液（pH7.35）、作为防腐剂含0.1%叠氮化钠、作为抗氧化剂含3-t-丁基-4-羟基苯甲醚（Nacalai tesque株式会社）。接下来显示各试剂的磷脂的组成。

<试剂F～J>

试剂F～J均含140μg/mL L-α-磷脂酰乙醇胺（Avanti Polar Lipids，Inc.）及160μg/mL L-α-磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，Inc.），以互相不同的浓度含L-α-磷脂酰丝氨酸（Avanti Polar Lipids，Inc.）。即，试剂F～J分别以10、20、30、40及50μg/mL的浓度含L-α-磷脂酰丝氨酸。再有，试剂I的磷脂组成是作为APTT测定用试剂而言标准的组成。

<试剂K及L>

试剂K及L均含160μg/mL L-α-磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，Inc.）及40μg/mL L-α-磷脂酰丝氨酸（Avanti Polar Lipids，Inc.），以互相不同的浓度含L-α-磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，Inc.）。即，试剂K及L分别以40及250μg/mL的浓度含L-α-磷脂酰胆碱。

<试剂M及N>

试剂M及N均含140μg/mL L-α-磷脂酰乙醇胺（Avanti Polar Lipids，Inc.）及40μg/mL L-α-磷脂酰丝氨酸（Avanti Polar Lipids，Inc.），以互相不同的浓度含L-α-磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，Inc.）。即，试剂M及N分别以40及320μg/mL的浓度含L-α-磷脂酰胆碱。

除了上述的试剂F～N之外，作为对照，也使用作为本发明的APTT测定用试剂的上述的试剂E。

（2-2）APTT的测定

作为样品，使用与实施例1相同的样品。对于这些样品，使用在上述（2-1）中调制的试剂，与实施例1同样地进行凝固时间测定，算出Rosner指数值。将结果与各试剂的磷脂组成一同示于表2。

表2

（2-3）性能评价

由试剂F～J的结果看出，随着PS浓度变高，含LA的血浆的 APTT及Rosner指数值降低，但比本发明的试剂的值高。另外，用试剂F及J时，正常血浆的APTT不在26～30秒钟的范围内。再者，当PS浓度在30～50μg/mL之间时，在Rosner指数值中未确认大的差异。再有，虽然未显示数据，但在本实施例中，当试剂中的PS浓度超过50μg/mL时，PS不完全溶解而在试剂中发生白色混浊或沉淀。从而认为，由PS浓度的调节降低对LA的灵敏度是困难的。

由试剂I、K及L的结果看出，PE浓度低，则含LA的血浆的APTT及Rosner指数值降低，但比本发明的试剂的值高。另外，用试剂K时，正常血浆的APTT不在26～30秒钟的范围内。从而认为，由PE浓度的调节降低对LA的灵敏度是困难的。再有，虽然未显示数据，但在本实施例中，当试剂中的PE浓度超过250μg/mL的，PE不完全溶解而试剂中发生白色混浊或沉淀。

由试剂I、M及N的结果看出，PE浓度高，则含LA的血浆的APTT及Rosner指数值降低，但比本发明的试剂的值高。另外，用试剂M及N时，正常血浆的APTT不在26～30秒钟的范围内。再有，虽然未显示数据，但在本实施例中，当试剂中的PC浓度超过320μg/mL时，PC不完全溶解而试剂中发生白色混浊或沉淀。从而认为，由PC浓度的调节降低对LA的灵敏度是困难的。

Claims

1.活化部分凝血活酶时间测定方法，其包括下述步骤：

将被检血浆和含活化剂及25μg/mL以上的磷脂酰甘油的第1试剂混合的第1混合步骤，

将第1混合步骤中得到的样品和含钙盐的第2试剂混合的第2混合步骤，和

测定第2混合步骤中得到的样品的凝固时间的步骤。

2.权利要求1所述的方法，其中上述第1试剂中的磷脂酰甘油的浓度是150μg/mL以下。

3.权利要求1所述的方法，其中上述第1试剂的磷脂酰甘油的浓度是50～150μg/mL。

4.权利要求1所述的方法，其中上述磷脂酰甘油是合成磷脂。

5.权利要求1所述的方法，其中上述第1试剂进一步含有活化剂。

6.权利要求5所述的方法，其中上述活化剂选自下列的至少1种：鞣花酸、高岭土、硅藻土、胶体氧化硅和硅酸酐。

7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中上述第1试剂进一步含有磷脂酰甘油以外的磷脂。

8.权利要求7所述的方法，其中上述磷脂酰甘油以外的磷脂选自下列的至少1种：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。

9.活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒，包含：

含磷脂酰甘油的第1试剂，和

含钙盐的第2试剂、

其中上述第1试剂中的磷脂酰甘油的浓度为25μg/mL以上。

10.权利要求9所述的试剂盒，其中上述第1试剂中的磷脂酰甘油的浓度为150μg/mL以下。

11.权利要求9或10所述的试剂盒，其中上述第1试剂的磷脂酰甘油的浓度是50～150μg/mL。