CN104946249B - 一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法,属于材料、生物和分析化学交叉学科的技术领域，其特征在于该荧光探针是由荧光标记聚合物与吸附在荧光标记聚合物表面的细胞色素C组成的复合物水溶液，复合物水溶液的重量百分浓度为0.0005%~0.05%，通过对疏水性染料芘进行亲水性聚合物修饰，所获得的水溶性荧光标记聚合物作为荧光发射的能量给体，细胞色素C作为胰蛋白酶的底物，通过细胞色素C在荧光标记聚合物表面的吸附，得到胰蛋白酶检测的荧光探针。加入对细胞色素C有水解作用的胰蛋白酶，水解得到的血红素作为吸收荧光的能量受体，通过荧光强度的降低来实现酶活性的检测。本发明得到的荧光探针具有高荧光强度，良好的水溶性和稳定性，在生物传感器领域具有广泛的应用前景。

Description

一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法，属于材料、生物和分析化学交叉学科的技术领域。
背景技术
胰蛋白酶是蛋白质分解中最重要的消化酶之一，胰蛋白酶原的分泌、活化、抑制以及循环的不平衡会导致急性或慢性的胰腺疾病，严重的例如胰腺癌。大约每年有35000例胰腺癌是由于丝氨酸蛋白酶尤其是胰蛋白酶的不平衡引起的。此外胰蛋白酶不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。
目前发展起来的测定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、荧光法、免疫法、质谱法(MS)、液相色谱法(HPLC)、电泳法等。紫外分光光度法与比色法操作简单，但灵敏度低，重现性差。免疫法灵敏度高，如专利201020245770.x所述，但由于单克隆抗体的使用使得成本也高，且需要一定的操作技术。质谱仪器昂贵，对样品的纯度要求高，色谱以及电泳法需要比较复杂的操作和较长的检测时间。
相比这些方法，荧光法操作简便、灵敏度高、可实现实时监测，具有临床应用的潜在可能。目前报道的荧光检测的方法主要是应用水溶性荧光共轭聚合物以及新型的聚集诱导发光分子或者荧光量子点，荧光共轭聚合物与聚集诱导发光分子的合成与分离仍然比较复杂，提高了成本，量子点则可能具有一定的毒性。因而建立检测过程简单、成本低、生物相容性良好的荧光检测方法具有重要的意义。
芘是一种常用的疏水染料，它的量子产率高，有规整的苯环结构，对环境的亲疏水性非常敏感，广泛用于检测聚合物的临界胶束浓度(CMC)以及检测DNA，小分子等。但由于其疏水性，限制了它在水溶液中的广泛应用。研究者们发现，将芘结合在亲水性聚合物上可以有效增溶芘，基于芘修饰的聚合物在生物监测方面的报道还很少。通过检索，未见芘修饰的聚合物荧光检测胰蛋白酶的方法。
发明内容
本发明一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法。
本发明一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于是一种由荧光标记聚合物与吸附在荧光标记聚合物表面的细胞色素C组成的复合物水溶液，复合物水溶液的重量百分浓度为0.0005％～0.05％。
上述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于所述的荧光标记聚合物为芘封端的聚环氧乙烷或芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，荧光标记聚合物的数均相对分子质量为8000～13000，化学结构式为：
其中n1＝175-290，n2＝25–45。
上述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于所述的细胞色素C为市售纯度高于95％，来源于猪心、马心或牛心的细胞色素C。
上述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将荧光标记聚合物溶于浓度为10～100mM，pH＝7.4～9.0的磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,制成重量百分比浓度为0.0002～0.01％的水溶液A；
(2)将细胞色素C溶于浓度为10～100mM，pH＝7.4～9.0的磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,制成重量百分比浓度为0.0008～0.1％的水溶液B；
(3)将水溶液A与水溶液B等体积混合，反应5～60分钟，让细胞色素C吸附在荧光标记聚合物表面，获得检测胰蛋白酶的荧光探针。
用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法一种本发明与现有技术相比具有的有益效果：
(1)采用水溶性聚合物增溶芘，使疏水性染料芘能应用于亲水环境监测，扩大了芘的应用范围，降低了成本；
(2)芘修饰的水溶性聚合物稳定性好、生物相容性好，检测过程简单灵敏，检测胰蛋白酶特异性好，具有很强的实用性。
附图说明
图1是荧光探针(芘封端的聚环氧乙烷加入细胞色素C)以及在荧光探针中加入不同浓度胰蛋白酶的荧光光谱图。
图2是芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱与疏水性染料芘自身的荧光光谱图。
具体实施方式
本发明通过对疏水性染料芘进行亲水性聚合物修饰，所获得的水溶性两亲荧光标记聚合物作为荧光发射的能量给体，细胞色素C作为胰蛋白酶的底物，通过细胞色素C在荧光标记聚合物表面的吸附，得到胰蛋白酶检测的荧光探针。加入对细胞色素C有水解作用的胰蛋白酶，水解得到的血红素作为吸收荧光的能量受体，通过荧光强度的降低来实现酶活性的检测。
实施方式1：
(1)荧光探针的制备
①荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚环氧乙烷。将荧光标记聚合物溶于浓度为10mM，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，制成重量百分比浓度为0.0002％的水溶液A；
②将来源于猪心的细胞色素C溶于浓度为10mM，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，制备成重量百分比浓度为0.0008％的水溶液B.
③将2mL水溶液A与2mL水溶液B混合，反应5分钟，让细胞色素C吸附在荧光标记聚合物表面，获得检测胰蛋白酶的荧光探针。
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：
①胰蛋白酶的检测：在荧光探针中加入终浓度为0.01～100μg/mL的胰蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)，在37℃下放置30分钟后，检测荧光强度，以荧光发射峰375nm处强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。
荧光强度下降的比率为(I-I0)/I0×100％，I0代表只加缓冲溶液的空白对照荧光发射峰375nm处荧光强度，I代表加入不同浓度胰蛋白酶后发射峰375nm处荧光强度。
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。
②特异性实验：在荧光探针中分别加入浓度为100μg/mL的碱性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶以及胰蛋白酶，37℃下培养半小时后进行荧光光谱检测。比较其他蛋白与胰蛋白酶发射峰375nm处荧光强度下降比例。
荧光光谱检测结果表明：荧光探针对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式2
(1)荧光探针的制备
除所用荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，水溶液A与水溶液B混合反应为10分钟外，其他同实施例1.
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：同实施方式1.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式3
(1)荧光探针的制备
①荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚环氧乙烷。将荧光标记聚合物溶于浓度为50mM，pH＝8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液中，制备得到重量百分比浓度为0.005％的水溶液A；
②将来源于马心的细胞色素C溶于浓度为50mM，pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液中，制备成重量百分比浓度为0.025％的水溶液B；
③除混合反应时间为15分钟以外，其他同实施方式1。
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：除所用缓冲溶液为50mM，pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液外，其他同实施方式1.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式4
(1)荧光探针的制备
除所用荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱，水溶液A与水溶液B混合反应为20分钟外，其他同实施方式3.
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：同实施方式3.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式5
(1)荧光探针的制备
①荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚环氧乙烷。将荧光标记聚合物溶于浓度为50mM，pH＝8.5的磷酸盐缓冲液中，制备得到重量百分比浓度为0.003％的水溶液A；
②将来源于猪心的细胞色素C溶于浓度为50mM，pH＝8.5的磷酸盐缓冲液中，制备成重量百分比浓度为0.02％的水溶液B；
③除混合反应时间为30分钟以外，其他同实施方式1。
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：除所用缓冲溶液为50mM，pH＝8.5的磷酸盐缓冲液外，其他同实施方式1.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式6
(1)荧光探针的制备
除所用荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，水溶液A与水溶液B混合反应为45分钟外，其他同实施例5.
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：同实施方式5.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式7
(1)荧光探针的制备
①荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚环氧乙烷。将荧光标记聚合物溶于浓度为100mM，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液中，制备得到重量百分比浓度为0.01％的水溶液A；
②将来源于牛心的氧化型细胞色素C溶于浓度为100mM，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液中，制备成重量百分比浓度为0.1％的水溶液B；
③除混合反应时间为60分钟以外，其他同实施例1。
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：除所用缓冲溶液为100mM，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液外，其他同实施方式1.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
实施方式8
(1)荧光探针的制备
除所用荧光标记聚合物为化学结构式如下的芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，其他同实施方式7.
荧光光谱表明：细胞色素C的加入会使荧光标记聚合物的荧光强度降低，表明细胞色素C吸附到荧光标记聚合物表面。
(2)胰蛋白酶的检测：同实施方式7.
荧光光谱检测结果表明：发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系，荧光探针在缓冲溶液中可以检测胰蛋白酶。检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。

Claims (2)

1.一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于由分子量为8000~13000的芘封端的聚环氧乙烷或芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱荧光聚合物与吸附在聚合物表面的细胞色素C组成的复合物的水溶液，复合物水溶液的重量百分浓度为0.0005% ~0.05%；所述芘封端的聚环氧乙烷或芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱结构分别为
（1）
（2），
其中n1 = 175-290， n2 = 25-45。
2.根据权利要求1所述的一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于所述的细胞色素C为市售纯度高于95%，来源于猪心、马心或牛心的细胞色素C；
根据权利要求1所述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将分子量为8000~13000的芘封端的聚环氧乙烷或芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱荧光标记聚合物溶于浓度为10 ~ 100 mM，pH = 7.4 ~ 9.0 的磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中, 制成重量百分比浓度为0.0002 ~ 0.01% 的水溶液A；
（2）将细胞色素C溶于浓度为10 ~ 100 mM，pH = 7.4 ~9.0 的磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中, 制成重量百分比浓度为0.0008 ~ 0.1% 的水溶液B；
（3）将水溶液A与水溶液B等体积混合，反应5 ~ 60分钟，让细胞色素C吸附在荧光标记聚合物表面，获得检测胰蛋白酶的荧光探针。
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