CN107796792B - 一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测mmp-9的方法 - Google Patents

一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测mmp-9的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP‑9的方法，属于生物检测技术领域。本发明将中间含有MMP‑9切割位点的二肽DNA复合物与模板DNA两端互补的分子杂交，形成中间含有颈环结构的DNA双链，MMP‑9可在二肽处的位点进行酶切，使得颈环DNA延展成一条单链DNA片段。荧光标记的单链DNA与氧化石墨烯混合引起DNA荧光淬灭，将荧光淬灭体系与酶切后的DNA复合体系混合，荧光标记的DNA与延展出的单链DNA互补杂交形成双链DNA结构，淬灭的荧光得以恢复，根据MMP‑9的浓度和荧光强度的对应关系，可以实现MMP‑9检测。本方法操作简单方便、灵敏度高、特异性好，为实际样本的检测提供了一种可行的方法。

Description

一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法。
背景技术
基质金属蛋白酶（MMPs）是一类需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子的一个大家族，对细胞外基质的各种蛋白质成分都有降解作用，可以通过调节细胞外基质组分的降解发挥生理和病理学功能，与胚胎发育、组织分化、细胞迁移以及损伤后组织重构、血管增生和斑块破坏等有关，其在肿瘤侵袭转移中所起的关键性作用，使得在肿瘤浸润转移中的作用日益受到关注。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是基质金属蛋白酶的成员之一，是由大多数的人类癌细胞分泌的一种分子量为92kDa的金属蛋白酶，MMP-9具有降解Ⅳ型胶原蛋白的活性，恶性肿瘤的存在使得MMP-9在血清和血浆中的含量随之增加，因此，MMP-9被作为肿瘤转移早期诊断的重要标志物。
目前检测MMP-9的方法主要是基于免疫学方法的酶联免疫吸附实验、免疫组化、免疫荧光等方法，虽然这些方法可以实现MMP-9的检测，但是需要依赖高灵敏高特异性的抗体制备，然而抗体的制备周期长，并且需要专业的操作人员，同时制备的抗体容易受环境温度、pH的影响从而影响抗体的活性，进而影响了MMP-9检测的灵敏度和稳定性。近年来，随着纳米技术的不断发展，借助纳米材料的特性构建的生物传感器所呈现出的简单、快速、灵敏的检测特点在生物检测领域越来越受到重视。
石墨烯是 sp2碳原子杂化组成的一种新型二维的纳米材料，具有优良的电学、力学、光学性质，使得其具有广阔的应用前景，已经成为了各个领域备受瞩目的研究热点。氧化石墨烯是石墨烯经氧化后的产物，含有大量的含氧活性基团，具有良好的水溶性与生物相容性，扩大了其在生物传感检测、生物毒理测试、分子医学等诸多领域应用范围。近年来通过研究发现石墨烯和氧化石墨烯可以作为荧光淬灭剂高效的淬灭多种有机荧光基团和量子点的荧光，与其它的有机淬灭基团相比，石墨烯的淬灭效率高，背景荧光低，是FRET的良好淬灭剂。
发明内容
要解决的技术问题：传统的MMP-9免疫学检测方法需要依赖高灵敏高特异性的抗体制备，抗体的制备需要专业的操作人员进行长周期的制备过程，同时制备的抗体容易受环境温度、pH的影响进而影响了MMP-9检测的灵敏度和稳定性。
技术方案：本发明公开了一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，包括如下步骤：
（1）氧化石墨烯的合成
称取12g的K2S2O2和12g的P2O5加入到30mL浓硫酸溶液中，置于加热反应器上进行加热，当温度达到80℃时将5g石墨烯加入到浓硫酸溶液中进行反应，当溶液颜色变成深蓝色时停止加热，并将溶液冷却至室温；随后将溶液进行10倍稀释，并用0.22μm的滤膜进行过滤，除去大块的沉淀物收集滤液，然后置于80℃的条件下过夜干燥；将50mL的浓硫酸置于冰浴条件下冷却，随后加入2g前述处理的石墨烯氧化物，再加入10g的KMnO4，在冰浴中搅拌反应20min后，加入2g的NaNO3，在室温下搅拌反应2h，再加入500mL超纯水和30%的H2O2终止反应；得到的反应液用10%的HCl溶液洗涤后再用超纯水洗涤，随后再进行透析，将透析后的溶液进行超声剥离2h，最后将溶液在3000r/min的条件下进行离心除去离心管底部的沉淀，收集的上清液即为石墨烯氧化物。
（2）带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA的制备
将含有MMP-9切割位点的二肽DNA1偶联物以1.2:1的摩尔比与DNA2混合进行杂交反应，杂交缓冲液为pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液，二肽DNA1偶联物的终浓度为12nM，DNA2
的终浓度为10nM，在室温下孵育0.5~2h后，得到带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA结构；
二肽DNA1偶联物：5’-ACCGTAGCGT-Gly-Leu-GGTCAACTGC-3’；
DNA2：5’-GCAGTTGACC-GTCTACCGTA-ACGCTACGGT-3’。
（3）荧光信号的测定以及MMP-9的检测
取100μL步骤（1）合成的石墨烯氧化物用0.01M pH7.6的HEPES缓冲液进行10倍稀释，得到浓度为1mg/mL的石墨烯氧化物，然后加入荧光染料标记的DNA3使得DNA3的终浓度为10~20nM，在室温下孵育20~60min，得到石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合体系；将步骤（2）制备的双链DNA反应物分装到250μL PCR管中，每管50μL，在每管中分别加入浓度为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM的MMP-9，在室温下振荡反应0.5~2h后，加入50μL前述制备的石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合反应液组成反应终体系，在室温下孵育反应20~50min，测定每管的荧光信号强度；
DNA3：5’-TACGGTAGAC-荧光染料-3’。
本发明所述的基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法的步骤（2）中二肽DNA1偶联物和DNA2的孵育时间为1h。
本发明所述的基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法的步骤（3）中荧光染料为FAM。
本发明所述的基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法的步骤（3）中DNA3的终浓度为15nM。
本发明所述的基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法的步骤（3）中石墨烯氧化物和DNA3的孵育时间为40min。
本发明所述的基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法的步骤（3）中MMP-9和双链DNA反应物的孵育时间为1h。
本发明所述的基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法的步骤（3）中反应终体系的孵育反应时间为30min。
注：本发明所述的DNA分子均由上海生工生物工程有限公司合成。
有益效果：本发明通过设计中间含有MMP-9切割位点的二肽DNA复合物，将此复合物与模板DNA两端互补的DNA分子杂交形成中间含有颈环结构的杂交DNA双链，存在MMP-9的条件下，MMP-9在二肽处的酶切位点进行酶切，从而使得颈环DNA延展成一条单链DNA片段。荧光标记的单链DNA分子与氧化石墨烯混合，单链DNA分子则吸附到氧化石墨烯的表面，借助于氧化石墨烯的淬灭效应将DNA分子的荧光淬灭，将荧光淬灭体系与MMP-9酶切后的DNA复合体系进行混合，使得含有荧光基团的DNA分子与延展出的单链DNA分子进行互补杂交形成双链DNA结构，由于双链DNA分子与石墨烯吸附作用弱，从而使得淬灭的荧光得以恢复，MMP-9的浓度越高，由颈环DNA延展出的单链DNA分子越多，与之杂交的荧光标记的DNA分子越多，荧光信号越强，根据MMP-9的浓度和荧光信号强度的对应关系，可以实现MMP-9的检测。
附图说明
图1 MMP-9检测的荧光光谱图。
图2 MMP-9检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，包括如下步骤：
（1）氧化石墨烯的合成
称取12g的K2S2O2和12g的P2O5加入到30mL浓硫酸溶液中，置于加热反应器上进行加热，当温度达到80℃时将5g石墨烯加入到浓硫酸溶液中进行反应，当溶液颜色变成深蓝色时停止加热，并将溶液冷却至室温；随后将溶液进行10倍稀释，并用0.22μm的滤膜进行过滤，除去大块的沉淀物收集滤液，然后置于80℃的条件下过夜干燥；将50mL的浓硫酸置于冰浴条件下冷却，随后加入2g前述处理的石墨烯氧化物，再加入10g的KMnO4，在冰浴中搅拌反应20min后，加入2g的NaNO3，在室温下搅拌反应2h，再加入500mL超纯水和30%的H2O2终止反应；得到的反应液用10%的HCl溶液洗涤后再用超纯水洗涤，随后再进行透析，将透析后的溶液进行超声剥离2h，最后将溶液在3000r/min的条件下进行离心除去离心管底部的沉淀，收集的上清液即为石墨烯氧化物。
（2）带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA的制备
将含有MMP-9切割位点的二肽DNA1偶联物以1.2:1的摩尔比与DNA2混合进行杂交反应，杂交缓冲液为pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液，二肽DNA1偶联物的终浓度为12nM，DNA2
的终浓度为10nM，在室温下孵育1h后，得到带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA结构；
二肽DNA1偶联物：5’-ACCGTAGCGT-Gly-Leu-GGTCAACTGC-3’；
DNA2：5’-GCAGTTGACC-GTCTACCGTA-ACGCTACGGT-3’。
（3）荧光信号的测定以及MMP-9的灵敏度分析
取100μL步骤（1）合成的石墨烯氧化物用0.01M pH7.6的HEPES缓冲液进行10倍稀释，得到浓度为1mg/mL的石墨烯氧化物，然后加入FAM荧光染料标记的DNA3使得DNA3的终浓度为15nM，在室温下孵育40min，得到石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合体系；将步骤（2）制备的双链DNA反应物分装到250μL PCR管中，每管50μL，在每管中分别加入浓度为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM的MMP-9，在室温下振荡反应1h后，加入50μL前述制备的石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合反应液组成反应终体系，在室温下孵育反应30min，测定每管的荧光信号强度；DNA3：5’-TACGGTAGAC-荧光染料-3’。
通过测定荧光信号的强度得知，在0.1~10nM的浓度范围内，MMP-9与荧光强度的线性关系良好，所得MMP-9的检测限为0.39nM。
（1）选择性分析
使用本方法测定浓度为0.5nM 、1.2nM 、1.8nM 、2.5nM的MMP-9，每种检测浓度设置两个检测体系，其中一个检测体系中加入MMP-9抑制剂，通过分析测定的荧光信号强度得知，添加蛋白酶抑制剂的检测体系的荧光强度明显低于未添加蛋白酶抑制剂的检测体系，由此得出，MMP-9的活性和添加量直接影响荧光信号强度，本方法对MMP-9具有良好的选择性。
（2）实际样本检测
在5倍稀释的阴性血清样本中添加浓度为0.2nM、0.6nM、1.4nM、2.2nM、3.5nM、5.7nM的MMP-9，用本方法测定MMP-9在血清样本中的添加回收结果，通过测定每种检测浓度下的荧光信号，从标准曲线得出每种添加浓度下的添加回收量，最终的添加回收率在95.8%~98.1%之间，添加回收结果良好，可以应用于实际样本的检测。

Claims (7)

1.一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）氧化石墨烯的合成
称取12g的K2S2O2和12g的P2O5加入到30mL浓硫酸溶液中，置于加热反应器上进行加热，当温度达到80℃时将5g石墨烯加入到浓硫酸溶液中进行反应，当溶液颜色变成深蓝色时停止加热，并将溶液冷却至室温；随后将溶液进行10倍稀释，并用0.22μm的滤膜进行过滤，除去大块的沉淀物收集滤液，然后置于80℃的条件下过夜干燥；将50mL的浓硫酸置于冰浴条件下冷却，随后加入2g前述处理的石墨烯氧化物，再加入10g的KMnO4，在冰浴中搅拌反应20min后，加入2g的NaNO3，在室温下搅拌反应2h，再加入500mL超纯水和30%的H2O2终止反应；得到的反应液用10%的HCl溶液洗涤后再用超纯水洗涤，随后再进行透析，将透析后的溶液进行超声剥离2h，最后将溶液在3000r/min的条件下进行离心除去离心管底部的沉淀，收集的上清液即为石墨烯氧化物；
（2）带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA的制备
将含有MMP-9切割位点的二肽DNA1偶联物以1.2:1的摩尔比与DNA2混合进行杂交反应，杂交缓冲液为pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液，二肽DNA1偶联物的终浓度为12nM，DNA2
的终浓度为10nM，在室温下孵育0.5~2h后，得到带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA结构；
二肽DNA1偶联物：5’-ACCGTAGCGT-Gly-Leu-GGTCAACTGC-3’；
DNA2：5’-GCAGTTGACC-GTCTACCGTA-ACGCTACGGT-3’；
（3）荧光信号的测定以及MMP-9的检测
取100μL步骤（1）合成的石墨烯氧化物用0.01M pH7.6的HEPES缓冲液进行10倍稀释，得到浓度为1mg/mL的石墨烯氧化物，然后加入荧光染料标记的DNA3使得DNA3的终浓度为10~20nM，在室温下孵育20~60min，得到石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合体系；将步骤（2）制备的双链DNA反应物分装到250μL PCR管中，每管50μL，在每管中分别加入浓度为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM的MMP-9，在室温下振荡反应0.5~2h后，加入50μL前述制备的石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合反应液组成反应终体系，在室温下孵育反应20~50min，测定每管的荧光信号强度；
DNA3：5’-TACGGTAGAC-荧光染料-3’。
2.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（2）中二肽DNA1偶联物和DNA2的孵育时间为1h。
3.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中荧光染料为FAM。
4.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中DNA3的终浓度为15nM。
5.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中石墨烯氧化物和DNA3的孵育时间为40min。
6.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中MMP-9和双链DNA反应物的孵育时间为1h。
7.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中反应终体系的孵育反应时间为30min。
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