CN113604564A

CN113604564A - 一种检测外泌体相关microRNA分子的方法

Info

Publication number: CN113604564A
Application number: CN202110697292.9A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 渠香云; 董肇楠; 贾芸莉; 马雪情
Original assignee: Jiangsu Microdiag Biomedicine Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Microdiag Biomedicine Technology Co ltd
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2021-11-05
Also published as: CN107365852A; CN107365852B; US20220136056A1; WO2019033831A1; CN113930503A; CN113930503B

Abstract

本发明公开了一种检测外泌体相关microRNA分子的方法，开发出基于PCR平台miRNA的两步法检测试剂盒，在肺癌的辅助诊断方面具有突出优势，灵敏度最低可达到1copy/μL，极大提高了检测的准确度。

Description

一种检测外泌体相关microRNA分子的方法

本申请是公开号为CN107365852A的分案申请。原申请专利的申请号为2017106930281，申请日为2017年8月14日，发明名称为“血清外泌体中肺癌相关microRNA分子标记的应用及其检测试剂盒”。

技术领域

本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及一种检测外泌体相关microRNA分子的方法。

背景技术

外泌体(exosome)是一种广泛存在并分布于各种体液中可由多种细胞分泌的膜性小囊泡，直径一般介于30～120nm之间，包含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，除了能作携带和传递重要的信号分子，形成一种全新的细胞间信息传递系统从而改变其他细胞的功能外，在很多生理病理上起着重要的作用。研究表明，肿瘤exosome的分子特征部分反映其来源肿瘤的表型，所携带的肿瘤特异性microRNA和抗原可以作为肿瘤诊断标志物。此外exosome可以选择性的将某些细胞蛋白移出，在细胞之间传递很多种类型的分子，可以诱发与增强机体免疫反应，在免疫监视、炎症反应及癌症发生发展等许多生理和病理过程中有重要的功能。在包括膀胱癌、脑瘤、结直肠癌和黑色素瘤在内的多种肿瘤临床病例中，均能从患者血清或尿液等体液中分离exosome用于早期临床诊断，也可用于肿瘤的临床风险或疗效评估，以及预后判定。

外泌体中含有大量mRNA和microRNA，不仅保护体外RNA稳定存在免遭降解，还能够作为有效的载体将RNA转运到特定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。Exosome承载的120多种microRNA具有多种功能。如miR-1、miR-17、miR-18、miR-181和miR-375与血管生成、造血、细胞外分泌和肿瘤的发生有关。

microRNA(又称miRNA或miR)——作为Science 2002年十大科技突破的第一名——是21世纪生命科学研究重大发现之一，它在生物的发育时序调控和疾病的发生中起到非常重要的作用。miRNA通过调节癌基因及抑癌基因的表达，调控细胞的分化、增殖、凋亡，从而促进或抑制肿瘤的发生，期间有着复杂的调节机制，形成调控网络，共同促进或抑制肿瘤的发生。甲基化、生物起源上的缺陷、变异、转录的异常以及基因组的丢失或扩增等均导致miRNA在人类肿瘤中的异常，许多miRNA直接表现为一种原癌基因或抑癌基因的作用，致癌与抑癌miRNA通过正向或负向调控肿瘤抑制基因、癌基因或控制细胞周期进程、分化或凋亡的基因，直接调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，参与肿瘤的生成、发展甚至侵袭转移。大量的研究显示，miRNA在肿瘤细胞、癌组织、癌旁组织、正常组织中都有特征性的表达谱改变，在肿瘤患者的血尿中也有特征性的表达水平改变，这就为肿瘤的诊断提供了新的思路，也提示miRNA可能可以成为肿瘤诊断的重要的分子生物学标志。

外周血因其具有创伤小、易获取、可重复、可检测指标众多等优点，一直是临床疾病标志物检测的主要标本来源。近年研究发现，外周血中存在内源性循环miRNA，且因其具有较高的稳定性和特异性，有望成为诸如肿瘤等多种疾病的生物学标志物。有研究者提出，循环miRNA主要存在于外泌体中，有可能成为较好的检测血清miRNA的来源。因此，若结合exo-miRNA的相关特点，如果能研发出相应的高特异性肺癌诊断试剂盒使之能够应用于肺部结节良恶性辅助的鉴别诊断及科研领域，将很好地促进肺癌筛查研究及科研成果的转化，对于良恶性肺部肿瘤的区分、诊疗必将起到巨大的推动作用。

目前，已有的microRNA做为检测肺癌分子标志物的应用，因其准确性、特异性不高或需要几个标志物同时检测，检测成本高等缺陷，并没有适合商业化生产的试剂盒。

此外，基于PCR平台miRNA的两步法检测体系主要包括探针法miRNA定量检测技术和染料法检测技术，1)、结合探针的定量检测技术，包括茎环引物(Stem-loop RT-PCR)探针法，key-like法和酶连法(Ligation Assay)。这三种方法需要使用miRNA特异的探针，这类方法的突出优点是特异性强，常常能区分同一miRNA家族的不同变体。但存在miRNA与Stem-loop RT结合不牢固，茎环引物与非目标miRNA的错配现象。2)、基于PCR与荧光染料如SYBRGreen的定量检测技术，包括poly(A)聚合酶加尾法、Stem-loop染料法、引物延伸法、多通路法(Multiplexed RT)等。使用SYBR Green技术大多灵敏度较高，费用普遍较低，但特异性较低。相对而言，加PolyA尾及茎环结构的方法，将miRNA配对的序列延长，然后进行正常的反转录及后续的PCR检测。茎环法只针对成熟miRNA，特异性相对较高；加尾法可以检测到成熟miRNA及pre-miRNA，特异性和灵敏度都差一些，但操作及引物设计简单。

发明内容：

一种肺癌辅助诊断检测试剂盒，该试剂盒是基于PCR平台miRNA两步法检测试剂盒，说明书中所述的所有两步法检测体系为构建该试剂盒的理论基础。包含：microRNA分子标志物特异性茎环结构逆转录引物、PCR上游引物、PCR通用下游引物，用于检测microRNA分子标记物的特异探针，其中，所述的microRNA分子标志物至少为两种，其中一种选自上调标志物miR-21、miR-486-5p、miR-205或miR-126；另一种选自下调标志物miR-152、Let-7a或miR-148a。

优选的，所述特异性茎环结构逆转录引物的颈部的loop环部设计非连续互补碱基对TGCG和CGCA构成钥匙状结构，逆转录反应时通过连接酶将短臂与microRNA分子相连接。

更优选的，所述的分子标志物miR-21逆转录引物序列如SEQ ID NO.1：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCATCAACAT-3'；

miR-21PCR上游引物序列如SEQ ID NO.2：

5'-CTCCGTCAGGGTAGCTTATCAGACTG-3'；

miR-21PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

miR-21特异探针序列如SEQ ID NO.4：

5'-FAM-TTTCCTCATCATCAACAT-MGB-3'

所述的分子标志物miR-486-5p逆转录引物序列如SEQ ID NO.5：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACTCGGGG-3'；

miR-486-5p PCR上游引物序列如SEQ ID NO.6：

5'-CTCCGTCAGGGTCCTGTACTGAGCTG-3'；

miR-486-5p PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

miR-486-5p特异探针序列如SEQ ID NO.7：

5'-FAM-TTTCCTCATCACTCGGGG-MGB-3'

所述的分子标志物miR-205逆转录引物序列如SEQ ID NO.8：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACAGACTC-3'；

miR-205PCR上游引物序列如SEQ ID NO.9：

5'-CTCCGTCAGGGTCCTTCATTCCACCG-3'；

miR-205PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

miR-205特异探针序列如SEQ ID NO.10:

5'-FAM-TTTCCTCATCACAGACTC-MGB-3'；

所述的分子标志物miR-126逆转录引物序列如SEQ ID NO.11：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACGCATTA-3'；

miR-126PCR上游引物序列如SEQ ID NO.12：

5'-CTCCGTCAGGGTCGTACCGTGAGTAA-3'；

miR-126PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

miR-126特异探针序列如SEQ ID NO.13：

5'-FAM-TTTCCTCATCACGCATTA-MGB-3'

所述的分子标志物let-7a逆转录引物序列如SEQ ID NO.14：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCAACTATAC-3'；

let-7a PCR上游引物序列如SEQ ID NO.15：

5'-CTCCGTCAGGGTGAGGTAGTAGGTT-3'；

let-7a PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

let-7a特异探针序列如SEQ ID NO.16：

5'-FAM-TTTCCTCATCAACTATAC-MGB-3'

所述的分子标志物miR-152逆转录引物序列如SEQ ID NO.17：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCAAGTCGGAG-3'；

miR-152PCR上游引物序列如SEQ ID NO.18：

5'-CTCCGTCAGGGAGGTTCTGTGATACA-3'；

miR-152PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

miR-152特异探针序列如SEQ ID NO.19：

5'-FAM-TTTCCTCATCAAGTCGGAG-MGB-3'；

所述的分子标志物miR-148a逆转录引物序列如SEQ NO.20：

5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCAAGTCGGAG-3'；

miR-148a PCR上游引物序列如SEQ ID NO.21：

5'-CTCCGTCAGGGAAAGTTCTGAGACA-3'；

miR-148aPCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.3：

5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；

miR-148a特异探针序列如SEQ ID NO.22：

5'-FAM-TTTCCTCATCAAGTCGGAG-MGB-3'；

更优选的，还包括miRNA分子标志物校准品：miR-21分子标志物标准品为miR-21，稀释后浓度为10¹³copy/μL；miR-486-5p分子标志物标准品为miR-486-5p，稀释后浓度为10¹³copy/μL；miR-205分子标志物标准品为miR-205，稀释后浓度为10¹³copy/μL；miR-126分子标志物标准品为miR-126，稀释后浓度为10¹³copy/μL；let-7a分子标志物标准品为let-7a，稀释后浓度为10¹³copy/μL；miR-152分子标志物标准品为miR-152，稀释后浓度为10¹³copy/μL；miR-148a分子标志物标准品为miR-148a，稀释后浓度为10¹³copy/μL。

所述试剂盒还包括microRNA分子特异性扩增模板、Vent(exo-)DNA聚合酶、Nicking酶、双链特异性核酸酶和分子杂交探针。

基于PCR平台miRNA的两步法检测试剂盒

逆转录引物：本发明特异性的逆转录引物结合了茎环引物(Stem-loop RT-PCR)法和key-like法的设计优点：1.Stem-loop RT逆转录引物(图1)颈部Stem碱基对延长，并且在loop环部设计了4对非连续互补碱基对加强其形成key-like结构的能力，从而促使RT引物在整个逆转录过程能更好地保持茎环结构，不仅杜绝了茎环引物与非目标miRNA的错配提高特异性，而且使逆转录产物碱基数增加，更有利于后续的PCR检测。2.Stem-loop RT与miRNA有5对碱基完全互补，并且在逆转录前增加了酶连接步骤(图1)，使miRNA与Stem-loopRT结合更牢固，增强了逆转录的效率。3.本发明利用Stem-loop RT引物对miRNA逆转录产物也可用于荧光染料法PCR检测。

PCR上下游引物：特异性上游引物加上Tag标签从而延长扩增模板增加扩增效率，并调整下游引物使上下游引物Tm值基本相同，使得在PCR预变性后上下游引物可同时与模板结合并进行扩增，退火和延伸同一温度下进行。

水解探针：本发明采用TaqMan技术的设计方法，设计一条与模版互补的特异性水解探针(图1)，增强检测的特异性。

对一种miRNA标志物定量检测，选取该miRNA作为miRNA标志物的内控基因，根据CP值，使用相对定量公式(2^-ΔΔCp)计算标志物相对表达量的倍数变化，算出miRNA的得分。并利用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)分析miRNA标志物的相对表达量与具有人口统计学特征的患者、良性病变和健康个体三者之间的相关性。临床病理诊断用作参考标准以决定miRNA标志物的敏感性和特异性。临床病理诊断用作参考标准确定miRNA标志物的敏感性和特异性。使用ROC特征曲线和AUC分析来确定miRNA联合检测的准确度，以cut off值对样本结果进行判读。

对两种或两种以上miRNA标志物联合检测，选取1)miR-21、miR-486-5p、miR-205或miR-126的至少一种的上调；2)miR-152、Let-7a或miR-148a的至少一种的下调；3)上调分子标志物和下调分子标志物联合使用。根据CP值，使用相对定量公式计算相对表达量2^-ΔΔCp，算出每种miRNA的得分。并利用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)分析每种miRNA标志物的相对表达量得分与具有人口统计学特征的患者、良性病变和健康个体三者之间的相关性。临床病理诊断用作参考标准以决定每种miRNA标志物miRNA标志物的敏感性和特异性。临床病理诊断用作参考标准确定miRNA标志物的敏感性和特异性。然后用逻辑回归模型(Logistic regression models)得出二元logistic回归方程，并选择miRNA标志物的最佳诊断组合。使用ROC特征曲线和AUC分析来确定miRNA联合检测的准确度，以cutoff值对样本结果进行判读。

本发明的有益效果：

(1)本发明对现有检测方法进行了优化改进，开发出基于PCR平台miRNA的两步法检测试剂盒，可根据检测的目的及实验条件的需求选择相应的检测和分析方法。由于miRNA自身的实效性及与肺癌肿瘤的相关性，本试剂盒既可用于早期肺部结节良恶性鉴别，也可用于预后、对术前术后、治疗、疗效等起到实时监控作用。其中两步法检测体系包含独立自主设计的特异性的茎环结构RT引物、PCR上下游引物及Taqman探针引物，特异性引物使得miRNA检测特异性可区分单个碱基差异，灵敏度最低可达到1copy/μL的检测下限，大大提高了miRNA的检测效率和精确度，此外，不同标志物PCR热循环条件一样，不仅可同批次同板检测多种标志物，提高了联合标志物检测的准确性和检测效率，也降低时间、成本。

(2)采用血清外泌体exo-miRNA作为标志物联合检测，比血浆外泌体-miRNA或血清-miRNA、血浆-miRNA直接检测效果更好。exo-miRNA具有很好的稳定性，血清在4℃存放20天仍可有效提取exo-miRNA，提取的exo-miRNA可-20℃冻存50天，-80℃长期保存。

附图说明

图1 miRNA两步法PCR检测扩增原理图；

图2 miRNA标志物PCR标准曲线及检测灵敏度(A：Let-7a的PCR最低检测下限；B：Let-7a的PCR标准曲线；C：miR-21的PCR最低检测下限；D：miR-21的PCR标准曲线；E：miR-486-5p的PCR最低检测下限；F：miR-486-5p的PCR标准曲线；G：miR-205的PCR最低检测下限；H：miR-205的PCR标准曲线；I：miR-126的PCR最低检测下限；J：miR-126的PCR标准曲线；K：miR-152的PCR最低检测下限；L：miR-152的PCR标准曲线；M：miR-148a的PCR最低检测下限；N：miR-148a的PCR标准曲线)。

图3两步法miRNA检测体系对临床样本检测稳定性结果(A：批内差异CV值；B：批间差异CV值)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、基于PCR平台miRNA的两步法检测体系试剂盒

1)本实施例使用仪器如下：

4℃低温离心机(Thermo Fisher Fresco17)、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)、超净工作台(SW-CJ-1D，龙扬科学仪器)、常规PCR仪(A100，杭州朗基科学仪器有限公司)。

2)RNA逆转录反应体系：

试剂：用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录引物(RT-Primer，上海英潍捷基合成)，miRNA标准品粉末(上海英潍捷基合成)、T4 DNA连接酶(T4 DNALigase，供应商：NEB，商品号：M0202S，包含10×T4 DNALigase Buffer)、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor，供应商：Fermentas，商品号：K1622)、转录酶Transcriptase(供应商：上海英潍捷基生物技术有限公司，商品号：K1622，包含RNase inhibitor、dNTPs、nuclease-free water)、T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，供应商：NEB，商品号：M0201S)和无核酸酶纯水(nuclease-free water，供应商：上海英潍捷基生物有限公司，商品号：K1622)。用于配制逆转录反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例制成逆转录体系，逆转录反应体系为20μL/次，分装的体积是50次的用量，如表1所示。

表1通用逆转录反应体系组分表

组分	终浓度	体积/μL
			逆转录RT-Primer	5μmol/L	5
T4 DNALigaseBuffer	10×	2
			dNTPs(含dUTP)	1mmol/L	2
RNase inhibitor	20UμL<sup>-1</sup>	1
			Transcriptase	200UμL<sup>-1</sup>	1
T4 DNALigase	10UμL<sup>-1</sup>	0.5
			T4 Polynucleotide Kinase	2.5UμL<sup>-1</sup>	0.25
模板		5
			nuclease-free water		加水至20μL

按表2条件进行逆转录。

表2通用RNA逆转录条件

cDNA 10倍稀释后4℃保存用于后续PCR扩增。

3)PCR反应体系：

试剂：用于配制PCR反应体系的试剂包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs(dCTP、dGTP、dATP、dTTP、dUTP(供应商：Thermo Scientific)配制成dNTPs。上游引物液(F primer，上海英潍捷基合成)、通用下游引物液(R primer，上海英潍捷基合成)、探针(Probe，ABI合成)、DNA聚合酶(HS Taq，供应商：Takara公司，商品号：R007A)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG，供应商：NEB，商品号：M0280S)和纯水(H₂O)。

用于配制PCR反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定比例配制成PCR反应体系，PCR反应体系为20μL/次，分装的体积是50次的用量，如表3所示。

表3优化后的PCR反应体系

然后按表4条件进行扩增反应。

表4 PCR热循环条件

4)miRNA两步法分子标志物标准品配置：

标准品miRNA经逆转录后cDNA原液为10¹²copy/μL，取10μL cDNA原液加入90μL灭菌纯化水稀释到10¹¹copy/μL，再取10μL 10¹¹copy/μL稀释液加入90μL灭菌纯化水稀释到10¹⁰copy/μL，依次逐级稀释到1copy/μL的稀释液。

5)miRNA两步法检测体系灵敏度：

采用上述基于PCR平台miRNA的两步法检测体系试剂盒，检测miR-152、Let-7a、miR-148a、miR-21、miR-486-5p、miR-205或miR-126的标准品，得出检测下限及扩增效率。检测原理如图1所示。

以miR-21为例，miR-21两步法分子标志物标准品配置：

标准品miR-21经逆转录后cDNA原液为10¹²copy/μL，取10μL cDNA原液加入90μL灭菌纯化水稀释到10¹¹copy/μL，再取10μL 10¹¹copy/μL稀释液加入90μL灭菌纯化水稀释到10¹⁰copy/μL，依次逐级稀释到1copy/μL的稀释液。

其他miRNA分子标志物两步法检测体系构建及标准品配置参考miR-21，仅模板、引物、及探针不同，PCR反应条件相同。

两步法检测体系miRNA标准品检测结果，如表5所示。

表5 miRNA标准品检测结果

6)两步法miRNA检测体系对临床样本检测稳定性评价

肺癌临床样本血清Exo-miR-21联合miRNA下调标志物Exo-Let-7a对检测结果稳定性进行评价。4例不同临床血清样本，每例样本分3个批次检测，每个批次3个重复，验证检测评价体系(包括Exo-miRNA提取纯化、逆转录、PCR上机检测)稳定性。结果如图3所示，同一样本批内差异CV值可达到4％以内，批间差异CV值可达到8％以内，说明miRNA两步法检测评价体系具有良好的稳定性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司

<120> 一种检测外泌体相关microRNA分子的方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcatca acat 44

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctccgtcagg gtagcttatc agactg 26

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcaagtgtc gtggagtcgg c 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttcctcatc atcaacat 18

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcactc gggg 44

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctccgtcagg gtcctgtact gagctg 26

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttcctcatc actcgggg 18

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcacag actc 44

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctccgtcagg gtccttcatt ccaccg 26

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttcctcatc acagactc 18

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcacgc atta 44

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctccgtcagg gtcgtaccgt gagtaa 26

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttcctcatc acgcatta 18

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcaact atac 44

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctccgtcagg gtgaggtagt aggtt 25

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tttcctcatc aactatac 18

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcaagt cggag 45

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctccgtcagg gaggttctgt gataca 26

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttcctcatc aagtcggag 19

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctccgtcagg gaaagttctg agaca 25

<210> 22

<211> 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttcctcatc aagtcggag 19

Claims

1.一种用于非疾病诊断目的检测外泌体相关microRNA分子的方法，其特征在于：所述方法为两步法检测，将microRNA分子逆转录为cDNA，通过PCR反应将cDNA扩增为DNA，所述逆转录的反应体系包括microRNA分子特异性茎环结构逆转录引物，逆转录反应时通过连接酶将短臂与microRNA分子相连接。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特异性茎环结构逆转录引物的颈部的loop环部设计非连续互补碱基对TGCG和CGCA构成钥匙状结构。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR反应的反应体系包括PCR上游引物、PCR通用下游引物和用于检测microRNA分子的特异探针。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述microRNA分子为miR-21、miR-486-5p、miR-205、miR-126、miR-152、Let-7a或miR-148a。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR-21的逆转录引物序列如SEQ IDNO.1所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.2所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR-486-5p的逆转录引物序列如SEQID NO.5所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.6所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR-205的逆转录引物序列如SEQ IDNO.8所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.9所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.10。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR-126的逆转录引物序列如SEQ IDNO.11所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.12所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.13。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述let-7a的逆转录引物序列如SEQ IDNO.14所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.15所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.16。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR-152的逆转录引物序列如SEQ IDNO.17所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.18所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.19。

11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR-148a的逆转录引物序列如SEQID NO.20所示，PCR上游引物如SEQ ID NO.21所示，PCR通用下游引物如SEQ ID NO.3所示，特异探针核苷酸序列如SEQ ID NO.22。

12.利用权利要求1～11任一项所述的方法所制备的试剂盒。