CN101059521A - 一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂及其测定方法 - Google Patents
一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂及其测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂及其测定方法，配制本试剂的原料组成及其含量如下：凝血酶：每毫升本试剂含2－20单位；缓冲剂：每升本试剂含5－100毫摩尔；稳定剂：每100毫升本试剂含0.05－10克；去离子水：余量。本发明的测定方法如下：(1)用含稳定剂的缓冲液配制每毫升含2－20单位凝血酶的本试剂；(2)测定方法：a.将本试剂及血浆样本分别于37℃温育后，按1∶1的体积比混合；b.记录血凝时间；c.通过标准曲线求出血浆样本的纤维蛋白原含量。本发明的有益效果是测定时不用稀释血浆样本，使测定方法简便；降低了本试剂的制造成本；提高了测量的准确度，减少了操作误差。
Description
技术领域
本发明涉及血浆样本纤维蛋白原(FIB)含量的测定试剂及其测定方法，属于临床检测试剂及检测方法技术领域。
背景技术
血浆纤维蛋白原(FIB)定量测定是临床上广泛进行的血凝四项之一(即PT、TT、FIB和APTT)。冯·克劳斯(von Clauss)FIB测定方法属于功能法测定，是美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的方法。该法的原理是，高浓度凝血酶与低浓度FIB血浆反应，FIB含量与血凝时间成反比。通过在双对数坐标纸上所做的标准曲线可以查出待测血浆的FIB含量。然而该法存在两个缺点：
一、必须使用高浓度的凝血酶，通常为100～200单位/毫升；二、待测血浆必须提前稀释5～30倍，降低其中的FIB含量。所以，该法成本较高，操作繁琐，特别是稀释血浆过程容易产生误差。美国专利5,292,664和6,448,024通过在高浓度凝血酶溶液中添加凝血酶抑制剂，制成凝血活性降低了的FIB试剂，从而达到直接测定样本中FIB含量的目的。但该法仍未解决FIB试剂的高成本问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的缺点，而提供一种测定方法简便、测量准确度高、成本低的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂及其测定方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：
一、本发明的试剂的技术方案，配制本试剂的原料组成及其含量如下：
凝血酶：每毫升本试剂含2-20单位
缓冲剂：每升本试剂含5-100毫摩尔
稳定剂：每100毫升本试剂含0.05-10克
去离子水：余量。
所述的凝血酶采用用生化手段从动物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重组或化学修饰的凝血酶制品。
所述的缓冲剂选自下述中的任一种；
HEPES 中文名为N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸
TRIS 中文名为三(羟甲基)氨基甲烷
PB 中文名为磷酸缓冲液
MOPSO 中文名为3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸。
所述的稳定剂选自下述中的一种或几种：
无机盐、有机酸及其盐类、多羟基化合物、氨基酸、蛋白质；
各种稳定剂的含量如下：
无机盐： 每100毫升本试剂含0.1-2克
有机酸及其盐类： 每100毫升本试剂含0.1-5克
多羟基化合物： 每100毫升本试剂含0.1-10克
氨基酸： 每100毫升本试剂含0.5-10克
蛋白质： 每100毫升本试剂含0.05-2克。
所述的无机盐选自下述中的一种：氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、溴化钾、硫酸钠、硫酸钾；
所述的有机酸及其盐类选自下述中的一种：乙酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸、山梨酸、乙酸钠、丙酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、山梨酸钾；
所述的多羟基化合物选自下述中的一种：蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
所述的氨基酸选自下述中的一种：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述的蛋白质选自下述中的一种：牛血清白蛋白、明胶。
本试剂(以下简称FIB试剂)的理论根据如下：
本申请人在试验中发现，由低浓度凝血酶组成的FIB试剂(每毫升含2～20个单位的凝血酶)与高浓度FIB血浆(即未经稀释的正常血浆)反应，FIB含量仍与血凝时间成反比；用低浓度凝血酶配制FIB试剂和高浓度FIB血浆所制作的标准曲线与用高浓度凝血酶配制的FIB试剂与低浓度FIB血浆所制作的标准曲线具有同样好的线性相关(相关系数R2大于0.98)。所以用低浓度凝血酶配制的FIB试剂，无需稀释血浆即可直接测定样本的FIB含量。
二、本发明的测定方法的技术方案如下：
(1)用含稳定剂的缓冲液配制每毫升含2-20单位凝血酶的本试剂；本试剂的PH值范围为PH7.0-8.0；
(2)用配制好的本试剂按常规方法绘制标准曲线；
(3)测定方法：
a、将本试剂及血浆样本分别于37℃温育后，按1∶1的体积比混合；
b、记录血凝时间；
c、通过标准曲线求出血浆样本的纤维蛋白原含量。
所述的凝血酶采用用生化手段从动物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重组或化学修饰的凝血酶制品。
所述的缓冲剂选自下述中的任一种；
HEPES 中文名为N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸
TRIS 中文名为三(羟甲基)氨基甲烷
PB 中文名为磷酸缓冲液
MOPSO 中文名为3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸。
所述的稳定剂选自下述中的一种或几种：
无机盐、有机酸及其盐类、多羟基化合物、氨基酸、蛋白质；
所述的各种稳定剂的含量如下：
无机盐： 每100毫升本试剂含0.1-2克
有机酸及其盐类： 每100毫升本试剂含0.1-5克
多羟基化合物： 每100毫升本试剂含0.1-10克
氨基酸： 每100毫升本试剂含0.5-10克
蛋白质： 每100毫升本试剂含0.05-2克。
所述的无机盐选自下述中的一种：氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、溴化钾、硫酸钠、硫酸钾；
所述的有机酸及其盐类选自下述中的一种：乙酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸、山梨酸、乙酸钠、丙酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、山梨酸钾；
所述的多羟基化合物选自下述中的一种：蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
所述的氨基酸选自下述中的一种：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述的蛋白质选自下述中的一种：牛血清白蛋白、明胶。
本发明的测定方法的具体方案如下：
FIB试剂用前先于37℃温育5分钟，使本试剂达到所需温度。将50μl血浆加入血凝仪的比色杯中，37℃温育1分钟，立即添加50μl已预热至37℃的FIB试剂，记录血凝时间，改变FIB试剂中的凝血酶浓度使正常样本(FIB含量为200～400mg/dl)的血凝时间达到6～80秒，更好是10～50秒，最好是15～30秒。
标准曲线制作：将参比血浆用咪唑缓冲液进行对倍稀释，使FIB含量分别达到适宜的浓度梯度，如600mg/dl，300mg/dl、150mg/dl和100mg/dl，分别取此不同浓度的参比血浆50μl于血凝仪的比色杯中，37℃温育1分钟，立即添加50μl预热至37℃的FIB试剂，记录血凝时间(s)。以参比血浆的FIB含量(mg/dl)为纵坐标，以相应的血凝时间(s)为横坐标，在双对数坐标纸上作标准曲线；或用excel软件进行线性回归处理和作图(见图1)。
在同样条件下，待测血浆样本直接与FIB试剂反应，根据其血凝时间(s)，即可在标准曲线上查出相应的FIB含量(mg/dl)。如果将定标点的FIB含量和对应的血凝时间(s)依次输入全自动或半自动血凝仪，测定结束时，仪器将自动给出待测血浆样本的FIB含量(mg/dl)。
本发明的有益效果如下：
(1)测定时不用稀释血浆样本，使测定方法简便。
(2)与临床常用的clauss FIB试剂相比(其凝血酶浓度通常为每毫升含100～200个单位)大大降低了凝血酶用量，从而降低了本试剂的制造成本。
(3)提高了测量的准确度，减少了操作误差。这一优点体现在以下3个方面：a、使用液体试剂，无需复溶，不存在瓶间差问题；b、省去了测定过程中的血浆样本稀释步骤，避免了稀释过程产生的误差；c、制作标准曲线所用定标点的FIB含量涵盖了正常血浆FIB含量范围(200～400mg/dl)，避免了稀释血浆引起的生理环境变化，因而更符合功能测定方法的要求。
附图说明
图1为用本发明的FIB试剂所作的FIB标准曲线。
具体实施方式
一、本发明试剂的实施例如下表：
| 组分 | 实施例 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 凝血酶(单位/毫升FIB试剂)缓冲剂(毫摩尔/升FIB试剂)稳定剂(克/100毫升FIB试剂)去离子水(定容至升) | 250.051 | 52031 | 106061 | 20100101 |
注：(1)上表中的凝血酶采用用生化手段从动物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重组或化学修饰的凝血酶制品。
(2)上表中的缓冲剂选自下述中的任一种；
HEPES 中文名为N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸
TRIS 中文名为三(羟甲基)氨基甲烷
PB 中文名为磷酸缓冲液
MOPSO 中文名为3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸。
(3)上表中的稳定剂选自下述中的一种或几种：
无机盐、有机酸及其盐类、多羟基化合物、氨基酸、蛋白质；
各种稳定剂的含量如下：
无机盐： 每100毫升本试剂含0.1-2克
有机酸及其盐类： 每100毫升本试剂含0.1-5克
多羟基化合物： 每100毫升本试剂含0.1-10克
氨基酸： 每100毫升本试剂含0.5-10克
蛋白质： 每100毫升本试剂含0.05-2克。
在实施例1中，用1种稳定剂；
在实施例2中，用2种稳定剂；
在实施例3中，用3种稳定剂；
在实施例4中，用4种稳定剂；
(4)在上表中，所述的无机盐选自下述中的一种：氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、溴化钾、硫酸钠、硫酸钾；
所述的有机酸及其盐类选自下述中的一种：乙酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸、山梨酸、乙酸钠、丙酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、山梨酸钾；
所述的多羟基化合物选自下述中的一种：蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
所述的氨基酸选自下述中的一种：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述的蛋白质选自下述中的一种：牛血清白蛋白、明胶。
二、本发明测定方法的实施例：
实施例5：本实施例的测定方法如下：
(1)按上述实施例1要求称取0.61克的TRIS(5mmol/L相当的克数)；然后用800毫升去离子水溶解，调PH7.35，最后用去离子水定容1立升。
(2)将上述溶液转入1立升烧杯中，向该溶液表面均匀添撒0.5克牛血清白蛋白和2000单位的牛凝血酶冻干粉，静置不动，待干粉全部进入溶液中，缓慢搅匀，并经细菌漏斗过滤除菌。此滤液即为FIB试剂(TRIS 5mmol/L，牛凝血酶2单位/毫升)，2～8冰箱内放置，临用前于37℃温育5分钟。
(3)向血凝仪比色杯中添加37℃快速融化的市售血浆50μl，37℃温育1分钟，立即加入50μl已预热至37℃的FIB试剂，计时，血凝时间为26.6s。血浆用咪唑缓冲液稀释2和4倍，其血凝时间分别为27.2s和28.0s。用excel软件进行线性回归处理，R2＝0.9944。
实施例6：本实施例的测定方法如下：
(1)按上述实施例2要求称取4.8克HEPES(相当于含HEPES 20mmol/L)，15克氯化钠，15克山梨酸钾；然后用800毫升去离子水溶解，调PH7.0，定容到1立升。
(2)将上述溶液转入1立升烧杯中，向该溶液表面均匀添撒5000单位凝血酶冻干粉，静置不动，待干粉全部进入溶液中，缓慢搅匀，并经细菌漏斗过滤除菌。此滤液即为FIB试剂(含HEPES 20mml/L，人凝血酶5单位/毫升)，2～8℃冰箱内放置，临用前于37℃温育5分钟。
(3)向血凝仪比色杯中添加37℃快速融化的市售血浆50μl，37℃温育1分钟，立即加入50μl已预热至37℃的FIB试剂，计时，血凝时间为12.1s。血浆用咪唑缓冲液稀释2和4倍，其血凝时间分别为15.0s和18.3s。用excel软件进行线性回归处理，R2＝0.9995。
实施例7：本实施例的测定方法如下：
(1)按上述实施例3要求称取14.4克磷酸氢二钠(PB)，2.4克磷酸二氢钾(PB)，9克硫酸钠，50克甘氨酸；然后用800毫升去离子水溶解，调PH7.35，定容到1立升。
(2)将上述溶液转入1立升烧杯中，向该溶液表面均匀添撒1克明胶和10000单位重组人凝血冻干粉，静置不动，待干粉全部进入溶液中，缓慢搅匀，过滤除菌。此滤液即为FIB试剂(含PB 60mmol/L，重组人凝血酶10单位/毫升)，2～8冰箱内放置，临用前于37℃温育5分钟。
(3)向凝血仪比色杯中添加于37℃快速融化的市售血浆50μl，37℃温育1分钟，立即加入50μl已预热至37℃的FIB试剂，计时，血凝时间为13.7s。血浆用咪唑缓冲液稀释2和4倍，其血凝时间分别为18.7s和26.3s。用excel软件进行线性回归处理，R2＝0.9993。
实施例8：本实施例的测定方法如下：
(1)按上述实施例4要求称取22.5克MOPSO(相当于100mmol/L)，25克溴化钠，10克赖氨酸，15克丙酸钠，50克甘油；然后用800毫升去离子水溶解，调PH8.0，最后用去离子水定容1立升。
(2)将上述溶液转入1立升烧杯中，向该溶液表面均匀添撒20000单位猪凝血冻干粉，静置不动，待干粉全部进入溶液中，缓慢搅匀，过滤除菌。此滤液即为FIB试剂(含MOPSO 100mmol/L，猪凝血酶20单位/毫升)，2～8冰箱内放置，临用前于37℃温育5分钟。
(3)向凝血仪比色杯中添加于37℃快速融化的市售血浆50μl，37℃温育1分钟，立即加入50μl已预热至37℃的FIB试剂，计时，血凝时间为7.3s。血浆用咪唑缓冲液稀释2和4倍，其血凝时间分别为11.1s和18.0s。用excel软件进行线性回归处理，R2＝0.9983。
Claims (10)
1、一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂，其特征在于配制本试剂的原料组成及其含量如下：
凝血酶：每毫升本试剂含2-20单位
缓冲剂：每升本试剂含5-100毫摩尔
稳定剂：每100毫升本试剂含0.05-10克
去离子水：余量。
2、根据权利要求1所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂，其特征在于所述的凝血酶采用用生化手段从动物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重组或化学修饰的凝血酶制品。
3、根据权利要求2所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂，其特征在于所述的缓冲剂选自下述中的任一种；
HEPES 中文名为N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸
TRIS 中文名为三(羟甲基)氨基甲烷
PB 中文名为磷酸缓冲液
MOPSO 中文名为3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸。
4、根据权利要求3所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂，其特征在于所述的稳定剂选自下述中的一种或几种：
无机盐、有机酸及其盐类、多羟基化合物、氨基酸、蛋白质；
各种稳定剂的含量如下：
无机盐： 每100毫升本试剂含0.1-2克
有机酸及其盐类：每100毫升本试剂含0.1-5克
多羟基化合物： 每100毫升本试剂含0.1-10克
氨基酸： 每100毫升本试剂含0.5-10克
蛋白质： 每100毫升本试剂含0.05-2克。
5、根据权利要求4所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂，其特征在于：
无机盐选自下述中的一种：氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、溴化钾、硫酸钠、硫酸钾；
有机酸及其盐类选自下述中的一种：乙酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸、山梨酸、乙酸钠、丙酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、山梨酸钾；
多羟基化合物选自下述中的一种：蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
氨基酸选自下述中的一种：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
蛋白质选自下述中的一种：牛血清白蛋白、明胶。
6、一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的方法，其特征在于：
(1)用含稳定剂的缓冲液配制每毫升含2-20单位凝血酶的本试剂；本试剂的PH值范围为PH7.0-8.0；
(2)用配制好的本试剂按常规方法绘制标准曲线；
(3)测定方法：
a、将本试剂及血浆样本分别于37℃温育后，按1∶1的体积比混合；
b、记录血凝时间；
c、通过标准曲线求出血浆样本的纤维蛋白原含量。
7、根据权利要求6所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的方法，其特征在于所述的凝血酶采用用生化手段从动物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重组或化学修饰的凝血酶制品。
8、根据权利要求7所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的方法，所述的缓冲剂选自下述中的任一种；
HEPES 中文名为N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸
TRIS 中文名为三(羟甲基)氨基甲烷
PB 中文名为磷酸缓冲液
MOPSO 中文名为3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸。
9、根据权利要求8所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的方法，其特征在于所述的稳定剂选自下述中的一种或几种：
无机盐、有机酸及其盐类、多羟基化合物、氨基酸、蛋白质；
各种稳定剂的含量如下：
无机盐： 每100毫升本试剂含0.1-2克
有机酸及其盐类：每100毫升本试剂含0.1-5克
多羟基化合物： 每100毫升本试剂含0.1-10克
氨基酸： 每100毫升本试剂含0.5-10克
蛋白质： 每100毫升本试剂含0.05-2克。
10、根据权利要求9所述的一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的方法，其特征在于：
无机盐选自下述中的一种：氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、溴化钾、硫酸钠、硫酸钾；
有机酸及其盐类选自下述中的一种：乙酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸、山梨酸、乙酸钠、丙酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、山梨酸钾；
多羟基化合物选项自下述中的一种：蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
氨基酸选自下述中的一种：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
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