CN103088128B - 一种microRNA的二次循环扩增检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供miRNAs的二次方循环扩增检测方法及诊断试剂盒，本发明检测方法只需要一步操作就可以完成二次循环扩增反应，高灵敏度，可以检测到15ul反应体系中的9条RNA链。设计简单，不需要涉及纳米材料的合成和修饰等。噪声很低，从而也增加了灵敏度，特异性和通用性。与传统的Northern印迹分析，微点阵分析方法相比，所需要的样品量很少，特异性很好。与实时定量PCR相比，该方法是恒温反应，使得实验在普通的荧光仪上就可以实现，扩大了方法的使用范围，而且序列的设计简便。该方法可以检测出单个乳腺癌细胞水平的miRNA。本我们可以利用此技术设计肿瘤诊断试剂盒和设备。
Description
技术领域
本发明设计一种利用单分子水平二次循环扩增技术来实现快速，一步法检测microRNAs(miRNAs)及其试剂盒。
背景技术
MiRNAs是一类长约18-22个核苷酸的高度保守的内源性非编码RNAs大家族，广泛存在于真核生物中。由于miRNAs可以通过碱基互补和目标信使RNA结合，导致其降解并且抑制蛋白质的合成从而调控转录后基因表达水平。miRNAs具有非常广泛的基因调控表达的功能，在生物体的生长，早期发育，细胞分化，细胞凋亡中扮演着重要的角色，在正常组织和肿瘤组织中的表达显著不同，参与了肿瘤的发生，发展。
Northernblot和基因芯片是目前为止最广泛应用的miRNAs检测手段，但是由于miRNAs序列不仅短而且相似度较高，再加上在生物体中含量比较低导致以上两种方法的灵敏度和特异性都不是很理想。最近一些扩增的方法已经应用于miRNAs检测，例如invaderassay，ribozymeamplification，荧光定量PCR，以及基于纳米粒子的扩增方法等，其中荧光定量PCR由于灵敏度高，可应用性强受到越来越多的关注。然而他的实现需要精确的温度循环控制，这严重的限制了他的进一步推广，再加上由于miRNAs的序列非常短，使得PCR的设计变得非常复杂。最近一些课题组提出利用切刻内切酶或核酸外切酶实现核酸的恒温扩增反应，但是他们或者是对被检测核酸的序列有一定的要求或者灵敏度不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法，并将其应用于乳腺癌细胞miRNA检测。本发明方法不需要昂贵的仪器，不需要复杂的实验操作，灵敏度高，而且还可完成对肿瘤的诊断，实际应用性很强。
本发明的另一个目的是提供一种miRNA荧光检测试剂盒。
实现本发明的具体方法是：
本发明提供的这种miRNAs的二次方循环扩增检测方法，包括以下步骤：
步骤一：37℃条件下的标准曲线：取5-8个1.5ml的离心管，分别加入分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI，另外设计5-8个浓度梯度(10fM-100nM)的miRNA样品分别加入到以上离心管中37℃恒温孵育2h；所述的分子信标探针的核苷酸序列为：
其5′端的两个碱基有硫代标记，3′端标记有淬灭基团DABCYL，另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG(下划线)；靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM；
所述的8个碱基的引物的核苷酸序列为：其5′端的两个碱基也是硫代标记；
步骤二：荧光仪上进行检测，即可得到不同浓度的miRNA样品对应的荧光强度，荧光仪的设置参数如下：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500～600nm，根据荧光强度和miRNA样品浓度可得37℃条件下的检测标准曲线；
步骤三：改变步骤一中的反应条件为4℃恒温孵育50h，其它条件不变，可得4℃条件下的检测标准曲线；
步骤四：对于乳腺癌细胞的检测，首先利用mirVanaTM试剂盒提取出细胞中的miRNA，作为待检测的样品，利用步骤一中的条件可以得到乳腺癌细胞的检测标准曲线；
步骤五：将分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI、以及待测样品加入到1.5ml的EP离心管中恒温孵育2h，在荧光仪上进行检测，荧光仪的参数设置与步骤二中荧光仪的参数设置相同，得到的荧光强度和检测标准曲线相对应即可得到样品中含有的miRNA的浓度。
上述方法的反应体积为50μL，各反应成份的浓度为：
分子信标探针：500nM；
引物：2μM；
dNTPs：400μM；
Bst聚合酶：16U；
Nb.BbvCI切刻内切酶：15U；
lambda核酸外切酶：12.5U。
对于一个未知样品可以先在37℃恒温下反应2h，若得到的信号和本底相同，则可能有两种情况，一是样品中不含miRNA或者是其含量在10fM以下，这时可以改反应条件为4℃下反应50h；如果样品的浓度是在10aM以上的可以被检测出。
本发明提供的miRNA荧光检测试剂盒，包括：分子信标探针，所述的分子信标探针的核苷酸序列为：
其5′端的两个碱基有硫代标记，3′端标记有淬灭基团DABCYL，另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG(下划线)；靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM；
8个碱基引物，所述的8个碱基引物的核苷酸序列为：其5′端的两个碱基也是硫代标记；
miRNA
Bst聚合酶；
Nb.BbvCI切刻内切酶；
Lambda核酸外切酶；
NEBbuffer3；
dNTPs；DEPC水，BSA，RRI；
Bst聚合酶。
其中Nb.BbvCI切刻内切酶；Lambda核酸外切酶；NEBbuffer3可以从NEB公司购买到；dNTPs，DEPC水，BSA，RRI可以从大连宝生物公司购买到。
该miRNA荧光检测试剂盒还可以包括使用说明书，说明书的内容如下：
取5-8个离心管，分别加入试剂盒提供的终浓度为500nM分子信标探针，2μM8个碱基引物，400μMdNTPs，16UBst聚合酶，15UNb.BbvCI切刻内切酶，12.5Ulambda核酸外切酶，BSA，RRI，另外设计5-8个浓度梯度(10fM-100nM)的miRNA样品分别加入到同一个离心管中37℃恒温孵育2h后，在荧光仪上检测。荧光仪的参数设置为：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500-600nm。根据荧光强度和miRNA浓度做37℃条件下的检测标准曲线。如要检测到更低浓度的miRNA样品(10aM-10fM)，则需要改变反应条件，即需要4℃恒温孵育50h，可得到荧光强度和浓度的4℃条件下的检测标准曲线。对于未知样品的检测，则需要先在37℃恒温孵育2h，如得不到荧光数据时，则需要采用低温检测的方案，即4℃恒温孵育50h。通过和检测标准曲线的比对即可得到相对应的样品浓度。
本发明提供了一种基于分子信标(molecularbeacon)的二次循环酶扩增(hairpin-mediatedquadraticenzymaticamplification，HQEA)新技术及其试剂盒，实现了快速，高灵敏度一步法检测microRNAs(miRNAs)。反应中包含两个循环。第一个循环是miRNA首先和我们设计的标记有荧光基团和淬灭基团的分子信标探针的环结构(loop)结合，将荧光基团释放出来，产生荧光信号。然后在Bst聚合酶存在下发生链置换扩增反应，释放出靶miRNA，并且合成新的双链分子信标探针，这样靶miRNA可以参与到下一个反应中引发第一个循环反应。Nb.BbvCI切刻酶可以识别第一个循环生成的新的双链分子信标探针，并将其硫代标记的5′端剪掉。失去5′端硫代保护基团的双链分子信标探针可被lambda核酸外切酶识别并消化掉，从而将在第一个循环中合成的和单链分子信标探针互补的DNA链释放出来。被释放出来的DNA互补链又可以和新的分子信标探针结合，释放荧光探针，这就是第二轮循环。通过这两个循环我们可以实现超灵敏度二次循环扩增检测miRNAs。更重要的是，利用HQEA技术，我们可以检测出单个乳腺癌细胞水平的miRNA。本发明在生物检测以及肿瘤诊断中具有重要的意义。我们可以利用此技术设计肿瘤诊断试剂盒和设备。
本发明为一步扩增法：将500nM分子信标探针，2μM引物，400μMdNTPs，16UBst聚合酶，15UNb.BbvCI切刻内切酶，12.5U核酸外切酶，BSA，RRI，待测样品等加入到1.5ml的EP离心管中恒温孵育，即可在普通的荧光仪上进行检测，通过所得荧光强度和检测标准曲线的对应即可得知检测样品中的miRNA的含量。本发明设计了一种三修饰，即硫代修饰，荧光修饰和淬灭基团修饰的特异性识别被检测miRNA的分子信标探针，其核酸序列组成如下：
本发明还提供了一种用于等温链置换扩增反应的5′端硫代标记的8碱基引物，它的序列如下：当分子信标探针和miRNA结合时，5′端硫代标记的8碱基引物可以结合到探针的茎结构上，在聚合酶存在的情况下发生链置换扩增反应。利用Bst聚合酶，lambda核酸外切酶，Nb.BbvCI切刻内切酶，本发明提供了一种二次方循环扩增的超灵敏度扩增技术。本发明还提供了一种最适反应体系，保障各种酶反应的顺利进行。
下表是本发明用到的寡核苷酸序列
其中黑色加粗斜体的是硫代修饰的碱基。均购于大连宝生物公司。
以下是参与反应的各种物质的浓度，总体积是50ul：
分子信标探针：500nM；引物：2μM；dNTPs：400μM
Bst聚合酶：16U；Nb.BbvCI切刻内切酶：15U；lambda核酸外切酶：12.5U；50mM含1mMDTT，5mMMgCl2的Tris-HCl(pH8.0)；BSA；RRI。
另外除了上述发明内容外，以下也是我们需要保护的范围：1.具有二级结构(包括分子信标，aptamer等)的核酸循环探针(包括DNA，RNA，PNA和LNA)进行循环靶标检测时受此专利保护；2.靶标包括DNA，RNA，PNA，LNA，蛋白质，小分子，多肽，和离子作为循环检测物时受此专利保护；3.扩展酶(包括TheBstDNApolymerase，LargeFragment，lambdaexonuclease，Nb.BbvCInickingendonuclease等其他的扩展酶)作为循环检测物时受此专利保护；4.硫代DNA，RNA，PNA和LNA作为循环探针进行检测时受次专利保护；5.一级循环，二级循环，多级循环，二次方循环和多次方循环进行检测受此专利保护。
本发明的基本原理为：首先miRNA可以和我们设计的标记有荧光基团和淬灭基团的分子信标探针的环结构(loop)结合，将荧光基团释放出来，产生荧光信号。然后引物(primer)和打开的的分子信标的茎(stem)结合，在Bst聚合酶存在下发生链置换扩增反应，结果是合成出来新的双链DNA，被游离下来的miRNA可以激发下一个循环，这也是我们二次方扩增反应的第一步循环。而第二个循环是由生成的双链分子信标探针开始的，生成的新的双链分子信标探针含有切刻酶的切割位点。在切刻酶存在的条件下，单链分子信标探针的5′端会被剪掉，从而失去硫代保护基团。然后lambda核酸外切酶从5′端到3′端按次序将单链分子信标探针被消化掉，从而将在第一个循环中合成的和单链分子信标探针互补的链释放出来，被释放出来的互补链又可以和新的分子信标探针结合，释放荧光探针，形成第二个循环。荧光仪上进行检测，即可得到不同浓度的miRNA样品对应的荧光强度。荧光仪的设置参数如下：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500-600nm。根据荧光强度和浓度做标准曲线。通过对比检测标准曲线和检测样品的荧光强度可得到样品的浓度。
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：1.一步法，只需要一步操作就可以完成二次循环扩增反应；2.高灵敏度，双循环的设计，可以检测到15ul反应体系中的9条RNA链。设计简单，不需要涉及纳米材料的合成和修饰等。另外分子信标探针的设计，使得本研究的噪声很低，从而也增加了灵敏度，特异性和通用性。3.和传统的Northern印迹分析，微点阵(microarray)分析方法相比，需要的样品量很少，特异性很好。4.和实时定量PCR(quantitativeReal-TimePCR)相比，本技术是恒温反应，使得我们的实验在普通的荧光仪上就可以实现，扩大了方法的使用范围，而且序列的设计简便。
附图说明
图1是本方法检测miRNA的原理图。图1给出了检测miRNA技术的详细原理。从图一可知，本技术包括两步循环，当只有Bst聚合酶的情况下是线性扩增的反应，当Bst聚合酶，Nb.BbvCI切刻内切酶(nickingenzyme)和lambda核酸外切酶存在时候是二次方循环扩增的反应。
图2是本方法37℃miR-21的检测标准曲线。图2给出了37℃时候，本方法的对合成miRNA的检测灵敏度标准曲线。可以看到本发明在37℃时候可以检测到10fM的miR-21.
图3是本方法4℃miR-21的检测标准曲线。图3给出了在4℃检测标准曲线，灵敏度是1aM的miR-21，对应15ul反应体系中含有9条miRNA链。
图4是本方法检测乳腺癌细胞的检测标准曲线。图4是对乳腺癌细胞的检测，从图中可以看到可以检测到单细胞的水平。
具体实施方式
实施例1以miR-21为待测物，来进一步说明本发明。
本实施例所用到的酶和缓冲液有：NEBbuffer2，Bst大片段DNA聚合酶，lambda核酸外切酶，Nb.BbvCI切刻内切酶等均购于NEB公司；分子信标探针，BSA，8个碱基的引物，miRNAs，DEPC水，dNTP，RNase抑制剂等均购于大连宝生物。
荧光检测所用仪器为荧光分光光度计(HitachiF-4500，日本)。荧光光谱测量条件：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500-600nm；用250μL石英比色皿进行测量。
具体检测方法是：
步骤一：37℃条件下的检测标准曲线：取5-8个1.5ml的离心管，分别加入终浓度为500nM分子信标探针，2μM8个碱基引物，400μMdNTPs，16UBst聚合酶，15UNb.BbvCI切刻内切酶，12.5Ulambda核酸外切酶，BSA，RRI。另外设计5-8个浓度梯度(10fM-100nM)的miRNA样品分别加入到以上离心管中37℃恒温孵育2h。在荧光仪上进行检测。并得到荧光强度和miRNA浓度的37℃条件下的检测标准曲线(见图2)。
步骤二：对于样品中miRNA含量较低的(在10fM以下的)，即利用步骤一不能被检测出的，则需要4℃恒温孵育50h，得到荧光强度和miRNA浓度的4℃条件下的检测标准曲线。(见图3)。仪器设置参数不变。
步骤三：对于实验方法的验证。我们取了三个已知浓度的待检测样品：Control(即不含有miRNA的样品)，含500aMmiRNA的样品，含500pMmiRNA的样品。当首先用步骤一检测时得到的荧光强度值分别为：90，90和182。通过与标准曲线对比得知，500pM的miRNA样品的荧光值落在37℃条件下的检测标准曲线上。接下来我们又将Control和500aMmiRNA的样品在4℃条件下反应50h。得到的荧光值分别为40和72。它们也都落在了4℃条件下的检测标准曲线上。另外以上结果和传统的RT-PCR得到的结果也是一致的。这些结果说明了我们方法的可应用性以及准确性。
实施例2以乳腺癌细胞的提取物为待测物，来进一步说明本发明。
步骤一：对于乳腺癌细胞的检测。首先利用mirVanaTM试剂盒提取出miRNA，作为待检测的样品。
步骤二：将待检测样品和终浓度为500nM分子信标探针，2μM8个碱基引物，400μMdNTPs，16UBst聚合酶，15UNb.BbvCI切刻内切酶，12.5Ulambda核酸外切酶，BSA，RRI加入到1.5ml的EP离心管中。利用荧光仪进行检测。即可得到细胞数和荧光强度的乳腺癌细胞检测标准曲线。(见图4)。仪器设置参数不变。
步骤三：我们对1000个乳腺癌细胞的提取结果进行了验证。利用以上步骤，我们最后得到的荧光值是135，通过和乳腺癌细胞的检测标准曲线对比，发现135刚好落在乳腺癌细胞检测的标准曲线上。另外以上结果和传统的RT-PCR得到的结果也是一致的。说明我们的方法是可以应用于乳腺癌细胞提取物检测的。
Claims (4)
1.一种miR-21的二次方循环扩增检测方法，包括以下步骤：
步骤一：37℃条件下的标准曲线：取8个1.5ml的离心管，按顺序分别加入500nM的分子信标探针、2μM的8个碱基的引物、400μMdNTPs、16UBst聚合酶、15UNb.BbvCI切刻内切酶、12.5Ulambda核酸外切酶、BSA、RRI；另外设计浓度梯度为10fM-100nM的8个miR-21样品分别加入到以上离心管中，加DEPC水，使得每管的总体积为50μl，37℃恒温孵育2h；
步骤二：荧光仪上进行检测，即可得到不同浓度的miR-21样品对应的荧光强度，荧光仪的设置参数如下：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500-600nm，根据荧光强度和miR-21样品浓度得37℃条件下的荧光信号强度-miR-21浓度的检测标准曲线；
步骤三：4℃条件下的标准曲线：取8个1.5ml的离心管，按顺序分别加入500nM的分子信标探针、2μM的8个碱基的引物、400μMdNTPs、16UBst聚合酶、15UNb.BbvCI切刻内切酶、12.5Ulambda核酸外切酶、BSA、RRI，另外设计浓度梯度为10fM-100nM的8个miR-21样品分别加入到以上离心管中，加DEPC水，使得每管的总体积为50μl，4℃恒温孵育50h，荧光仪的参数不变，进行荧光信号检测，可得4℃条件下的荧光信号强度-miR-21浓度的检测标准曲线；
步骤四：按顺序分别加入500nM的分子信标探针、2μM的8个碱基的引物、400μMdNTPs、16UBst聚合酶、15UNb.BbvCI切刻内切酶、12.5Ulambda核酸外切酶、BSA、RRI，加DEPC水，以及待测样品加入到1.5ml的EP离心管中,加入DEPC水使得每管的总体积为50μl，恒温孵育2h，在荧光仪上进行检测，荧光仪的设置参数如下：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500-600nm，得到的荧光强度和检测标准曲线相对应即可得到样品中含有的miRNA的浓度；
所述的分子信标探针5′端的两个碱基有硫代标记，3′端标记有淬灭基团DABCYL，另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG；靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM；
所述的8个碱基的引物5′端的两个碱基也是硫代标记
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的反应成份的浓度要求如下，反应体积为50μL；分子信标探针：500nM；8个碱基引物2μM；dNTPs：400μM；Bst聚合酶：16U；Nb.BbvCI切刻内切酶：15U；Lambda核酸外切酶：12.5U；BSA；RRI。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对于一个未知样品可以先在37℃恒温下反应2h，若得到的信号和本底相同，则可能有两种情况，一是样品中不含miR-21或者是其含量在10fM以下，这时可以改反应条件为4℃下反应50h，如果样品的浓度是在10aM以上的可以被检测出。
4.一种miR-21荧光检测试剂盒，包括分子信标探针、8个碱基引物、miRNA，所述的分子信标探针的核苷酸序列为：
其5′端的两个碱基有硫代标记，3′端标记有淬灭基团DABCYL，另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG；靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM；所述的8个碱基引物的核苷酸序列为：
其5′端的两个碱基也是硫代标记。
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