CN109813666A

CN109813666A - 基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒

Info

Publication number: CN109813666A
Application number: CN201910111834.2A
Authority: CN
Inventors: 林丽清; 林晓昀; 赵成飞; 吴丽娜; 林新华
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2019-02-12
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明公开一种基于铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒。本发明利用鱼精蛋白（protamine，pro）既作为铂纳米单元的稳定剂，又是胰蛋白酶的的水解底物。Pro‑铂纳米单元模拟氧化酶催化溶液中氧气氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺显色，提供了一种快速、简便、灵敏的胰蛋白酶检测新方法。该检测新方法所用的Pro‑铂纳米单元模拟氧化酶制备简便易得，可以实现对血清中的胰蛋白酶进行可视化分析，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。

Description

基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种新型的胰蛋白酶含量快速检测方法和检测试剂盒，尤其涉及一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法及其检测试剂盒，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术

胰蛋白酶（Trypsin, TRY）是由胰腺产生一类丝氨酸蛋白酶，主要作用是水解细胞间的蛋白质离散细胞，它广泛存在于脊椎动物的消化系统，在调节胰腺外分泌功能过程中也起着关键作用。研究表明，患有急性胰腺炎或胰腺移植病人的血液中胰蛋白酶的含量（1.4±0.6 μg/mL）水平比一般健康人（0.25±0.1 μg/mL）的要高，因此，胰蛋白酶在生物体液中的含量水平可作为胰腺功能和病理变化的生物标志物。综上，我们可以通过检测人体血液或者尿液中胰蛋白酶的含量，诊断人体胰腺功能正常与否。目前，检测胰蛋白酶的方法主要有：高效液相色谱技术、凝胶电泳技术、酶联免疫分析技术、化学发光和电化学分析方法等。这些方法相对比较耗时，或者有些需要复杂的修饰步骤，以及精密的仪器设备才能完成。因此，设计构建一种操作简单，无标记，且灵敏的方法对于胰蛋白酶的快速检测十分迫切。近几年来，纳米模拟酶具有较高的催化活性、卓越的生物相容性且稳定性高等特点，得到科研工作者的高度重视。这些特性让纳米模拟酶有望在环境监测、生物分析和疾病诊断等领域大有作为。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法。其中包括利用合成的pro-铂纳米单元模拟氧化酶催化溶液中氧气氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色，显色体系的最大吸收波长为652nm，由652 nm处吸光度可得出胰蛋白酶的含量。

为了实现上述检测方法的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是将胰蛋白酶和pro-铂纳米单元模拟氧化酶加入到醋酸盐缓冲液中，在40 ℃下温浴10 min后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺获得显色产物，目视观察颜色变化或测定紫外-可见吸收；所述的pro-铂纳米单元模拟氧化酶由以下步骤制得: 将800μl浓度为16 mmol/L 氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀；两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸；随后, 混合物在室温下不断搅拌2小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。

所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是将100 μLpro-铂纳米单元和不同浓度的胰蛋白酶标准溶液加入到200 μL浓度为10 mmol/L、pH=8的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入到750μL醋酸盐缓冲液中；在40℃下温浴10 min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在652 nm处测定紫外-可见吸收度。

上述显色产物溶液颜色为蓝色，随着胰蛋白酶浓度的增大，溶液颜色变化值越大，目视观察溶液颜色的检测限为0.6 μg/mL。

上述显色产物最大吸收波长为652 nm，根据652 nm波长处测得的吸光度作标准曲线，其检测的线性范围为0.06μg/mL~0.6μg/mL，检测限为0.03 μg/mL。

本发明的另一个目的在于提供一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒。

本发明实现胰蛋白酶检测试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是试剂盒中包括a 液、b液、标准液和缓冲液，所述a液中含有pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液，b液中含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，标准液为胰蛋白酶标准溶液。

上述a液中含有浓度为0.30 mmol/L的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液; b液中含有用50 mmol/L，pH=4.5的醋酸盐缓冲液配制的浓度为16mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液; 标准液包括浓度为0.06、0.12、0.18、0.32、0.36、0.42、0.54、0.6 μg/mL的胰蛋白酶溶液; 缓冲液包括50 mmol/L、pH=4.5的醋酸盐缓冲液和10 mM、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液。

所述的pro-铂纳米单元模拟氧化酶由以下步骤制得的：将800μl浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀；两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸；随后, 混合物在室温下不断搅拌2小时；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。

本发明所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是作为胰蛋白酶检测。

所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是将100μL的a液和10μL不同浓度的胰蛋白酶标准液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L的pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中；在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定吸光度，绘制胰蛋白酶标准曲线或计算回归方程；取20μL不同浓度人血清样品加入到200 μL浓度为10 mmol/L的pH=8.0的Tris−HCl缓冲液，加入100 μL的a液，在37℃中孵育2小时；之后3000rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中，在40℃下温浴10min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度，结果如表1所示，计算血清样品中胰蛋白酶的含量和样品的加标回收率。

具体地说，本发明采用以下技术方案：

（一）将800μl浓度为16 mmol/L 氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀。两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸。随后, 混合物在室温下不断搅拌2小时。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（二）本发明的胰蛋白酶检测方法：将100 μL pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液和10μL不同浓度的胰蛋白酶标准溶液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时。之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入到750μL醋酸盐缓冲液中。在40℃下温浴10 min后，目视观察颜色变化或在652 nm处测定紫外-可见吸收度。

（三）胰蛋白酶检测试剂盒：a液包括上述技术方案（一）制备后用双蒸水配制的浓度为0.30mmol/L的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液；b液包括浓度为16mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺。缓冲液包括50 mmol/L、pH=4.5的醋酸盐缓冲液和10 mM、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液。

（四）胰蛋白酶检测试剂盒使用方法：在10 μL不同浓度的标准液和100 μL技术方案（三）的a液分别加入到200μL Tris-HCl pH 8缓冲液中，在37℃中孵育2小时。之后3000rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 技术方案（三）的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中。在40℃下温浴10 min后，目视观察颜色变化或在652 nm处测定紫外-可见吸收度。根据显色体系溶液颜色判断或根据吸光度标准曲线进行定量。

本发明的优点：

（1）本发明利用pro-铂纳米单元模拟氧化酶催化溶液中氧气氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色，从而表现出溶液颜色变化和紫外吸收光谱特征的变化，可以用于胰蛋白酶的含量检测。

（2）本发明对胰蛋白酶的检测特异性高，可用于血清胰蛋白酶含量测定。

（3）本发明检测胰蛋白酶的检测的灵敏度高，目视观察颜色变化的检测限为0.6μg/mL，分光光度法检测线性范围为0.06~0.6μg/mL，检测限为0.03μg/mL。

（4）本发明提供的胰蛋白酶检测试剂盒，具有稳定性好，操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。

附图说明

图1为pro-铂纳米单元材料的透射电镜图。

图2为pro-铂纳米单元材料的X 射线光电子能谱图。

图3为显色产物的紫外吸收光谱图。

图4为胰蛋白酶标准曲线图。

图5为酪氨酸酶、溶菌酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶、黄氨酸氧化酶、Na⁺、K⁺、Ca²⁺和葡萄糖对于胰蛋白酶检测的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

将800μl浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中，在室温下将800μl浓度为5mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀。两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸。随后, 混合物在室温下不断搅拌2小时。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将所得溶液滴涂在铜网上进行透射电镜检测，有趣的是，鱼精蛋白如绳子一样将几个铂纳米单元有机地连接在一起形成单元，称为pro-铂纳米单元，pro-铂纳米单元呈规则均匀分散，大小为 20.62 ± 2.3 nm，单元上的每个铂纳米单元之间有一定的间隔，大小为2.45± 0.27 nm（见图1）。将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。取所得粉末进行X 射线光电子能谱测定，由图谱可知铂纳米表面含有大量的C、O、N元素（见图2）。

实施例2

将100 μL浓度为0.30 mmol/L的实施例1制得的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液和50μL 16mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入到850μL浓度为0.05 mol/L pH 4.5醋酸盐缓冲液中，在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度。如图3中的曲线a所示，显色产物最大吸收波长为652 nm。若溶液中用N₂饱和20分钟，吸光度急剧下降，如图3中的曲线b所示，说明pro-铂纳米单元具有模拟氧化酶的作用。图3中的曲线c是没有加入pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液，即空白对照试验进行对比，说明pro-铂纳米单元具有模拟氧化酶的作用。

实施例3

将10 μL不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和100 μL浓度为0.30mmol/L实施例1制得的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时。之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入到750μL醋酸盐缓冲液中。在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度。如图4所示，随着胰蛋白酶浓度的加大，吸光度差值越来越大，通过风光光度法检测限为0.03μg/mL。

实施例4

一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒。试剂盒中包括pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液（a液），3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液（b液），胰蛋白酶标准溶液（标准液）和缓冲液。a液为实施例1制备后用双蒸水配制的浓度为0.30mmol/L的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液；b液包括浓度为16 mmol/L 的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；标准液包括浓度为0.06、0.12、0.18、0.32、0.36、0.42、0.54、0.6 μg/mL的胰蛋白酶溶液；缓冲液包括50 mmol/L、pH=4.5的醋酸盐缓冲液和10 mM、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液。

实施例5

分别取2 μg/mL.的酪氨酸酶、溶菌酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶、黄氨酸氧化酶和一些常见离子（Na⁺、K⁺、Ca²⁺）和葡萄糖，100 μL实施例4的a液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时。之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL实施例4的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中。在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度。如图5所示，酪氨酸酶、溶菌酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶、黄氨酸氧化酶、一些常见离子和葡萄糖不会对本发明的胰蛋白酶检测方法产生干扰。

实施例6

在10μL实施例4的标准液和100 μL实施例4的a液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时。之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 实施例4的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中，在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度，绘制胰蛋白酶标准曲线或计算回归方程。取20μL高、中、低三种浓度人血清样品加入到200 μL实施例4的Tris−HCl缓冲液，加入100 μL实施例4的a液，在37℃中孵育2小时。之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 实施例4的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中，在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度，结果如下表1所示，计算样品的加标回收率为92.8%〜98.7%。

表1标准添加法测定血清中胰蛋白酶的回收率

样本	胰蛋白酶加入量(μg/mL)	胰蛋白酶测定值(μg/mL)	回收率 (％)
				1	0.250	0.232	92.8
2	0.375	0.372	99.3
				3	0.500	0.494	98.7

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是将胰蛋白酶和pro-铂纳米单元模拟氧化酶加入到醋酸盐缓冲液中，在40 ℃下温浴10 min后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺获得显色产物，目视观察颜色变化或测定紫外-可见吸收；所述的pro-铂纳米单元模拟氧化酶由以下步骤制得: 将800μl浓度为16 mmol/L 氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀；两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸；随后, 混合物在室温下不断搅拌2小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。

2.根据权利要求1所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是将100 μL pro-铂纳米单元和不同浓度的胰蛋白酶标准溶液加入到200 μL浓度为10mmol/L、pH=8的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入到750μL醋酸盐缓冲液中；在40℃下温浴10 min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在652 nm处测定紫外-可见吸收度。

3.根据权利要求1或2所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是显色产物溶液颜色为蓝色，随着胰蛋白酶浓度的增大，溶液颜色变化值越大，目视观察溶液颜色的检测限为0.6 μg/mL。

4.根据权利要求1或2所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是显色产物最大吸收波长为652 nm，根据652 nm波长处测得的吸光度作标准曲线，其检测的线性范围为0.06μg/mL~0.6μg/mL，检测限为0.03 μg/mL。

5.一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是试剂盒中包括a 液、b液、标准液和缓冲液，所述a液中含有pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液，b液中含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，标准液为胰蛋白酶标准溶液。

6.根据权利要求5所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是a液中含有浓度为0.30 mmol/L的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液; b液中含有用50 mmol/L，pH=4.5的醋酸盐缓冲液配制的浓度为16mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液; 标准液包括浓度为0.06、0.12、0.18、0.32、0.36、0.42、0.54、0.6 μg/mL的胰蛋白酶溶液; 缓冲液包括50 mmol/L、pH=4.5的醋酸盐缓冲液和10 mM、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液。

7.根据权利要求5或6所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是所述的pro-铂纳米单元模拟氧化酶由以下步骤制得的：将800μl浓度为16mmol/L 氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀；两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸；随后,混合物在室温下不断搅拌2小时；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。

8.权利要求5-7任一所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是作为胰蛋白酶检测。

9.根据权利要求8所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是将100μL的a液和10μL不同浓度的胰蛋白酶标准液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L的pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中；在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定吸光度，绘制胰蛋白酶标准曲线或计算回归方程；取20μL不同浓度人血清样品加入到200 μL浓度为10 mmol/L的pH=8.0的Tris−HCl缓冲液，加入100 μL的a液，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中，在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度，结果如表1所示，计算血清样品中胰蛋白酶的含量和样品的加标回收率。