CN110257482A - 一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法 - Google Patents

一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法 Download PDF

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徐艳
张兆坤
陈玮嘉
朱君
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Abstract

本发明涉及一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，以凝血酶为靶标，采用核酸适体识别靶标，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，同时结合磁分离的手段，实现凝血酶的可视化检测。该方法控制反应条件，在磁珠表面修饰识别凝血酶的探针，探针包括凝血酶核酸适体序列及端粒酶识别序列，探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列。本发明以核酸适配体识别靶标，结合端粒酶扩增进一步放大信号，通过磁分离进行凝血酶可视化检测。分离方法便捷，所用材料部分已商品化，生物安全性高。本发明具有反应简单、成本低廉、检测灵敏可视化的特点。

Description

一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，一种凝血酶含量的检测方法，具体涉及一种核酸适体捕获凝血酶，暴露末端端粒酶识别引物。利用端粒酶识别引物并进行核酸扩增，得到富含鸟嘌呤（G）的重复产物，与血晶素结合后进行可视化检的方法。本发明属于纳米生物检测领域。
背景技术
正常人体内凝血和抗凝血机制维持着动态的平衡，然而肿瘤组织的产生、向周围组织的浸润和转移，以及肿瘤患者血液成分的变化会影响这种平衡状态，导致患者的凝血机制发生改变，产生不同程度的出血倾向。研究表明，肿瘤与血栓发生存在相关性，特别恶性肿瘤细胞在治疗过程中本身可以释放促凝因子和癌促凝物，并且其受多种血细胞作用影响，可以逐步破坏人体正常的凝血、溶血和纤溶系统，促使恶性肿瘤患者血液产生高凝状态。而这种高凝状态在一定程度上又有助于肿瘤细胞的生长，并导致进一步的浸润和转移。凝血酶（Thrombin, Tb）是一种重要的多功能丝氨酸蛋白酶，由Tb前体形成，位于外源性和内源性凝血途径的共同通路中，具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白、促进血液凝血和调控凝血的功能，是肿瘤发展过程中的重要因子。因此Tb活性检测对临床疾病诊断、病情发展及治疗效果监测和评估具有重要意义。
传统的凝血酶检测方法主要有底物发光法和荧光法，分别利用凝血酶与底物作用后释放显色产物或与荧光底物结合后的荧光变化测定凝血酶含量，这两种方法灵敏度较低，对微量样品难以分析。因此急需开发一种灵敏、可对微量样品进行分析的检测方法。核酸适体（aptamer）是一类能够特异性与靶标结合的寡核苷酸序列，其靶标可以为蛋白质、金属离子、小分子化合物和细胞膜表面受体等。核酸适体可以为RNA或DNA，与靶标的结合能力可与抗体相当，特异性强，并且具有很好生物稳定性和安全性，同时易合成、易标记，在生物检测领域应用广泛。目前利用核酸适体检测凝血酶主要采用荧光检测与磁分离方法相结合的手段：中国发明专利：一种利用核酸适体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，公开号：CN107841527A；荧光检测与芯片技术相结合：中国发明专利：一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒的制作方法，公开号：CN104034712A。然而该方法受限于核酸适体与凝血酶的直接结合后产生的荧光强度改变，其信号变化范围较小，线性范围较窄，且荧光偏振对非均相溶液的测定存在一定的偏差，同时对于低浓度的凝血酶测定存在一定困难。因此开发一种灵敏、快速的凝血酶检测方法极具应用价值。
发明内容
针对现有检测的需求，本发明目的在于提供一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法。
本发明目的通过下述技术方案实现：一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，以凝血酶为靶标，采用核酸适体识别靶标，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，同时结合磁分离的手段，实现凝血酶的可视化检测，包括如下步骤：
采用生物素修饰的探针与链霉亲和素修饰的磁珠连接，在磁珠表面修饰识别凝血酶的探针，探针包括凝血酶核酸适体序列及端粒酶识别序列，探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列；所述的端粒酶（telomerase）是一种由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白，与相应的识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT），该序列可以与氯化血红素（hemin或称血晶素）结合，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，采用化学发光的方式对凝血酶含量进行高选择性、高灵敏度、简便快速的定量分析。
所述的探针由一个发夹结构DNA构成，包含识别凝血酶的核酸适体序列与端粒酶识别引物序列，探针在与凝血酶充分结合后，打开茎环结构，采用磁性分离的方法对凝血酶进行富集与纯化，去除未结合物质，纯化后的磁珠重新分散，加入端粒酶，端粒酶识别暴露的引物序列，在探针末端形成重复的富含鸟嘌呤的序列，磁分离去除多余的酶与dNTP，进一步地，加入血晶素（hemin），形成具有过氧化物酶活性的复合物，催化2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）显色，对凝血酶的含量进行可视化测定。
具体的，本发明提供一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，包括以下步骤：
（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列，包括核酸序列表中Seq. No.1 DNA 1或Seq.No.2 DNA 2，于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1M Na Cl，pH=7.5；10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 5~10 μL 100 μM 的Seq. No.3 DNA 3以摩尔比1:1~2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用缓冲液I洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL Tb缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述的Tb缓冲液为22 mM Tris-HCl、120 mM Na Cl、50 mM K Cl、0.85mM Ca Cl2、6 mM Mg Cl2、6.8%甘油，pH 7.8；
（2）探针与凝血酶结合：
取10 μL步骤（1）合成的探针采用Tb缓冲液稀释10倍，加入0-50 nM 凝血酶溶液，室温反应0.5-1 hr；将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液）洗涤三次，沉淀采用100 μL Te缓冲液重旋，Te缓冲液为：20 mM Tris-H Cl、1.5 mM MgCl2、63 mM K Cl、0.005%（v/v）Tween-20、1 mM EGTA；
（3）端粒酶扩增：
100 μL步骤（2）得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr；上述混合液采用磁分离去除上清，采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液重旋，PBS缓冲液为：10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，50mM K Cl；
（4）检测：
称取1.3 g的hemin溶解于1 mL二甲基亚砜（终浓度为2 M），于-20℃保存待用；称取0.11 g ABTS溶解于100 mL PBS缓冲液中（终浓度为2 mM），于4℃保存待用；2 M hemin溶液采用PBS稀释至20 μM，取1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min；在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mMABTS，混合均匀后，观测溶液颜色变化，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化；
所述的探针序列其5，末端修饰生物素，探针从5，端到3，端主要包含茎结合区、凝血酶识别序列和端粒酶识别引物序列，端粒酶序列区域可与茎接合区互补，使探针形成发夹结构。
所述的端粒酶识别序列末端为TGTT或AGTT。
本发明中，所述的端粒酶提取方法为2018年2月1日发表在Talanta第178卷第594-599页题为A PCR-free colorimetric strategy for visualized assay of telomeraseactivity的论文中第595页所记载的端粒酶提取方法。
本发明的优点在于：（1）本发明以核酸适配体识别靶标，结合端粒酶扩增进一步放大信号，通过磁分离进行凝血酶可视化检测。分离方法便捷，所用材料部分已商品化，生物安全性高。（2）本发明具有反应简单、成本低廉、检测灵敏可视化的特点。适用于临床检测需求。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的DNA 1于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与10 μL 100 μM 的DNA 3以摩尔比3:2的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用缓冲液I洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL Tb缓冲液（22 mM Tris-HCl，120mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8）重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2.探针与凝血酶结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用Tb缓冲液稀释10倍，加入50 nM 凝血酶溶液，室温反应45 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）洗涤三次，沉淀采用100 μL Te缓冲液重旋。
3.端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液：10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液重旋
4.检测
称取1.3 g的hemin溶解于1 mL二甲基亚砜（终浓度为2 M），于-20℃保存待用。称取0.11 g ABTS溶解于100 mL PBS缓冲液中（终浓度为2 mM），于4℃保存待用。2 M hemin溶液采用PBS稀释至20 μM，取1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mMABTS，混合均匀后，溶液由无色变为很深的蓝绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例2
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的DNA 2于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 5 μL 100 μM 的DNA 3以摩尔比2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用缓冲液I洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL Tb缓冲液（22 mM Tris-HCl，120mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8）重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2.探针与凝血酶结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用Tb缓冲液稀释10倍，加入0-10 nM 凝血酶溶液，室温反应1 hr。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）洗涤三次，沉淀采用100 μL Te缓冲液重旋。
3.端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液：10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液重旋
4.检测
称取1.3 g的hemin溶解于1 mL二甲基亚砜（终浓度为2 M），于-20℃保存待用。称取0.11 g ABTS溶解于100 mL PBS缓冲液中（终浓度为2 mM），于4℃保存待用。2 M hemin溶液采用PBS稀释至20 μM，取1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mMABTS，混合均匀后，溶液由无色变为较浅的蓝绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例 3
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的DNA 1于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与5 μL 100 μM 的DNA 3以摩尔比2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用缓冲液I洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL Tb缓冲液（22 mM Tris-HCl，120mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8）重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2.探针与凝血酶结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用Tb缓冲液稀释10倍，加入0-1 nM 凝血酶溶液，室温反应1 hr。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mMTris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）洗涤三次，沉淀采用100 μL Te缓冲液重旋。
3.端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液：10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液重旋
4.检测：
称取1.3 g的hemin溶解于1 mL二甲基亚砜（终浓度为2 M），于-20℃保存待用。称取0.11 g ABTS溶解于100 mL PBS缓冲液中（终浓度为2 mM），于4℃保存待用。2 M hemin溶液采用PBS稀释至20 μM，取1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mMABTS，混合均匀后，溶液颜色由无色变为较深的绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例4
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的DNA 2于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 10 μL 100 μM 的DNA 3以摩尔比3:2的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用缓冲液I洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL Tb缓冲液（22 mM Tris-HCl，120mM Na Cl，50 mM K Cl，0.85 mM Ca Cl2，6 mM Mg Cl2，6.8%甘油，pH 7.8）重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2.探针与凝血酶结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用Tb缓冲液稀释10倍，加入0.1 nM 凝血酶溶液，室温反应1 hr。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mMTris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）洗涤三次，沉淀采用100 μL Te缓冲液重旋。
3.端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液：10 mMNa2 HPO4，2 mM K H2PO4，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液重旋
4.检测：
称取1.3 g的hemin溶解于1 mL二甲基亚砜（终浓度为2 M），于-20℃保存待用。称取0.11 g ABTS溶解于100 mL PBS缓冲液中（终浓度为2 mM），于4℃保存待用。2 M hemin溶液采用PBS稀释至20 μM，取1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mMABTS，混合均匀后，溶液颜色由无色变较浅的绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法
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<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
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<213>人工序列
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<223>5'端生物素修饰
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Claims (5)

1.一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于，以凝血酶为靶标，采用核酸适体识别靶标，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，同时结合磁分离的手段，实现凝血酶的可视化检测，包括如下步骤：
采用生物素修饰的探针与链霉亲和素修饰的磁珠连接，在磁珠表面修饰识别凝血酶的探针，探针包括凝血酶核酸适体序列及端粒酶识别序列，探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列；所述的端粒酶（telomerase）是一种由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白，与相应的识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT），该序列可以与氯化血红素（hemin或称血晶素）结合，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，采用化学发光的方式对凝血酶含量进行定量分析。
2.根据权利要求1所述基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于：所述的探针由一个发夹结构DNA构成，包含识别凝血酶的核酸适体序列与端粒酶识别引物序列，探针在与凝血酶充分结合后，打开茎环结构，采用磁性分离的方法对凝血酶进行富集与纯化，去除未结合物质，纯化后的磁珠重新分散，加入端粒酶，端粒酶识别暴露的引物序列，在探针末端形成重复的富含鸟嘌呤的序列，磁分离去除多余的酶与dNTP，进一步地，加入血晶素（hemin），形成具有过氧化物酶活性的复合物，催化2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）显色，对凝血酶的含量进行可视化测定。
3.根据权利要求1或2所述基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列，包括核酸序列表中Seq. No.1 DNA 1或Seq.No.2 DNA 2，于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1M Na Cl，pH=7.5；10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 5~10 μL 100 μM 的Seq. No.3 DNA 3以摩尔比1:1~2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用缓冲液I洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL Tb缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述的Tb缓冲液为22 mM Tris-HCl、120 mM Na Cl、50 mM K Cl、0.85mM Ca Cl2、6 mM Mg Cl2、6.8%甘油，pH 7.8；
（2）探针与凝血酶结合：
取10 μL步骤（1）合成的探针采用Tb缓冲液稀释10倍，加入0-50 nM 凝血酶溶液，室温反应0.5-1 hr；将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液）洗涤三次，沉淀采用100 μL Te缓冲液重旋，Te缓冲液为：20 mM Tris-H Cl、1.5 mM MgCl2、63 mM K Cl、0.005%（v/v）Tween-20、1 mM EGTA；
（3）端粒酶扩增：
100 μL步骤（2）得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr；上述混合液采用磁分离去除上清，采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液重旋，PBS缓冲液为：10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，50mM K Cl；
（4）检测：
称取1.3 g的hemin溶解于1 mL二甲基亚砜（终浓度为2 M），于-20℃保存待用；称取0.11 g ABTS溶解于100 mL PBS缓冲液中（终浓度为2 mM），于4℃保存待用；2 M hemin溶液采用PBS稀释至20 μM，取1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min；在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mMABTS，混合均匀后，观测溶液颜色变化，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
4.根据权利要求3所述一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于，所述的探针序列其5，末端修饰生物素，探针从5，端到3，端主要包含茎结合区、凝血酶识别序列和端粒酶识别引物序列，端粒酶序列区域可与茎接合区互补，使探针形成发夹结构。
5.根据权利要求3所述一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于所述的端粒酶识别序列末端为TGTT或AGTT。
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