CN110272981A - 一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针、探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测。本发明设计发夹结构探针，以识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测。分离方法便捷，所用材料部分已商品化，生物安全性高。检测过程不需借助专业仪器，反应仅需水浴锅进行，适应基层医疗检测需求。本发明成本低廉、检测灵敏、特异性高且可视化。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，一种micro RNAs（miRNAs）含量的检测方法，具体涉及一种以前列腺癌标志物miRNAs为靶标，设计与之互补的发夹结构识别探针，与靶标识别后暴露末端端粒酶识别引物。利用端粒酶识别引物并进行核酸扩增，得到富含鸟嘌呤（G）的重复产物，与血晶素结合后进行可视化检测的方法。本发明属于分子生物检测领域。
背景技术
前列腺癌是一种在全球范围内男性高发的生殖系统恶性肿瘤。2017年，美国新报道发病161360例，死亡26730例。伴随生存环境的变迁，前列腺癌在中国呈现爆发式增长，对男性健康的威胁与日俱增。目前临床通常采用前列腺特异抗原（PSA）对潜在前列腺癌患者进行筛查，并采用影像学分析和穿刺活检对患者进行确诊。然而PSA筛查的检测灵敏度和特异性存在较大问题，假阳性率过高，导致部分病人进行非必要的活检和过度治疗，从而承受巨大的痛苦。并且早期前列腺癌治愈率较高，因此寻找新的标志物及检测方法，实现前列腺癌的早期诊断和及时治疗，对延长患者生存期具有重要价值。
RNA包含了疾病病理学特征和发展过程中重要的信息，可以作为研究癌症发病机制、识别感染及其耐药性的重要生物标志物。其中，microRNAs（miRNAs）是一类小的高度保守的内源性非编码RNAs，其长度通常在20~25nt，通过与目标mRNA 3，端的非编码区互补结合调控靶基因的表达。每一种miRNA可以调控多种靶基因，而每一种mRNA又可以与不同的miRNAs结合，因此60%的编码基因被占据人基因组的1%的miRNAs进行调控。MiRNAs参与调控一系列的细胞功能，如细胞增殖、分化和死亡等。同时miRNAs通过致癌和抑癌的双向功能参与多种实体瘤的细胞通路，因此miRNAs可以作为疾病早期诊断、预后和治疗的极佳的生物标志物。
传统的miRNAs检测方法主要有：（1）电化学法：中国发明专利：一种检测miRNA的方法，公开号：CN103698375A；（2）荧光定量PCR法：中国发明专利：一种快速miRNAs定量PCR检测试剂盒，公开号：CN201381322Y；（3）芯片法：中国发明专利：同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片及其检测方法和应用，公开号：CN102980920A；（4）微阵列法：中国发明专利：基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法，公开号：CN108660216A。上述方法都具有一定局限性，比如检测灵敏度低、特异性不佳、耗时间久、样品需求量较大，检测需借助专业的仪器，操作复杂繁琐，限制了其在临床诊断方面的潜在应用。因此开发一种灵敏、快速的miRNAs检测方法具有较高的研究意义和应用价值。
发明内容
针对现有检测的需求，本发明目的在于提供一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法。
本发明目的通过下述技术方案实现：一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的发夹结构的探针，探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测，探针包含与靶标miRNAs的互补序列和与端粒酶识别引物序列，发夹结构的探针识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测，包括以下步骤：
（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM生物素修饰的探针序列，包括Seq.No.3 DNA3、Seq.No.4 DNA4、Seq.No.6 DNA 6、Seq.No.7 DNA 7、Seq.No.9 DNA 9、Seq.No.10 DNA 10、Seq.No.12 DNA12、Seq.No.13 DNA 13、Seq.No.15 DNA 15、Seq.No.16 DNA 16中的一种或二种以上，于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M NaCl，pH=7.5；10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 5~20 μL 100 μM 的Seq.No.1 DNA 1以摩尔比0.5:1~2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述PB缓冲液为1M NaCl、20mM MgCl2，pH 7.4；
（2）探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤（1）合成的磁珠连接的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入0-100 nM靶标miRNAs，包括核酸序列表中Seq.No.2 RNA 2、Seq.No.5 RNA 5、Seq.No.8 RNA 8、Seq.No.11 RNA 11或Seq.No.14 RNA 14的溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液I洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，所述的PBS缓冲液I为10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、137 mM NaCl、2.7 mM KCl，pH值7.4；沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液）重悬，得到包含识别引物的混合液，所述的Te缓冲液为：20 mM Tris-HCl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1mM EGTA；
（3）端粒酶扩增：
100 μL步骤（2）得到的包含识别引物的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr后，采用磁分离去除上清液，采用10 mM PBS缓冲液II洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋，得到混合液，所述的缓冲液II为10 mM Na2 HPO4、2 mM K H2PO4、137 mM Na Cl和50 mM KCl；端粒酶与识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT）；
（4）检测：
1 μL 20 μM的氯化血红素（hemin，或称：血晶素）溶液加入100 μL步骤（3）得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min后，加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM 2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS），混合均匀后，根据靶标浓度的不同，观测溶液颜色变化，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
所述的探针序列其5’末端修饰生物素，探针从5’端到3’端主要包含茎结合区、靶标miRNAs互补序列和端粒酶识别引物序列，端粒酶序列区域可与茎接合区互补，使探针形成发夹结构。
探针在与miRNAs充分结合后，打开探针的茎环结构，露出3，端端粒酶识别引物，再加入端粒酶后，端粒酶与暴露的引物序列结合，在存在dNTP时，可以在引物末端形成重复的富含鸟嘌呤的序列。
进一步地，采用磁分离去除多余的酶与dNTP，加入血晶素，形成具有过氧化物酶活性的复合物，催化2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）显色，即可对miRNAs的含量进行可视化测定。
所述的靶标miRNAs为前列腺癌特异miRNAs序列，优选的为miR-708-3p、mir-141、mir-21、Let-7c、miR-1，即为核酸序列表中Seq No.2 RNA 2、Seq No.5 RNA 5、Seq No.8RNA 8、Seq No.11 RNA 11和Seq No.14 RNA 14。
在上述方案基础上，所述的端粒酶识别序列末端为TGTT或AGTT。
本发明中，所述的端粒酶提取方法为1994年12月23日发表在Science第26卷第5193期第2011-2015页题为Specific association of human telomerase activity withimmortal cells and cancer的论文中第2014页所记载的端粒酶提取方法。
本发明方法通过控制反应条件，在磁珠表面修饰识别靶标miRNAs的探针，探针包括靶标miRNAs的互补序列及端粒酶识别序列，探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列，端粒酶（telomerase）与识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT），该序列可以与血晶素结合，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，采用化学发光的方式对miRNAs含量进行高选择性、高灵敏度、简便快速的定量分析。
本发明的优点在于：
（1）本发明设计发夹结构探针，以识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测。分离方法便捷，所用材料部分已商品化，生物安全性高。
（2）本发明的检测过程不需借助专业仪器，反应仅需水浴锅进行，适应基层医疗检测需求。
（3）本发明成本低廉、检测灵敏、特异性高且可视化。可以很好的对实际样品中的微量miRNAs进行分析，适用于临床检测需求。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列（即核酸序列表中DNA 3或DNA 4序列）于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与10 μL100 μM 的DNA 1以摩尔比1:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液（1M Na Cl，20mM Mg Cl2，pH 7.4）洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2. 探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入10 nM 靶标miRNAs（即核酸序列表中RNA 2序列）溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液I（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM NaCl，2.7 mM K Cl，pH 7.4）洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1mM EGTA）重悬。
3. 端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4. 检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，溶液颜色由无色变为很深的蓝绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例2
1. 链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列（即核酸序列表中DNA 6或DNA 7序列）于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 20 μL100 μM 的DNA 1以摩尔比0.5:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液（1M Na Cl，20mM Mg Cl2，pH 7.4）洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2.探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入1 nM 靶标miRNAs（即核酸序列表中RNA 5序列）溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液I（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，2.7 mM K Cl，pH 7.4）洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mMEGTA）重悬。
3. 端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4. 检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，溶液颜色由无色变为深蓝绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例 3
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列（DNA 9或DNA 10）于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 10 μL 100 μM 的DNA1以摩尔比1:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液（1M Na Cl，20 mM Mg Cl2，pH7.4）洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2.探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入100 pM 靶标miRNAs（即核酸序列表中RNA 8序列）溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，2.7 mMK Cl，pH 7.4）洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）重悬。
3. 端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4. 检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，溶液颜色由无色变为浅蓝绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例4
1. 链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列（即核酸序列表中DNA 12或DNA 13序列）于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与10μL 100 μM 的DNA 1以摩尔比1:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液（1M Na Cl，20 mM Mg Cl2，pH 7.4）洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2. 探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入1 pM 靶标miRNAs（即核酸序列表中RNA 11序列）溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，2.7 mMK Cl，pH 7.4）洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）重悬。
3. 端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4. 检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，根据靶标浓度的不同，溶液颜色由无色变为较深的绿色，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
实施例5
1.链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM 生物素修饰的探针序列（即核酸序列表中DNA 15或DNA 16序列）于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA。取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5）重悬。10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与5μL 100 μM 的DNA 1以摩尔比2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液（1M Na Cl，20 mM Mg Cl2，pH 7.4）洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针。
2. 探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤1合成的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入100 aM 靶标miRNAs（即核酸序列表中RNA 14序列）溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min。将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，2.7 mMK Cl，pH 7.4）洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA）重悬。
3. 端粒酶扩增：
100 μL步骤2得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr。上述混合液采用磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液II（10 mM Na2 HPO4，2 mM K H2PO4，137 mM Na Cl，50 mM K Cl）洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋。
4. 检测：
1 μL 20 μM的hemin溶液加入100 μL步骤3得到的混合液，混合均匀后室温孵育10min。在上述混合液中加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM ABTS，混合均匀后，根据靶标浓度的不同，溶液颜色由无色变为较浅的绿色，可与对照组直接区分，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法
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<223>5'端生物素修饰
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Claims (4)
1.一种基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，其特征在于，包括链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的发夹结构的探针，探针与靶标miRNAs结合、端粒酶扩增和检测，探针包含与靶标miRNAs的互补序列和与端粒酶识别引物序列，发夹结构的探针识别靶标miRNAs后露出的引起序列，诱发端粒酶扩增进一步放大信号，并通过磁分离进行miRNAs可视化检测，包括以下步骤：
1、包括以下步骤：
（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：
取10 μL 100 μM生物素修饰的探针序列，包括Seq.No.3 DNA3、Seq.No.4 DNA4、Seq.No.6 DNA 6、Seq.No.7 DNA 7、Seq.No.9 DNA 9、Seq.No.10 DNA 10、Seq.No.12 DNA12、Seq.No.13 DNA 13、Seq.No.15 DNA 15、Seq.No.16 DNA 16中的一种或二种以上，于90℃孵育5 min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1 min后移除上清液，沉淀采用500 μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1M Na Cl，pH=7.5；10 μL 100 μM 的hairpin-DNA与 5~20 μL 100 μM 的Seq.No.1 DNA 1以摩尔比0.5:1~2:1的比例混合均匀后，与SA-beads进行充分混合，室温反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除未结合DNA，采用10 mM PB缓冲液洗涤磁珠3次，沉淀采用100 μL 10 mM PB缓冲液重悬，即可得到磁珠连接的探针，所述PB缓冲液为1M Na Cl、20mM Mg Cl2，pH 7.4；
（2）探针与miRNAs结合：
取10 μL步骤（1）合成的磁珠连接的探针采用10 mM PB缓冲液稀释10倍，加入0-100 nM靶标miRNAs，包括Seq.No.2 RNA 2、Seq.No.5 RNA 5、Seq.No.8 RNA 8、Seq.No.11 RNA 11或Seq.No.14 RNA 14的溶液，混合均匀后于45℃杂交反应30 min；将混合液置于磁力架上，磁分离去除上清，采用10 mM PBS缓冲液I洗涤三次，去除未捕获的miRNAs，所述的PBS缓冲液I为10 mM Na2 HPO4、2 mM K H2PO4、137 mM Na Cl、2.7 mM K Cl，pH 7.4；沉淀采用100 μL端粒酶延伸缓冲液（Te缓冲液）重悬，得到混合液，所述的Te缓冲液为：20 mM Tris-H Cl，1.5 mM Mg Cl2，63 mM K Cl，0.005%（v/v）Tween-20, 1 mM EGTA；
（3）端粒酶扩增：
100 μL步骤（2）得到的混合液中加入20 μL端粒酶提取物和1 mM 的dNTPs，混合均匀后，于30℃反应1 hr后，采用磁分离去除上清液，采用10 mM PBS缓冲液II洗涤三次，沉淀采用 100 μL PBS缓冲液II重旋，得到混合液，所述的缓冲液II为10 mM Na2 HPO4、2 mM KH2PO4、137 mM Na Cl和50 mM KCl；
（4）检测：
1 μL 20 μM的氯化血红素（hemin或称血晶素）溶液加入100 μL步骤（3）得到的混合液，混合均匀后室温孵育10 min后，加入1 μL 40 mM过氧化氢（H2O2）和50 μL 2 mM 2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS），混合均匀后，根据靶标浓度的不同，观测溶液颜色变化，采用紫外分光光度计记录405 nm处吸光度的变化。
2.根据权利要求1所述基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，其特征在于，所述的探针序列其5’末端修饰生物素，探针从5’端到3’端主要包含茎结合区、靶标miRNAs互补序列和端粒酶识别引物序列，端粒酶序列区域可与茎接合区互补，使探针形成发夹结构。
3.根据权利要求1或2所述基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，其特征在于所述的靶标miRNAs为前列腺癌特异miRNAs序列，包括miR-708-3p、mir-141、mir-21、Let-7c、miR-1。
4.根据权利要求1或2所述基于端粒酶扩增的miRNAs检测方法，其特征在于所述的端粒酶识别序列末端为TGTT或AGTT。
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