CN106596981A - 一种用于测定凝血功能的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于测定凝血功能的试剂盒，所述试剂盒包含酒石酸钠。当采用凝固法测定血浆的凝血功能时，血浆中C反应蛋白的存在，会影响检测结果值，从而导致检测结果出现误差。加入酒石酸钠后，可屏蔽血浆中C反应蛋白对检测结果的影响，提升光学法检测凝血功能的准确度，从而更好地反映临床病人的凝血功能。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种一种用于测定凝血功能的试剂盒。
背景技术
C反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)影响凝血过程，可与血浆中的钙离子(凝血因子IV)反应，影响光学法凝血功能检测，它能促进凝血机制，加速纤维蛋白单体聚合，缩短凝血时间。研究发现，CRP含量越高，纤维蛋白凝块强度就越大。
在凝血功能检查中，凝固法是检测PT、APTT、FIB、TT、内源凝血因子(FVIII、XI、XII)以及外源凝血因子(FII、V、VII、X)的最多用方法，它是基本测试原理是光学法的散射光检测(用660nm光电二极管检测散射光量的变化)，还并用了百分比式的测定原理。
当试剂加入标本后，凝血开始启动，随之光学出现变化，仪器把这种光学的变化描绘成凝固曲线：把开始出现凝集的起始点作为0％、把完全凝固的终点作为100％、把50％变化点处作为凝固时间(报告点)，当测定含有干扰物(黄疸、溶血、高脂血症等)或低纤维蛋白原血症的特殊样本时，其作为起始点的0％的基线会随之上移或下移，相当于扣除本底干扰。以APTT为例，血浆样本经过一定时间的温育后，加入反应试剂，仪器采用波长为660nm的光照射反应物，通过测量透射光或散射光量的改变来测定凝血过程，即纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白过程中的浊度变化，从透射光或散射光量的测定可得凝固曲线，再通过百分比原理求得凝血时间。
凝血值(即可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白所需时间)是通过光量的变化来体现的，在此过程中，凝血时间与凝血因子有关，与CRP无关，但是，当血浆中含有CRP时，由于CRP参与凝血过程，它会与钙离子形成复合物并沉淀，引起光量的变化。在采用光学法测定凝血功能时，检测设备会将该变化归固于由凝血因子造成，从而导致凝血结果不准确。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于测定凝血功能的试剂盒，该试剂盒基于酒石酸盐对C反应蛋白屏蔽剂的作用原理，可有效排除掉C反应蛋白在测定凝血功能时对凝血值的干扰，使测定结果更加准确。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于测定凝血功能的试剂盒，所述试剂盒包含酒石酸钠。
优选的，所述试剂盒为用于测定凝血酶时间、凝血酶原时间或活化部分凝血活酶时间的体外诊断试剂盒。
C反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)是一种急性时相蛋白，单条多肽链上含187个氨基酸，氨基端残基为吡咯烷酮羧酸，羧基端为脯氨酸。CRP会结合在死亡细胞或微生物外膜上的磷酸胆碱(phosphocholine)，以活化补体系统。当体内有急性炎症、细菌感染、组织的损伤时，CRP在数小时内出现，而疾病治愈后又很快就消失。CRP是急性时相反应蛋白，正常情况下含量极小，但在急性创伤和感染时，CRP的浓度急剧升高。
由于现有的凝血功能检测多基于光学法检测，而CRP可与血浆中的钙离子(凝血因子IV)反应，影响光学法凝血功能检测，因此屏蔽CRP对提升凝血功能检测的准确性有很大帮助。
现有的凝血功能检测反应体系可选自用于测定凝血酶时间(thrombin time，TT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)或活化部分凝血活酶时间(activated partialthromboplastin time，APTT)的反应体系，这些反应体系属于现有技术，对本领域技术人员是熟悉的。更优选的，选自光学法检测凝血功能的检测反应体系。
本发明基于酒石酸盐作为C反应蛋白屏蔽剂的应用。
酒石酸钠为最优选的。此外还可以选择酒石酸盐，优选为酒石酸金属离子盐，更优选的为酒石酸的碱金属盐或酒石酸镁；所述碱金属盐可选自酒石酸钾、酒石酸钠、酒石酸钾钠复合盐等。
血浆中的C反应蛋白，会与血浆中存在的凝血因子或部分凝血凝血因子反应，加入酒石酸盐，可以避免某些凝血因子与C反应蛋白之间的反应。
优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒中还包含钙盐。
优选的，如上所述的试剂盒，所述钙盐为氯化钙；还可以选自硫酸钙等可电离出二价钙离子的钙盐。
优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒为活化部分凝血活酶时间的体外诊断试剂盒；
所述试剂盒中还包括磷脂和活化剂；
优选的，所述磷脂及活化剂组成第一试剂，所述钙盐及酒石酸钠组成第二试剂。
优选的，如上所述的试剂盒，所述活化剂选自白陶土、鞣花酸、硅藻土中的任一种，更优选为鞣花酸。
优选的，如上所述的试剂盒，所述磷脂为合成磷脂；
优选的，所述合成磷脂包括质量比为(25～35)：70的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，可选地，还包括磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油中的一种。
优选的，如上所述的试剂盒，在所述第一试剂中，所述磷脂的浓度为50～600μg/mL，优选为100～200μg/mL；磷脂的浓度还可以选自120～180μg/mL；140～160μg/mL；
所述活化剂的浓度按磷脂与活化剂的浓度比1000：1～50：1加入，优选为100：1～50：1。
优选的，如上所述的试剂盒，所述第一试剂中还包括缓冲液、稳定剂以及调节剂中的一种或多种；
优选的，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(N-吗啉)丙磺酸中的一种或多种；更优选的，所述缓冲液的浓度为20～100mM；pH为6～8。
优选的，为了避免APTT测定试剂中的磷脂氧化，同时也为了制备稳定性较好的APTT测定试剂，包括避免试剂中微生物和细菌的繁衍，试剂盒中还需要添加稳定剂，所述稳定剂选自氯化钠、苯酚以及甘氨酸中的一种或多种；所述氯化钠的浓度为20～150mM；所述苯酚的浓度为0.5～3mg/L；所述甘氨酸的浓度为质量体积百分比1～3％；
优选的，所述调节剂为二价金属离子的盐类和/或胍化合物；
更优选的，所述二价金属离子的盐类选自硫酸铜、硫酸镍、硫酸镁和氯化镁中的一种或多种；最优选的为氯化镁；所述氯化镁的浓度为0.1～2mM；
更优选的，所述胍化合物选自氨基胍盐酸盐，浓度为50～200mM，更优选为80～150mM。
优选的，如上所述的试剂盒，在所述第二试剂中，所述钙盐的浓度为10mM～50mM，更优选为20～30mM；所述酒石酸钠的浓度为15～150mM，更优选为30mM～70mM。
优选的，如上所述的试剂盒，在所述第二试剂中还包括丁基羟基茴香醚、苯酚和缓冲液中的一种或多种；
优选的，所述丁基羟基茴香醚的浓度为质量体积百分比0.01～0.1％；
优选的，所述苯酚的浓度为0.5～3mg/L；
优选的，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(N-吗啉)丙磺酸中的一种或多种；更优选的，所述缓冲液的浓度为20～100mM；pH为6～8。
此外，本发明还提供了一种凝血诊断试剂，包括酒石酸钠；
所述诊断试剂作为添加剂添加于光学法检测凝血功能的检测反应体系中。
优选的，如上所述的凝血诊断试剂，所述酒石酸钠在所述光学法检测凝血功能的检测反应体系中的终浓度为3mM～50mM。
优选的，如上所述的凝血诊断试剂，所述酒石酸钠在所述光学法检测凝血功能的检测反应体系中的终浓度为10mM～25mM。
优选的，如上所述的凝血诊断试剂，所述诊断试剂中还包括钙离子。更优选的，所述钙离子以氯化钙的形式加入。
优选的，如上所述的凝血诊断试剂，所述钙离子在所述光学法检测凝血功能的检测反应体系中的终浓度为3mM～20mM。
优选的，如上所述的凝血诊断试剂，所述钙离子在所述光学法检测凝血功能的检测反应体系中的终浓度为6mM～10mM。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
当采用凝固法测定血浆的APTT值，血浆中C反应蛋白的存在，会影响APTT值，因为在凝固法测定APTT时，APTT的值是通过透射光量变化(δD值)来确定的，而C反应蛋白会导致透射光量变化(δD值)发生变化，特别是在测定过程的初期，由C反应蛋白与血浆中含有的成份发生反应而引起的透射光量变化(δD值)，会使凝血分析仪误以为是由血浆中的凝血因子引起，从而导致检测结果出现误差。
加入酒石酸盐后，可屏蔽血浆中C反应蛋白对APTT结果的影响，提升光学法(凝固法)检测APTT的准确度，从而更好地反映临床病人的凝血功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3的结果图；
图2为本发明实施例4的结果图。
具体实施方式
除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种测定凝血功能的试剂盒，其包括第一试剂和第二试剂。
第一试剂主要由磷脂及活化剂配置而成，配置方法为常规方法，各组份之间的关系和终浓度为；
磷脂选自质量比为25：70：20的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺；磷脂在第一试剂中的终浓度为50μg/mL。
活化剂选自硅藻土；硅藻土的浓度按磷脂与活化剂的浓度比1000：1加入。
第一试剂中还包括稳定剂以及调节剂。
稳定剂选自甘氨酸；在第一试剂中的终浓度为质量体积百分比2％；
调节剂选自硫酸铜；在第一试剂中的终浓度为2mM；
第二试剂主要由磷脂及活化剂配置而成；
在第二试剂中，钙盐的浓度为10mM；所述酒石酸钠的浓度为150mM。
第二试剂中还包括丁基羟基茴香醚，丁基羟基茴香醚的浓度为质量体积百分比0.1％；调节第二试剂pH为7.4。
实验例2
一种测定凝血功能的试剂盒，其包括第一试剂和第二试剂。
第一试剂主要由磷脂及活化剂配置而成，配置方法为常规方法，各组份之间的关系和终浓度为；
磷脂包括质量比为35：70的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，磷脂的浓度为200μg/mL。
活化剂选自白陶土；白陶土的浓度按磷脂与活化剂的浓度比50：1加入。
第一试剂中还包括缓冲液、稳定剂以及调节剂；
缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸，浓度为100mM；pH为7。
稳定剂选自苯酚；浓度为2mg/L.
调节剂为硫酸镁和氨基胍盐酸盐；
硫酸镁的浓度为1.2mM；氨基胍盐酸盐浓度为150mM。
第二试剂主要由钙盐及酒石酸钠组成；
在第二试剂中，钙盐的浓度为50mM；酒石酸钠的浓度为15mM。
第二试剂中还包括苯酚和缓冲液；
苯酚的浓度为2mg/L；
冲液选自3-(N-吗啉)丙磺酸；缓冲液的浓度为70mM；pH为7。
实施例3
酒石酸钠与氯化钙共同作用抑制C反应蛋白对凝血检测过程中透射光量的影响。
称取1.5g三羟甲基氨基甲烷和5.8g氯化钠，加入500mL纯化水中，混匀，加入10％盐酸1mL，搅拌溶解，测定混合液的pH，如果混合液的pH值不为7.3，用稀盐酸或稀氢氧化钠调整至pH值7.3，定容至900mL，加入100mg的合成磷脂和0.5的丁基羟基茴香醚，所述合成磷脂包括质量比为25：70的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，搅拌30min，加入2mg鞣花酸、0.05g氯化镁、5.5g氨基胍盐酸盐、15g甘氨酸、1mg苯酚，加入纯化水至1升，继续搅拌30min，用滤膜过滤，得滤液为第一试剂。
称取1.5g三羟甲基氨基甲烷和5.8g氯化钠，加入500mL纯化水中，混匀，加入10％盐酸1mL，搅拌溶解，测定混合液的pH，如果混合液的pH值不为7.3，用稀盐酸或稀氢氧化钠调整至pH值7.3，定容至900mL，加入2.77g氯化钙、1mg苯酚、9.7g酒石酸钠(购自国药集团化学试剂北京公司)，搅拌30min，过滤得第二试剂。
作为对比的方式，将待测样本分为两组：
待测样本为在正常血浆中添加不同浓度的C反应蛋白(Randox Laboratories)，C反应蛋白的浓度从2.65mg/L～3.15mg/L的范围内梯度分布(图1横坐标所示)。
第一组：50μL待测样本与50μL的上述第一试剂混合及50μL的上述第二试剂混合孵育，测定第二试剂加入前与加入3min后的透射光量变化δD。δD的值越大，说明待测样本中C反应蛋白的干扰能力越强。其中，C反应蛋白对凝血功能的检测影响是通过对比得出的。
第二组与第一组的区别仅在于第二组所用的第二试剂中并未添加酒石酸钠。
结果如图1所示，从图1可知，单独添加氯化钙并不能有效抑制C反应蛋白对检测结果中透射光量的影响；而氯化钙和酒石酸钠的组合则可以有效抑制C反应蛋白。
实施例4
酒石酸加入量对凝血检测过程中透射光量的影响。
称取1.5g三羟甲基氨基甲烷和5.8g氯化钠，加入500mL纯化水中，混匀，加入10％盐酸1mL，搅拌溶解，测定混合液的pH，如果混合液的pH值不为7.3，用稀盐酸或稀氢氧化钠调整至pH值7.3，定容至900mL，加入100mg的合成磷脂和0.5的丁基羟基茴香醚，所述合成磷脂包括质量比为30：70的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，搅拌30min，加入2mg鞣花酸、0.05g氯化镁、5.5g氨基胍盐酸盐、15g甘氨酸、1mg苯酚，加入纯化水至1升，继续搅拌30min，用滤膜过滤，得滤液为第一试剂。
称取1.5g三羟甲基氨基甲烷和5.8g氯化钠，加入500mL纯化水中，混匀，加入10％盐酸1mL，搅拌溶解，测定混合液的pH，如果混合液的pH值不为7.3，用稀盐酸或稀氢氧化钠调整至pH值7.3，定容至900mL，加入2.77g氯化钙、1mg苯酚、酒石酸钠，搅拌30min，过滤得第二试剂。
作为对比的方式，将50μL的第二试剂中酒石酸钠的添加量按不同浓度配制。酒石酸钠的加入量为0～200mM，对应的δD变化如图2所示。δD的值越大，说明待测样本中C反应蛋白的干扰能力越强。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于测定凝血功能的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含酒石酸钠。
2.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含钙盐。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述钙盐为氯化钙。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为活化部分凝血活酶时间的体外诊断试剂盒；
所述试剂盒中还包括磷脂和活化剂；
优选的，所述磷脂及活化剂组成第一试剂，所述钙盐及酒石酸钠组成第二试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述活化剂选自白陶土、鞣花酸、硅藻土中的任一种，优选为鞣花酸。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述磷脂为合成磷脂；
优选的，所述合成磷脂包括质量比为(25～35)：70的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，可选地，还包括磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油中的一种。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，在所述第一试剂中，所述磷脂的浓度为50～600μg/mL，优选为100～200μg/mL；
所述活化剂的浓度按磷脂与活化剂的浓度比1000：1～50：1加入，优选为100：1～50：1。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中还包括缓冲液、稳定剂以及调节剂中的一种或多种；
优选的，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(N-吗啉)丙磺酸中的一种或多种；更优选的，所述缓冲液的浓度为20～100mM；pH为6～8；
优选的，所述稳定剂选自氯化钠、苯酚以及甘氨酸中的一种或多种；所述氯化钠的浓度为20～150mM；所述苯酚的浓度为0.5～3mg/L；所述甘氨酸的浓度为质量体积百分比1～3％；
优选的，所述调节剂为二价金属离子的盐类和/或胍化合物；
更优选的，所述二价金属离子的盐类选自硫酸铜、硫酸镍、硫酸镁和氯化镁中的一种或多种；最优选的为氯化镁；所述氯化镁的浓度为0.1～2mM；
更优选的，所述胍化合物选自氨基胍盐酸盐，浓度为50～200mM。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，在所述第二试剂中，所述钙盐的浓度为10mM～50mM；所述酒石酸钠的浓度为15～150mM。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，在所述第二试剂中还包括丁基羟基茴香醚、苯酚和缓冲液中的一种或多种；
优选的，所述丁基羟基茴香醚的浓度为质量体积百分比0.01～0.1％；
优选的，所述苯酚的浓度为0.5～3mg/L；
优选的，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(N-吗啉)丙磺酸中的一种或多种；更优选的，所述缓冲液的浓度为20～100mM；pH为6～8。
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