CN106967794B

CN106967794B - 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN106967794B
Application number: CN201710149371.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋宇扬; 毛瑜; 樊婷婷; 李露露
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2037-03-14
Also published as: CN106967794A

Abstract

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法。所述试剂盒包括：(1)第一发卡结构DNA探针，能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；(2)第二发卡结构DNA探针，能够与miRNA竞争结合第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，第二发卡结构DNA探针与第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；(3)环状DNA探针，其中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到G四联体扩增产物。利用本发明的试剂盒和方法对miRNAs进行测定，操作简便，成本低，灵敏度高，特异性好。

Description

双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地，涉及一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是存在于真核细胞中的一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18-24nt。miRNAs通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，在翻译水平上特异性抑制或沉默基因的表达，因此miRNAs广泛参与了生物体多种生理过程，如个体发育、细胞增殖、分化和凋亡、代谢与应激反应的调节，甚至疾病的发生，包括肿瘤形成。miRNAs还参与了肿瘤细胞重要的生物程序调控，间接地起着促癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生和发展中起了至关重要的作用，因此miRNAs被视为肿瘤早期诊断、预后和治疗的重要潜在生物标记物和靶标。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式的扩增机制发展起来的一种信号放大的检测方法。RCA是一种等温信号扩增方法，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数滚环扩增，可用于极微量生物标记物的检测。

硫黄素T(Thioflavin T，ThT)是一种商业化的水溶性苯并噻唑荧光染料，以前常用于淀粉体的检测，近些年有研究发现，ThT可专一性的与DNA/RNA的G-四联体结合并显著增强其荧光强度，而不能与DNA/RNA的其它结构(三联体、二联体和单链)结合，因此可以显著降低检测背景。

miRNAs具有短序列、高同源、低含量和极易降解的特性，因此在生物医学研究和早期临床诊断方面急需高效，特异的miRNAs检测方法。

传统的miRNAs的检测方法主要有Northern blot，微阵列和实时定量PCR(real-time PCR)，这些检测方法不仅需要使用大型昂贵的仪器设备，操作繁琐，而且灵敏度低，特异差，因此很难普及。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的上述缺陷，提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好和成本低的双向信号扩增特异性检测循环microRNA的方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒，该试剂盒包括：

(1)第一发卡结构DNA探针，所述第一发卡结构DNA探针能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；

(2)第二发卡结构DNA探针，所述第二发卡结构DNA能够与miRNA竞争结合所述第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，所述第二发卡结构DNA探针与所述第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；

(3)环状DNA探针，所述环状DNA探针中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，所述环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到含有多G重复序列的G四联体扩增产物。

优选地，所述试剂盒还包括：(4)ThT荧光染料。

根据本发明，所示粘性末端的长度优选为10-20nt。

所述ThT荧光染料(Thioflavin T)的结构如式I所示。其合成方法已为本领域技术人员公知。也可商购获得。

为便于检测，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针优选共同以检测溶液1的形式提供。

其中，所述检测溶液1中，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针的浓度可根据需要确定，通常均为0.1μM-10μM。

所述检测溶液1可以为Tris-HCl缓冲液，也可以根据需要调整为其他缓冲溶液。

优选地，所述试剂盒还包括滚环扩增所需试剂。所述滚环扩增所需试剂为本领域技术人员公知，包括但不限于滚环扩增DNA聚合酶、滚环扩增反应液、dNTPs。

为便于检测，优选地，所述环状DNA探针与所述滚环扩增所需试剂共同以检测溶液2的形式提供。

所述检测溶液2中，所述环状DNA探针的浓度可以根据需要确定，优选为10nM-1000nM。

本发明的试剂盒用于miRNA检测基于以下原理，如图1所示：

检测体系包含两步反应，当待检测物靶标(target)存在的时候，target首先会与第一发卡结构DNA探针(HP1)结合并将其展开，展开后的HP1会继续与第二发卡结构DNA探针(HP2)结合，将HP2展开的同时也会释放target进入第一步反应的循环。由于形成的HP1和HP2复合体中有一段粘性末端与环状DNA探针互补，因此在DNA聚合酶和dNTPs的作用下会进行滚环扩增(HP-RCA)，产物是含有大量多G重复序列(与环状DNA完全互补)的G四联体。最后将ThT荧光染料加入该扩增体系中，通过荧光信号的强弱对比来判断miRNA含量的高低。在没有待检测物miR-21的时候，HP1将不会被打开，因此后续两步反应将无法进行，检测信号极弱。

根据本发明的上述原理，本领域技术人员可以根据特定的待测miRNA，设计相应的第一发卡结构DNA探针、第二发卡结构DNA探针和环状DNA探针的核苷酸序列。

本发明提供一种优选实施方式，针对miRNA21(SEQ ID NO：4)进行检测，以证明本发明。但是本领域技术人员可以确认，本发明的检测并不限于miR-21。

5’-UAGCU UAUCA GACUG AUGUU GA-3’(SEQ ID NO：4)

具体地，针对所述miRNA为miR-21的情况；所述第一发卡结构DNA探针(HP1)具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列；所述第二发卡结构DNA探针(HP2)具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列；所述环状DNA探针(CT)具有SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACGATGTGTAGATAGCTTATCAGACT-3’(SEQ ID NO：1)

5’-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGAGGT-3’(SEQ ID NO：2)

5’-TACACAATCTCGACTAGTCAGACCCTAACCCTAACCCTAACCCTACAACATGTCTTTGATACCTC-3’(SEQ ID NO：3)

其中，HP1和HP2中下划线的碱基分别表示互补的序列，它们将分别形成发卡探针的互补区(茎区)。HP1中加粗的碱基(5’端起第1-22位)表示靶标miR-21的互补区。HP2中加粗的碱基(5’端起第1-32位)表示HP1的互补区。CT中加粗的碱基(5’端起第1-6位和第61-65位)表示HP2的互补区，下划线的互补序列将形成G-四联体，即结合和激活ThT的互补区。

本发明还提供利用上述试剂盒检测miRNA的方法，该方法包括以下步骤：

(1)向待测体系中加入第一发卡结构DNA探针和第二发卡结构DNA探针，并孵育；

(2)加入环状DNA探针并进行滚环扩增；

(3)加入ThT荧光染料进行检测，所述ThT荧光染料加入的时机为：加入环状DNA探针的同时，或滚环扩增完成以后。

所述孵育以miRNA充分与第一发卡结构DNA探针结合并被第二发卡结构DNA探针充分竞争结合为目的，条件包括：25-40℃，1-5小时；例如37℃孵育2h。

所述滚环扩增的条件为本领域技术人员公知。

所述检测的方法可以为酶标仪检测。

具体地，本发明检测miRNA的试剂盒和方法如下：

试剂盒组成：

a)检测溶液1：20mM Tris-HCl缓冲液(100mM NaCl,5mM MgCl₂,pH 7.4)，其中含发卡结构的DNA探针HP1和HP2，浓度均为0.1μM-10μM。

b)检测溶液2：RCA反应液，其中含DNA环状探针10nM-1000nM，Phi29 DNA聚合酶，dNTPs：0.5mM。

c)ThT荧光染料。

检测方法如下：

1)将含有miRNA的溶液与检测溶液1充分混匀后37℃孵育2小时。

2)将检测溶液2和ThT加入到上述反应液中，37℃孵育40分钟，用酶标仪读取荧光信号。

利用本发明的试剂盒和方法对miRNAs进行测定，不需要任何化学修饰，没有复杂的反应过程，也不需要昂贵的仪器，miRNAs在该检测体系中可循环使用，操作简便，成本低，灵敏度高，特异性好。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1示出了本发明miRNA检测的原理。

图2示出了根据本发明一种实施方式的第一步反应的20％非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图3示出了根据本发明一种实施方式的第二步反应的琼脂糖凝胶电泳结果。

图4A和图4B示出了不同浓度miR-21存在时的荧光光谱和荧光强度。图4A中曲线所代表的浓度自下而上依次为：0、0.1nM、0.2nM、0.4nM、0.6nM、0.8nM、1nM、1.5nM、2nM、2.5nM。

图5分别示出了miR-21及miR-21的5种突变型(1个、2个、3个、4个和5个碱基错配)相对于对照(不含miR-21)的荧光强度。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。

试剂盒组成：

a)检测溶液1：20mM Tris-HCl缓冲液(100mM NaCl,5mM MgCl₂,pH 7.4)，其中含发卡结构的DNA探针HP1和HP2，浓度均为1μM。

b)检测溶液2：RCA反应液，其中含DNA环状探针100nM，Phi29 DNA聚合酶，dNTPs：0.5mM。

c)ThT荧光染料。

检测方法如下：

1)将含有miRNA的溶液与检测溶液1充分混匀后在37℃孵育2小时。

测试例1

检测不同条件下步骤1)的反应结果。

如图2所示，当反应液中只含有miR-21(1)、HP1(2)、HP2(3)、miR-21+HP2(5)、HP1+HP2(6)的时候不能启动第一步的反应，当反应液中含有miR-21+HP1(4)的时候只能启动第一步的部分反应,只有当miR-21+HP1+HP2(7)的时候才能完全启动第一步的反应。这些实验结果与图1所示检测原理相符，有力的证明了本发明方法的可行性。

测试例2

检测不同条件下步骤2)的反应结果。

如图3所示，当该反应体系中无靶标miR-21的时候，该体系不能进行HP-RCA反应(左边)，当该反应体系含靶标miR-21的时候才能进行HP-RCA反应(右边)，这一现象与该体系的检测原理相符，又进一步证明了该技术方案的可行性。

测试例3

测试不同浓度miR-21存在时的荧光光谱和荧光强度。

如图4A所示，随着miR-21浓度的升高(0.1nM-1.5nM)，相应的荧光强度逐渐增大。miR-21的浓度在0.1nM-1nM的荧光强度可以做出标准校准曲线图4B，该线性回归方程为FL强度(λex 485nm)＝88.382[C_miR21]+41.031(线性相关系数R＝0.9942)，通过计算得出该方法对miR-21的检测限为10pM，说明本发明方法的灵敏度极高。

测试例4

测试miR-21及miR-21的5种突变型(1个、2个、3个、4个和5个碱基错配)相对于对照(不含miR-21)的荧光强度。

突变序列如下，其中，下划线的碱基表示miR-21的突变位点。

突变miR-21-1(M1)：

5’-UAGCUUAUCAGACCGAUGUUGA-3’(SEQ ID NO：5)

突变miR-21-2(M2)：

5’-UAGCAUAUCAGACCGAUGUUGA-3’(SEQ ID NO：6)

突变miR-21-3(M3)：

5’-UAGCAAAUCAGACCGAUGUUGA-3’(SEQ ID NO：7)

突变miR-21-4(M4)：

5’-AAGCAAAUCAGACCGAUGUUGA-3’(SEQ ID NO：8)

突变miR-21-5(M5)：

5’-AAGCAAAUCAGACCGAUGUCGA-3’(SEQ ID NO：9)

如图5所示，M1、M2、M3、M4和M5的相对荧光强度分别是miR-21相对荧光强度的10.2％、0.5％、-0.5％、-2％和-4.4％。这一实验证明了本发明方法的特异性极高。

测试例5

在含有10％的正常人血清条件下比较本发明和标准的miRNAs检测方法(荧光实时定量PCR，qRT-PCR)，3次平行实验。结果如表1所示。

表1

^bd三次独立的实验测得的值

^c平均复原率(％)＝100×(C_{平均计算值}/C_{实际加入值})

如表1所示，相比于标准miRNAs检测方法(qRT-PCR)而言，当该检测体系中含有10％的正常人血清时并不影响其检测结果，这一现象表明该技术方案可以在复杂的生物样本(血清)中进行miRNAs的检测，具有非常好的应用前景和实用价值。并且，根据实际加入值与平均计算值的比对可见，本发明的检测方法更准确。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳研究生院

<120> 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法

<130> ILC170133QHDX

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcaacatcag tctgataagc tacgatgtgt agatagctta tcagact 47

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taagctatct acacatggta gcttatcaga ctccatgtgt agaggt 46

<210> 3

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacacaatct cgactagtca gaccctaacc ctaaccctaa ccctacaaca tgtctttgat 60

acctc 65

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uagcuuauca gaccgauguu ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

uagcauauca gaccgauguu ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uagcaaauca gaccgauguu ga 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagcaaauca gaccgauguu ga 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagcaaauca gaccgauguc ga 22

Claims

1.一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

(3)环状DNA探针，所述环状DNA探针中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，所述环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到含有多G重复序列的G四联体扩增产物；

(4)ThT荧光染料；

其中，所述miRNA为miR-21；所述第一发卡结构DNA探针具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；所述第二发卡结构DNA探针具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列；所述环状DNA探针具有如SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针共同以检测溶液1的形式提供。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述检测溶液1中，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针的浓度均为0.1μM-10μM。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括滚环扩增所需试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述环状DNA探针与所述滚环扩增所需试剂共同以检测溶液2的形式提供。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述检测溶液2中，所述环状DNA探针的浓度为10nM-1000nM。