CN106148500B - 一体化微小rna荧光定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一体化微小RNA荧光定量检测试剂盒及其应用。具体地，本发明的用于检测微小RNA的试剂盒，包含：(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；和(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。采用本发明的试剂盒，可以将微小RNA加尾以及逆转录这两步反应合二为一。本发明可用于miRNA、siRNA及piRNA的定量检测,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物学和医学研究及临床诊断领域，具体涉及微小RNA荧光定量检测试剂盒，及其在组织标本或血液样品中微小RNA的荧光定量检测等方面的应用。
背景技术
微小RNA，包括microRNA(miRNA)、small interfering RNA(siRNA)以及piwi-interacting RNA(piRNA)，是一类长约18-30个核苷酸的非编码单链小分子RNA。
miRNA广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中，通过与靶基因mRNA的3’非编码区特异性结合，降解靶mRNA或者抑制靶基因翻译，从而导致靶基因表达减少。miRNA参与机体诸多生理过程及病理变化，调节胚胎发育、器官形成、细胞分裂、细胞增殖、细胞凋亡、干细胞更新和分化等生理过程。大量研究表明，miRNA的异常表达与疾病发生密切相关，miRNA具有潜力，可作为基因干预靶点或者基因药物用于临床治疗，也可作为分子标志物用于疾病早期诊断或者预后。
siRNA也广泛存在于真核细胞中，但内源性siRNA较少，大多是合成的外源性siRNA，导入细胞，达到基因沉默的目的。siRNA作为基因治疗手段，国外已批准多项临床试验。
piRNA大量存在于生殖细胞，曾经被认为是生殖细胞特异表达，近期研究表明piRNA在肿瘤细胞和干细胞也有微量表达。piRNA对保障生殖细胞遗传信息的稳定性具有重要作用。
可见，微小RNA功能广泛，具有重要的临床应用价值。微小RNA不论在科学研究或在临床应用，不论是作为疾病治疗靶点，还是作为疾病早期诊断标志物，都需要一种快速、准确、灵敏的定量检测方法。
目前微小RNA表达的检测方法主要有四种：(1)Northern blot技术、(2)原位杂交技术、(3)基因芯片技术、和(4)荧光定量PCR技术。Northern blot技术因为样本RNA需求量大，需要同位素标记探针才能达到高灵敏度检测，无法做到绝对定量，所以大多数用于研究所和实验室，不适于临床快速定量检测。原位杂交技术因为程序复杂，探针杂交特异性低，微小RNA表达信号弱，也无法实现液体样本的检测，这些都限制了其应用和推广。基因芯片技术适于表达谱的高通量检测，但因为假阳性率高，对其结果需要有一种更准确的方法验证。只有荧光定量PCR方法，准确性好，灵敏度高，检测速度快，被广泛应用于微小RNA的定量检测。
微小RNA属于RNA，根据基因扩增原理，RNA必须经过逆转录(RT)反应，催化反应变成cDNA，才能作为模板实现多聚酶链式反应(PCR)扩增以及定量检测。
与常规mRNA不同，微小RNA具有以下关键特征：(1)长度很短，只有18-30个碱基；(2)缺乏poly(A)尾巴；(3)序列差异小，有些miRNA之间只有1个碱基差别。鉴于这些特征，常规的mRNA逆转录方法和PCR扩增条件都不适于miRNA，这是因为：一方面oligo(dT)引物不能完成逆转录反应，另一方面，太短序列无法设计前后两条引物。
现有技术中，一种对微小RNA进行荧光定量检测方法是茎环(stem-loop)引物法。该方法需要一条特殊结构的逆转录引物，一端序列可自体形成茎环结构，另一端序列可与待测miRNA 3’端互补配对。然而，在该方法中，为了使逆转录反应具有微小RNA特异性，对于每种微小RNA都需要设计特异的逆转录引物，所以检测成本高，不适于广泛应用。
另一种对微小RNA进行荧光定量检测方法是poly(A)聚合酶加尾法。在该方法中，先在微小RNA 3’端人为添加poly(A)尾巴，再以Oligo(dT)引物完成逆转录反应。该方法灵敏度高、一次逆转录就可以合成所有微小RNA的cDNA，尤其适合于微小RNA的表达谱检测和高通量筛选。然而，该方法存在以下缺点：(1)需要两步反应完成cDNA的合成，第一步是给微小RNA进行poly(A)加尾，第二步是利用Oligo(dT)引物完成逆转录反应；(2)一次检测过程耗时长，通常需要约4-6小时；(3)仅用于miRNA检测，尚未用于其他微小RNA(包括siRNA及piRNA)的检测；(4)3’端通用引物特异性不够高，容易产生非特异扩增。
因此，本领域尚迫切需要开发更为简便、高效、特异性地对微小RNA进行荧光定量检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种更简便、高效、特异性地对微小RNA进行荧光定量检测方法和试剂盒。
本发明的第一方面，提供一种用于检测微小RNA的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，
其中，所述第一试剂组包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；
所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：
X-Y-Z (I)
式中，
X为长度为15-30个碱基的通用序列区；
Y为长度为10-20个碱基的oligo(dT)区；
Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；
(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，
其中，所述的第二试剂组包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，
并且，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。
在另一优选例中，所述的下游通用引物的序列与所述逆转录引物的通用序列区完全互补。
在另一优选例中，所述的下游通用引物的序列与所述逆转录引物的通用序列区不完全互补。
在另一优选例中，所述的下游通用引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基，更佳地为18-22个碱基。
在另一优选例中，X为长度为17-25个碱基(较佳地18-22个碱基)的通用序列区；和/或
Y为长度为12-18个碱基(较佳地13-17个碱基)的oligo(dT)区。
在另一优选例中，所述的Z的长度为1个碱基。
在另一优选例中，所述的逆转录引物为间并引物，其中含dA、dC、dG的三种引物的摩尔比为1～2：1～2:1～2。
在另一优选例中，所述的用于催化加尾反应的酶选自下组：RNA poly(A)聚合酶；和/或
所述用于催化逆转录反应的酶选自下组:SuperScript逆转录酶。
在另一优选例中，所述Poly A聚合酶和RNA逆转录酶的比例改为3：1-1：2，较佳地2.5：1至1：1.5。
在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液为5X缓冲液，其中所述5X缓冲液中钾离子的浓度为200-600mM，较佳地为300-500mM，更佳地为400±40mM。
在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的5X缓冲液中镁离子的浓度为50-200mM，较佳地为100-200mM，更佳地为150±20mM。
在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液中钾离子与镁离子的摩尔比为2～6:0.5～2，较佳地为3-5：1-2。
在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液具有选自下组的一个或多个特征：
(i)缓冲液含有的缓冲成分包括或由下组构成：
250mM Tris；
400mM KCl；和
150mM MgCl2；
(ii)pH为8.3。
在另一优选例中，所述的第一试剂组还包括选自下组的一种或多种成分：
(a1)加尾反应的底物；
(a2)逆转录反应的底物。
在另一优选例中，所述的第一试剂组还包括选自下组的底物成分：
5-20nM Oligo(dT)间并引物；
0.5-5mM dATP；
5-20mM dNTP。
在另一优选例中，所述的第一试剂组还含有DTT，较佳地DTT的浓度为0.5-5mM，较佳地为0.8-1.5mM。
在另一优选例中，所述的第一试剂组含有：
10nM Oligo(dT)间并引物；
1mM dATP；
10mM dNTP；和
1mM DTT。
在另一优选例中，所述的第二试剂组还包括选自下组的一种或多种成分：
(b1)用于扩增微小RNA的特异性上游引物；
(b2)用于催化聚合酶链反应的酶；
(b3)用于PCR扩增反应的缓冲液；
(b4)用于PCR扩增反应的底物；
(b5)荧光剂。
在另一优选例中，所述的荧光剂选自下组：SYBR Green。
在另一优选例中，所述的特异性上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，第一试剂组包括：
生物催化酶混合液，其中所述的生物催化酶混合液含有用于催化加尾反应的酶和用于催化逆转录反应的酶；
催化反应底物混合物，其中，所述催化反应底物混合物含有用于加尾反应的底物dATP和用于逆转录反应的底物dN，其中dNTP包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，第二试剂组包括：PCR荧光扩增反应预混液，所述PCR荧光扩增反应预混液中含有用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的缓冲组分、用于PCR扩增反应的底物、和荧光剂；
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：第三容器以及位于所述第三容器内的不含核酸酶的水。
在另一优选例中，所述的第一试剂组和/或第二试剂组中的一种或多种成分分别放置于不同或相同的容器中。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：
(c)阳性对照。
在另一优选例中，所述的阳性对照为特异性扩增5s rRNA的前引物。
在另一优选例中，所述的5s rRNA的前引物的序列如下：5’TCTACGGCCATACCACCCTGAA 3’；
用于逆转录反应的特殊引物序如下：
5’GCCATGGGATAACACTAAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)3’(SEQ ID NO.:2)和/或
用于荧光定量PCR反应的通用后引物序列如下：
5’GCCATGGGATAACACTAAGC 3’(SEQ ID NO.:3)
在另一优选例中，所述的微小RNA包括miRNA、siRNA和piRNA。
在另一优选例中，所述的试剂盒可检测源自动物、植物和微生物样本的微小RNA。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于细胞、组织和体液的微小RNA检测。
在另一优选例中，所述的体液包括血液、尿液、组织分泌液、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面中用于检测微小RNA的试剂盒的用途，它被用于制备用于肿瘤或心血管疾病的早期诊断和/或预后的检测产品。
在本发明的第三方面，提供了一种非诊断性和非治疗性地体外检测微小RNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供一含微小RNA的待测样品；
(ii)将所述含微小RNA的待测样品加入加尾反应/逆转录反应催化体系，在一步反应中进行加尾反应/逆转录反应，从而形成逆转录的cDNA产物；
所述催化体系含有：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、逆转录引物、用于加尾反应的底物、和用于逆转录反应的底物和水；
其中，所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：
X-Y-Z (I)
式中，
X为长度为15-30个碱基的通用序列区；
Y为长度为10-20个碱基的oligo(dT)区；
Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；
(iii)对上一步骤中形成的cDNA逆转录产物，进行PCR扩增，形成扩增产物；其中，所述PCR扩增所采用的引物对包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物和用于扩增微小RNA的特异性上游引物；
其中，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区；
(iv)在步骤(iii)进行中或之后，检测所述扩增产物的存在与否和/或数量，从而获得所述微小RNA的检测结果。
在另一优选例中，所述的检测结果为定量检测结果。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，将所述的生物催化酶混合物、催化反应缓冲液、催化反应底物混合物以及不含核酸酶的水与总RNA混合物后发生反应，在微小RNA 3’端添加poly(A)尾且逆转录合成cDNA。
在另一优选例中，在步骤(iii)之前，还包括：将步骤(ii)得到的cDNA用去离子水进行稀释(如稀释1-1000倍)。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，将PCR扩增反应通用后引物、5s rRNA PCR扩增反应前引物、待测微小RNA PCR扩增反应前引物、PCR荧光扩增反应预混液、以及不含核酸酶的水进行混合，形成PCR扩增体系，然后进行PCR扩增。
在另一优选例中，通过荧光检测，确定扩增产物的数量，进而确定微小RNA的数量。
在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：
(1)所述的生物催化酶混合物、催化反应缓冲液、催化反应底物混合物以及不含核酸酶的水的体积比为0.5-1.5:2-10:2-10:8-25；
(2)所述步骤(ii)的反应条件为37±1℃水浴反应30-60分钟，之后90-98℃反应2-8分钟；
(3)所述步骤(ii)的反应体系中含有0.5pg-200ng总RNA；
(4)所述步骤(ii)的反应容器、取样枪头、反应环境均不含核酸酶；
(5)所述的体系中含有0.5pg-10ng总RNA，1pg-1ng总RNA，更佳地1pg-100pg总RNA；最佳地1pg-50pg总RNA。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明用于微小RNA定量检测的流程示意图。
图2显示了本发明用于微小RNA定量检测的技术原理图。
图3显示了本发明一次逆转录反应可完成多种微小RNA的定量检测示意图。
图4显示了本发明一个实施例中，本发明用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231微小RNAlet-7b,let-7c和5s rRNA定量检测的扩增曲线图(上)和溶解曲线图(下)(三孔重复)。
图5显示了本发明一个实施例中，用于人血浆样本微小RNA miR-16的结果。其中图5上显示了血浆样本的微小RNA稀释十倍前后扩增曲线图；图5下显示了血浆样本的微小RNA稀释后检测结果与稀释倍数一致。
图6显示了本发明一个实施例中，本发明用于实验动物小鼠脂肪垫组织样本微小RNA let-7b,let-7f和5s rRNA定量检测的扩增曲线图(上)和溶解曲线图(下)(三孔重复)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过对检测试剂和检测条件的大量筛选，首次意外地开发了一种将polyA加尾反应与逆转录反应合二为一的微小RNA检测方法。通过特殊设计的引物和缓冲体系，本发明的微小RNA检测方法能够更简便、更精确、更高效地对多种微小RNA进行荧光定量检测,因而可更广泛地应用到生物医学研究及临床疾病早期诊断等领域。在此基础上，完成了本发明。
试剂盒
本发明提供了一种用于检测微小RNA的试剂盒，所述试剂盒含有：
(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，
其中，所述第一试剂组包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；
所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：
X-Y-Z (I)
式中，
X为长度为15-30个碱基的通用序列区；
Y为长度为10-20个碱基的oligo(dT)区；
Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；
(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，
其中，所述的第二试剂组包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，
并且，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。
在一优选例中，所述的第一试剂组可位于第一容器内；而所述的第二试剂组分别可位于第二容器内。
在另一优选例中，在所述的第一容器或第二容器中，所述的第一试剂组或第二试剂组为固态或液态。
在另一优选例中，所述的第一试剂组或第二试剂组为固态，并且通过仅添加水，就可形成工作浓度的液态混合物。
另外，为了便于长期保存，也可将各试剂分别放置于不同的容器中。
典型地，本发明的一种试剂盒(用于实施例1-3)包含以下各管及其相应成分：
1.管A：生物催化酶混合物(Enzyme mix)，用于微小RNA 3’端添加poly(A)尾巴的反应及逆转录合成cDNA的反应。
2.管B：催化反应缓冲液(Reaction Buffer),含有优化的最佳钾离子和镁离子浓度，以及溶液酸碱性，同时满足了微小RNA 3’端poly(A)加尾巴反应和逆转录反应的条件。
3.管C：催化反应底物混合物(Reaction Mix),含有微小RNA 3’端poly(A)加尾反应和逆转录反应所需的各种底物，以及三种带通用tag的Oligo(dT)逆转录引物。
4.管D：PCR扩增反应通用后引物(Universal Reverse Primer)。
5.管E：5s rRNA PCR扩增反应前引物(Forward Primer for 5s rRNA)。
6.管F：待测微小RNA PCR扩增反应前引物(Forward Primer for a miRNA orpiRNA)。
7.管G：PCR荧光扩增反应预混液(2x SYBR Master Mix,商品化产品，市场通用)，含微小RNA聚合酶荧光定量扩增反应的底物和酶，包括DNA聚合酶，dNTP,SYBR等。
8.管H：不含核酸酶的水(Nuclease free H2O)。
9.使用说明书。
适用于本发明的通用tag序列没有特别限制，可以采用本领域常规的tag序列，只要该tag序列不与待检测的微小RNA具有高同源性即可，从而可消除PCR反应微小RNA的非特异扩增。通常，tag序列的长度为18-25nt。
检测方法
本发明方法，采用的试剂盒包含微小RNA poly(A)加尾反应、逆转录反应及PCR反应三个步骤所需全套试剂，并且优化了反应条件，把加尾反应和逆转录反应合为一，在本发明提供的反应条件下，微小RNA在加poly(A)尾的同时，完成逆转录反应，简化了操作流程，缩短了检测时间，提高了检测效率。
如图1、图2和图3所示，在本发明方法中，将总RNA的poly(A)加尾反应与逆转录反应合二为一。完成逆转录反应之后，利用微小RNA序列特异前引物和通用后引物，通过多聚酶链式反应，SYBR green荧光染料结合到合成的双链DNA结构中。通过反应系统荧光强度的实时检测，可定量计算双链DNA的合成效率。根据数据分析，可准确快速地得出检测结果。
上述用于逆转录反应的特殊引物序列从5’端开始依次是tag+oligo(dT)+核苷酸(dA，dG，或dC)。例如，典型地，tag可由20个核苷酸组成，并且也可作为PCR反应的通用后引物序列，oligo(dT)可由15个dT组成。这样设计的逆转录引物，可以将所有带poly(A)尾的RNA，包括加尾处理的各类微小RNA，都逆转录成为cDNA。
本发明以含miRNA、siRNA或piRNA的总RNA为起始模板，单次孵育反应，就能完成所有miRNA、siRNA、piRNA及其他微小RNA的cDNA合成，可用于多种微小RNA的PCR检测或者微小RNA的高通量检测。
本发明检测微小RNA，灵敏度高，线性范围广，起始RNA量从1pg到2ug之间都有良好的线性关系。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点包括：
(1)微小RNA的poly(A)加尾反应和逆转录合成cDNA反应合为一步反应，简化了操作流程，整个检测时间缩短了至少30％。
(2)酶催化反应缓冲液能够同时最大程度满足poly(A)加尾反应和逆转录合成cDNA反应需要，此外，通过特别优化的盐离子浓度和酸碱性，可以取得非常优良的加尾和逆转录效果。
(3)酶催化反应底物mix能够满足poly(A)加尾反应和逆转录合成cDNA反应对所有底物的需求。
(4)酶mix中poly(A)聚合酶与逆转录酶的最佳比例，在保证催化反应最高效率的前提下，成本最低化。
(5)一次逆转录反应，就能实现多种微小RNA的检测，最快可以在2.5小时内完成384个微小RNA的定量检测。
(6)逆转录引物采用三条引物的混合，从5’端开始，其结构组成是：tag+oligo(dT)+(dA或dG或dC)。其中，tag由20个核苷酸组成，oligo(dT)由15个dT组成。
(7)根据待测微小RNA的序列信息，每种微小RNA都设计其序列特异的前引物，用于PCR扩增。
(8)SYBR Green荧光染料掺入法以及20个核苷酸组成的通用后引物，用于微小RNA的实时定量PCR检测。
(9)本发明试剂盒和检测方法可广泛应用于生物医学研究、疾病早期诊断和预后等方面，有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
通用方法和试剂
(A)试剂
用于阳性对照的特异性扩增5s rRNA的前引物的序列如下：
5’TCTACGGCCATACCACCCTGAA 3’(SEQ ID NO.:1)
逆转录反应的特殊引物序列从5’端开始依次是tag+oligo(dT)+核苷酸(dA，dG，dC)。tag为20个核苷酸组成，作为PCR反应的通用后引物序列，oligo(dT)由15个dT组成，其中含dA、dC、dG的三种引物的摩尔比为1:1:1。
用于逆转录反应的特殊引物序如下：
5’GCCATGGGATAACACTAAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)3’(SEQ ID NO.:2)
用于荧光定量PCR反应的通用后引物序列如下：
5’GCCATGGGATAACACTAAGC 3’(SEQ ID NO.:3)
(B)操作流程
1.poly(A)加尾和逆转录过程。本流程所需时间35-60分钟。
反应体系组成：
总RNA：1pg～200ng
管A(Enzyme mix)：1ul；
其中，Poly A聚合酶和RNA逆转录酶用量(IU)为2:1。
管B(Buffer)：4ul,
所述缓冲液(pH为8.3)含有的缓冲成分如下：
250mM Tris；
400mM KCl；和
150mM MgCl2。
管C(reaction mix)：4ul
管H(Nuclease free water)：补足到终体积20ul
摄氏37℃水浴反应30分钟，之后95℃5分钟，离心，放置冰上，直接进入PCR反应或者-20℃冷冻保存。
2.cDNA稀释：根据上述逆转录反应的起始RNA量，以及待检测微小RNA的表达丰度，对上一步合成的cDNA用去离子水稀释1～1000倍。本流程所需时间5分钟。
3.实时定量PCR扩增反应。本流程所需时间90分钟。
反应体系组成(单管、96孔或384孔板)：
cDNA：2ul
管D(通用后引物)：1ul
管E(阳性对照前引物)或者F(待测微小RNA前引物)：1ul
管G(2X SYBR mix)：10ul
管H(Nuclease free water)：补足到终体积20ul
反应条件：95℃10分钟，40个循环的95℃20秒，60℃1分钟。
4.PCR结果数据分析。
实施例1
人乳腺癌细胞中微小RNA的测定
在本实施例中，采用常规方法制备来自人乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自美国ATCC)的总RNA，并通过系列稀释法稀释成所需的总RNA浓度，0.5pg/1微升、5pg/1微升、50pg/1微升、500pg/1微升。在所述20微升的反应体系中，总RNA的数量为0.5pg、5pg、50pg或500pg。
然后用本发明方法定量检测生物细胞样本的微小RNA含量。
在本实施例中，检测人乳腺癌细胞MDA-MB-231的微小RNA let-7b，let-7c和5srRNA(阳性对照)。
采用5pg总RNA样本时的扩增曲线和溶解曲线图如图4所示。
从图4的微小RNA扩增曲线可见清晰的背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和扩增平台期阶段。另外，在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间标准的线性关系，故选择在这个阶段进行微小RNA定量分析。
图4中微小RNA溶解曲线可见每个微小RNA都呈现单一的扩增峰，表明微小RNA扩增产物的单一性和特异性。
从图4结果可见：
1)检测重复性好。每个微小RNA三个复孔的检测重复性很好。
2)检测特异性好。let-7b和let-7c序列虽然只有一个碱基差别，应用该试剂盒能够特异性检测和区分。而常规northern blot检测方法是无法做到的。
3)假阳性率低。空白对照未检测到任何待测RNA，也进一步证实了检测特异性。
4)检测灵敏度高。通过稀释倍数折算，该检测只用了5pg总RNA样本，能准确检测细胞样本的微小RNA含量。
实施例2
生物体液样本的微小RNA的测定
在本实施例中，采用常规方法制备来自人血浆(健康的自愿者提供)的总RNA，并定量检测所述生物体液样本的微小RNA含量。方法同实施例1。在所述20微升的反应体系中，总RNA的数量为5pg或50pg。
对于正常人的血浆的微小RNA miR-16(三孔重复，50pg总RNA)的扩增曲线如图5所示。
从图5结果可见：
1)检测重复性好。微小RNA三复孔的检测重复性很好。
2)检测准确性好。本次试验把样本RNA进行了1:10稀释，然后同时检测同一个微小RNA miR-16。如图5所示，扩增曲线相差3.4个周期，换算为表达含量之后，两个样本之间的miR-16表达差异为10.55倍，检测非常准确，误差率只有0.5％。
3)检测灵敏度高。通过稀释倍数折算，该检测只用了0.05ng总RNA样本，能准确检测到血浆样本微小RNA含量。
4)检测结果假阳性率低。本次试验加了一组空白水样本，如图所示，空白水样本检测结果显示，miR-16含量为零。
实施例3
生物组织样本的微小RNA的测定
在本实施例中，采用常规方法制备来自小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)乳腺脂肪垫组织的总RNA，并定量检测所述组织样本的微小RNA含量。方法同实施例1。在所述20微升的反应体系中，总RNA的数量为1pg、10pg、或50pg。
实验小鼠乳腺脂肪垫组织的微小RNA let-7b、let-7f和5s rRNA(三孔重复，10pg总RNA)的扩增曲线和溶解曲线如图6所示。
从图6所示结果可见：
1)检测重复性好。每个微小RNA三复孔的检测重复性很好。
2)检测特异性好。Let-7b和let-7f属于同一个微小家族不同成员，序列非常近似，但本发明的试剂盒能够特异性区分和检测。这是常规northern blot检测方法无法做到的。另外，空白对照没有检测到这几个微小RNA的含量。
3)检测灵敏度高。通过稀释倍数折算，该检测只用了10pg RNA样本，就能灵敏检测生物组织样本微小RNA含量。
实施例4-9
重复实施例1，其中，在所述20微升的反应体系中，总RNA的数量为50pg或500pg。
另外，在这些实施例中，不同点在于分别采用不同的反应条件：
实施例4：管A中Poly A聚合酶和RNA逆转录酶的比例改为3：1和1：2；
实施例5：管A中Poly A聚合酶和RNA逆转录酶的比例改为1：5；
实施例6：管B镁离子浓度改为5mM；
实施例7：管B镁离子浓度改为300mM；
实施例8：逆转录引物X区通用引物序列的长度改为10nt；
实施例9：采用常规的独立的加尾缓冲体系和逆转录缓冲体系，将RNA加尾反应和逆转录反应分两步进行。
结果显示，
在实施例4和5中，当Poly A聚合酶和RNA逆转录酶之比的参数改变后，微小RNA扩增效率尚可但有所降低(3:1和1:2)，尤其管A Poly A聚合酶和RNA逆转录酶的比例1：5条件下，微小RNA不能成功扩增。
在实施例6和7中，当镁离子浓度改变后，微小RNA扩增效率显著降低(与实施例1相比)。
在实施例8中，缩短通用引物序列为10nt，微小RNA扩增出现双峰甚至多峰，表明扩增产物不单一，微小RNA检测不特异。
在实施例9中，微小RNA扩增效率差不多，但所需时间及酶消耗成本都增加了一倍。
从上述实施例中可以看出，本发明的试剂盒无论在微小RNA检测灵敏性、特异性、准确性等各方面达到了最优化，在检测成本及所需时间上实现了最低耗和最高效。具体地，
1.本发明首次实现了微小RNA加尾poly(A)和逆转录反应的两步合一。
2.本发明通过优化了酶催化反应条件，包括钾离子浓度、镁离子浓度、pH值等，同时满足了poly(A)加尾和逆转录高效反应的要求。
3.在反应体系中，实现了poly(A)聚合酶和逆转录酶的最佳比例，既能保证两步反应的最高效率，有把实验成本降低到最低限度。
4.逆转录引物采用三条引物的混合，可以使各种微小RNA(3’端dA,dT,dC,dG)都能被逆转录为cDNA，理论上排除了任何漏网的可能性。
5.一次逆转录反应，就能实现多种微小RNA的检测。比如一次反应，2.5小时，最快可以完成384个微小RNA的定量检测。
6.本发明可用于动物、植物或微生物样本，适用于细胞、组织、体液(包括血液和组织分泌物)中制备的RNA。
7.除了miRNA，也可用于其他微小RNA，包括piRNA及siRNA的检测。
8.本发明的试剂盒包含了poly(A)加尾反应、逆转录反应、荧光定量PCR反应所需的所有试剂，包括待测微小RNA的引物、用于结果分析校正及阳性对照的管家基因引物，真正实现了ALL-IN-ONE。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (16)
1.一种用于检测微小RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，
其中，所述第一试剂组包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；
所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：
X-Y-Z (I)
式中，
X为通用序列区，并且X的序列是GCCATGGGATAACACTAAGC；
Y为长度为12-18个碱基的oligo(dT)区；
Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG，
其中所述的逆转录引物为间并引物，其中含dA、dC、dG的三种引物的摩尔比为1～2：1～2:1～2；
(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，
其中，所述的第二试剂组包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，
并且，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区；
并且，所述的Z的长度为1个碱基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，Y为长度为13-17个碱基的oligo(dT)区。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于催化加尾反应的酶选自下组：RNA poly(A)聚合酶；和/或
所述用于催化逆转录反应的酶选自下组:SuperScript逆转录酶。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于加尾反应和逆转录反应为5X缓冲液，其中在5X缓冲液中钾离子的浓度为200-600mM。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，5X缓冲液中钾离子的浓度为300-500mM。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，5X缓冲液中钾离子的浓度为400±40mM。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于加尾反应和逆转录反应的5X缓冲液中镁离子的浓度为50-200mM。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录引物为5’GCCATGGGATAACACTAAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)3’(SEQ ID NO.:2)；
并且用于荧光定量PCR反应的下游通用引物的序列如下：
5’GCCATGGGATAACACTAAGC 3’(SEQ ID NO.:3)。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于加尾反应和逆转录反应的5X缓冲液中镁离子的浓度为150±20mM。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液具有选自下组的一个或多个特征：
(i)缓冲液含有的缓冲成分包括或由下组构成：
250mM Tris；
400mM KCl；和
150mM MgCl2；
(ii)pH为8.3。
11.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的微小RNA包括miRNA、siRNA和piRNA。
12.如权利要求1所述的用于检测微小RNA的试剂盒的用途，其特征在于，用于制备用于肿瘤或心血管疾病的早期诊断和/或预后的检测产品。
13.一种非诊断性和非治疗性地体外检测微小RNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(i)提供一含微小RNA的待测样品；
(ii)将所述含微小RNA的待测样品加入加尾反应/逆转录反应催化体系，在一步反应中进行加尾反应/逆转录反应，从而形成逆转录的cDNA产物；
所述催化体系含有：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、逆转录引物、用于加尾反应的底物、和用于逆转录反应的底物和水；
其中，所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：
X-Y-Z (I)
式中，
X为通用序列区，并且X的序列是GCCATGGGATAACACTAAGC；
Y为长度为12-18个碱基的oligo(dT)区；
Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；
其中所述的逆转录引物为间并引物，其中含dA、dC、dG的三种引物的摩尔比为1～2：1～2:1～2；
并且，所述的Z的长度为1个碱基；
(iii)对上一步骤中形成的cDNA逆转录产物，进行PCR扩增，形成扩增产物；其中，所述PCR扩增所采用的引物对包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物和用于扩增微小RNA的特异性上游引物；
其中，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区；
(iv)在步骤(iii)进行中或之后，检测所述扩增产物的存在与否和/或数量，从而获得所述微小RNA的检测结果。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：
(1)所述的生物催化酶混合物、催化反应缓冲液、催化反应底物混合物以及不含核酸酶的水的体积比为0.5-1.5:2-10:2-10:8-25；
(2)所述步骤(ii)的反应条件为37±1℃水浴反应30-60分钟，之后90-98℃反应2-8分钟；
(3)所述步骤(ii)的反应容器、取样枪头、反应环境均不含核酸酶；
(4)所述的体系中含有1pg-100pg总RNA。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的体系中含有1pg-50pg总RNA。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的逆转录引物为5’GCCATGGGATAACACTAAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)3’(SEQ ID NO.:2)；
并且用于荧光定量PCR反应的下游通用引物的序列如下：
5’GCCATGGGATAACACTAAGC 3’(SEQ ID NO.:3)。
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