CN111378725B - 数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒 - Google Patents

数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核酸检测领域，特别涉及数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。本发明提供的检测方法利用目标miRNA的整个序列信息，结合液滴微流控技术，构建了数字miRNA检测平台，具有较高的特异性和识别单碱基错配的能力。该平台能够在单分子水平上定量2‑20fM浓度范围内的miRNA，证明了该方法的有效性和实用性。首次实现了高选择性直接数字miRNA检测。

Description

数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，特别涉及数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。
背景技术
MicroRNA(miRNA)检测在疾病诊断和miRNA功能研究中具有重要意义。miRNA本身的重要性在于它在各种生命过程中发挥的复杂调节功能及其与某些疾病的密切关系。
miRNA是短的单链非编码RNA，长度范围为18-25nt，存在于真核细胞中。它们是由发夹样前体产生的，这些前体与RNA诱导的沉默复合物(RISC)中相应的靶mRNA碱基配对。由于碱基配对与其靶标完全或不完全互补，miRNA引起mRNA的降解或者抑制其翻译。miRNA表达水平在不同组织和器官中有所不同，并且受到精确调节；因此，它们的表达的功能障碍是有害的。由于miRNA短且高度同源，因此检测它们具有挑战性。
用于检测miRNA的传统方法包括RT-PCR，RNA印迹，微阵列等；但是，这些方法中的每一种都有其各自的局限性。由于miRNA在体内的低丰度，某些靶向RNA的选择性扩增是必需的，数字化检测十分必要。值得注意的是，miRNA通常是短的，高度同源的，它们之间仅有微小的差异，这些特性使得常用的PCR扩增技术不准确且效率低下，同时PCR法复制miRNA需要加尾引物，难以应用于数字检测且特异性不高，检测的成本也比较高；RNA印迹法很复杂，需要进行放射性标记，而且会引起严重污染，检测效率低，检测限不够理想，难以应用于实际样本的痕量miRNA检测；微阵列具有良好的检测限，但所需的设备和材料成本高，因此限制了该方法的使用；许多新型生物传感器也被开发出来用于miRNA的检测，原理包括表面增强拉曼散射、电化学、表面等离共振、比色法、电化学发光、石英晶体微天平等，然而这些基于核酸杂交的方法在检测限或检测成本方法均存在不足，由于这些限制，开发更有效和低成本的检测方法是有意义和重要的。
miRNA是化学生物学研究领域的重要目标，传统的检测方法不能满足当前的需求，所以需要开发具有更高的灵敏度和特异性，更简单，成本更低的新方法。作为一类短链和低丰度RNA靶标，miRNA检测将始终具有靶标再循环和/或信号放大的要求；这些因素在miRNA检测方法的设计中起着决定性作用。已经针对这些目的设计了各种酶促扩增和基于切割的反应。
分子信标(Molecularbeacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。一般有三部分组成：①环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；②茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；③荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。没有靶分子的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。与靶分子结合后，由于酶切作用，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复。因为分子信标技术具有极高的特异性和灵敏度，所以在临床诊断、基因检测、环境监测、活细胞成像、基因芯片与生物传感等方面得到了广泛应用。最近几年，为了提高检测目标分子的灵敏度，循环扩增技术在分子信标中的应用成为了研究热点，并广泛地应用于了各类目标分子的检测中去。
数字化检测方法能够实现单分子级别的检测，检测限达到了理论上的极限，自问世以来便受到研究人员的推崇。因此开发一种较简便的miRNA循环反应策略，结合液滴微流控技术实现数字化miRNA检测具有必要性和重要意义。
综上，利用分子信标开发核酸数字化检测的新方法，具有广泛的应用前景和重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。本发明提供了一种基于分子信标、靶标分子酶循环法和液滴微流控的数字化miRNA检测方法，具有更高的灵敏度和特异性，更简单，成本更低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了数字化miRNA检测的方法，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测每个微液滴的荧光强度；
所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；
所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；
同时与所述分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。
具体的，基于分子信标、靶标miRNA、DNA聚合酶的循环反应策略，结合液滴微流控技术进行直接数字化miRNA的检测，以荧光强度为测量参数对miRNA进行定量；其中，分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，在反应中回收利用。
在本发明的一些具体实施方案中，基于液滴微流控技术，所述液滴微流控技术包括油相、第一水相和第二水相；所述第一水相通入靶标miRNA；所述第二水相通入引物、克列诺片段、游离的核苷酸和分子信标。
具体的，所述液滴微流控技术，在第一水相中通入少量靶标miRNA，第二水相中通入足量的分子信标、引物和克列诺片段等循环反应物，通过流动聚焦生成的微液滴中含有足量的循环反应物和少量或者没有靶标miRNA，对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，实现直接数字化检测。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第二水相还通入缓冲液以及可接受的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述分子信标的序列如SEQ ID No.1所示；所述靶标miRNA的序列如SEQ ID No.2所示；所述引物的序列如SEQ ID No.3所示。
在上述研究的基础上，本发明还提供了数字化miRNA检测的试剂，包括荧光基团修饰的分子信标、引物、克列诺片段、游离的核苷酸；
所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；
所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；
同时与分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。
在本发明的一些具体实施方案中，所述数字化miRNA检测的试剂还包括缓冲液、荧光染料以及检测可接受的助剂中的一种或多种。
本发明还提供了数字化miRNA检测的试剂盒，包括所述的试剂以及检测可接受的装置。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测可接受的装置包括微流控芯片。
本发明还提供了所述的试剂或所述的试剂盒在数字化miRNA检测中的应用。
本发明提供的检测方法利用目标miRNA的整个序列信息，结合液滴微流控技术，构建了数字miRNA检测平台，具有较高的特异性和识别单碱基错配的能力。该平台能够在单分子水平上定量2-20fM浓度范围内的miRNA，证明了该方法的有效性和实用性。首次实现了高选择性直接数字miRNA检测。
本发明提供的循环法的原理，使用了miRNA的全部碱基信息，具有优良的特异性，能够识别单碱基错配和序列相近的同源miRNA分子，结合液滴微流控技术，搭建了数字化miRNA检测平台，通过对照实验论证了基于靶标循环法的数字化miRNA检测技术的可行性。所以只要所用的序列可以对应就可以应用这种方法。该平台将来可用于实际生物样本(如病人血清、癌细胞裂解产物)中肿瘤标志miRNA分子的绝对定量检测，探索miRNA表达含量与肿瘤等疾病间的关系，为疾病诊断和分子生物学研究提供一种新的思路和方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示分子信标探针结构示意图；
图2示循环反应示意图；
其中各标号为：1-荧光基团，2-淬灭集团，3-分子信标茎干区，4-分子信标环状区，5-靶标miRNA，6-引物，7-克列诺片段；
图3示不同浓度的靶标miRNA检测结果；
图4示微流控芯片中的反应示意图；
图5示检测限。
具体实施方式
本发明公开了可用于液滴微流控中进行数字化miRNA的检测，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为开发具有更高的灵敏度和特异性，更简单，成本更低的新方法，本发明提供了一种基于分子信标、靶标分子酶循环法和液滴微流控的数字化miRNA检测技术。
一种基于分子信标、靶标分子酶循环法和液滴微流控的数字化miRNA检测技术，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含不定数量的目标miRNA，孵育实现循环反应后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
一种基于分子信标、靶标分子酶循环法和液滴微流控的数字化miRNA检测技术，所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，因而能够通过杂交配对形成茎环结构，分子信标模型的3’端修饰荧光基团(FAM)1，5’端修饰黑洞淬灭基团(BHQ-1)2，BHQ-1能够通过荧光共振能量转移效应(FRET)淬灭FAM的荧光。
一种基于分子信标、靶标分子酶循环法和液滴微流控的数字化miRNA检测技术，所述靶标miRNA与分子信标的环状区域4和部分茎干区3的序列能够完全互补配对，靶标miRNA5和分子信标上与其对应的靶序列杂交，由于酶切作用，分子信标的空间构型发生改变，由发夹结构变为直线型，荧光基团1和淬灭基团2分离，FAM的荧光恢复。
所述分子信标被靶标分子撑开后，同时暴露出能够与引物互补配对的单链区域，在引物6和克列诺片段7的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，最终以分子信标为模板链补齐DNA双链分子，靶标miRNA5被挤脱下来重新变成游离状态。
所述引物连接在分子信标被靶标分子撑开后暴露的单链区域后，引物与靶标分子均连接在分子信标直线状态的单链模板上，因此在体系中没有靶标miRNA的情况下，引物不能单独打开分子信标的发夹结构。此外，在同时与分子信标杂交后，引物和靶标分子之间留有2个左右的碱基间隔以便于初始化链置换反应。
游离状态的靶标miRNA可重复以上过程，实现循环检测，过程如图2所示，提高了检测限和灵敏度，荧光的强度与液滴中靶标miRNA的量成正比。可以根据荧光信号检测出体系存在的双链DNA数量，本发明中即可通过荧光强度反映出溶液中靶标miRNA的数量。
所述的分子信标探针结构：FAM-ATTACAGGCCGGGACAAGTGCAATAGGCCTGTAATGG-BHQ1(如SEQ ID No.1所示)。
所述的靶标miRNA结构：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(如SEQ ID No.2所示)。
所述的引物结构：CCATTACAGG(如SEQ ID No.3所示)。
本发明所述技术的最终检测原理为DNA probe被靶标miRNA撑开，在引物与克列诺片段(聚合酶)作用下补齐双链，靶标分子实现循环反应，同时FAM远离淬灭分子BHQ，荧光恢复，最终的检测限接近1条单链miRNA分子在80-100微米直径液滴内的实际摩尔浓度6.19-3.17fM。
本发明设计的检测技术的优点是：该检测方法利用目标miRNA的整个序列信息，结合液滴微流控技术，构建了数字miRNA检测平台，具有较高的特异性和识别单碱基错配的能力。该平台能够在单分子水平上定量2-20fM浓度范围内的miRNA，证明了该方法的有效性和实用性。首次实现了高选择性直接数字miRNA检测。
通过调节生成液滴时通入的miRNA浓度在0～20fM之间，生成多组液滴。每组液滴经过重注射、荧光检测、阳性液滴计数，得到阳性液滴的比例p。根据泊松分布理论，由阳性液滴所占的比例p与平均每个液滴内的miRNA数目推算出的miRNA的浓度和实际浓度之间的关系拟合曲线得到的结论。
本发明提供的数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本发明所述发卡状分子信标探针，需要加超纯水后加热至95摄氏度彻底解链成线性单链，然后缓慢退火至55度或者室温，确保形成发卡状结构。
首先进行液滴外的检测。取50pmol分子信标(共10μl)，50pmol引物(10μl)，80μl反应溶液，10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM DTT，10units Klenow fragment,5nmol dNTP，将上述溶液混合(共100μl)，与10μl的不同miRNA溶液混合反应，在37度下反应2-4h，检测FAM的发射荧光，进行三组实验，结果如下所示。实验涉及到的所有核酸分子均使用超纯水溶解，配置成10mM浓度的溶液。
表1给出了所有的核酸序列。其中对照RNA分子与分子信标序列杂交时含有1个错配碱基，错配碱基使用红色标记。
第一组实验中对所述探针进行特异性检测，结果见表2。第二组实验中采用不同浓度的靶标miRNA进行对比实验，在液滴外进行检测。检测结果如表3所示。
表1miRNA结构
Figure BDA0002445785900000071
表2特异性检测结果
荧光强度(a.u) 误差
Target 2701 77
ControlRNA1 492 31
Random 418 17
表2表明，只有靶标分子miRNA能够增大反应体系中的FAM荧光，即使只有一个错配碱基的miRNA也不能识别，结果接近空白对照，因此本发明所述探针具有很高的特异性，能识别单个碱基的错配。
图3、表3为不同浓度的靶标miRNA的峰值荧光强度检测，表示FAM的发射荧光强度与靶标miRNA的浓度成正比。
表3
靶标miRNA浓度(nM) 峰值荧光强度(a.u) 误差线
0 601 38
0.74 624 28
1.48 718 42
3.7 929 49
7.4 1152 52
14.8 2311 84
37 3466 69
148.1 3860 115
370 5122 124
740.1 5798 141
实施例3
取20mM的Tris缓冲液(pH 7.4,包含100mM NaCl,5mM KCl和5mM MgCl2)，加入不同浓度的靶标miRNA(如SEQ ID No.2所示)，miRNA的最终浓度在2至20fM范围之间。
利用软光刻的方法加工得到基于PDMS和玻璃基底的微流控芯片。该芯片含有3个输入通道，其中1个通道使用微注射泵通入油相，其余2个通道通入水相。油相使用Novec7500，并加入表面活性剂pico-surf(2％w/w)，表面活性剂能够使得生成的液滴保持稳定，不容易裂解或者互相融合。其中1个水相通道通入上述miRNA溶液，同时设置不含miRNA的空白对照组；另1个水相通道通入Tris缓冲液，该缓冲液包含10mM Tris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mM DTT,5Units的克列诺片段(Klenow fragments)，1nmol的dNTPs,100nM的发卡型DNA荧光探针(分子信标，如SEQ ID No.1所示(如SEQ ID No.3所示)，100nM的引物。
分子信标由于其特殊的结构，在实验前将该分子信标使用不含有核酸酶的超纯水溶解后，加热至95度完全解链形成单链，再缓慢降温退火至室温，以确保形成DNA发卡结构。
微流控芯片在使用前通入Aquapel作疏水处理，便于形成油包水液滴。在液滴形成时，油相的通入速度设置为500μL/h，两个水相的通入速度在10-100μL/h之间。最终目的是通过调节油相、水相的流速，形成直径100微米左右的液滴，作为数字化检测的微反应池。假定2个水相在形成液滴时对液滴内水溶液的体积贡献相同，且miRNA分布均匀，则miRNA分散在每个液滴内的数目符合泊松分布。当miRNA的原始浓度为2-20fM，则单个液滴内miRNA的平均浓度为1-10fM范围内，相应的泊松分布期望参数在0.236-2.365范围内。通过调节初始的miRNA的浓度，控制泊松分布的参数，可以实现数字化miRNA检测。将产生的液滴收集起来，加入矿物油封，减少液滴的蒸发。将收集后的液滴立刻放入37摄氏度水浴2-4h，反应充分进行。
水浴反应后，将反应后的液滴重新注入微流控芯片中，使得液滴依次通过细长流道，通过激光器激发荧光信号，使用PMT对每个液滴内的荧光信号检测记录。通过分析噪声信号的强度，确定阈值信号，计数超过阈值信号的液滴个数，实现数字化检测。可以将数字化检测的结果与RT-PCR的结果进行对比。
表4检测限
MiRNAconcentration Fluorescenceintensity 误差线
fM a.u.
0 139 11
5 166 10
10 179 14
15 217 12
20 221 16
25 244 17
利用此方法对本发明进行循环法miRNA检测实验，在低浓度下的浓度梯度曲线如图5所示，结果显示此方法对miRNA的检测限降低至了7.5fM。该检测限已经十分接近单链miRNA在液滴内的真实摩尔浓度(3-6fM)，具有数字化miRNA检测的潜力。
实施例4
实验条件及方法同实施例1。
表5
Figure BDA0002445785900000101
对比PCR的检测结果，分别为目标miRNA，一个错配碱基的对比RNA和空白对照。可以看出本方法相对PCR特异性高出很多。
实施例5
表6
Figure BDA0002445785900000111
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒
<130> MP1928336
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attacaggcc gggacaagtg caataggcct gtaatgg 37
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uauugcacuu gucccggccu gu 22
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccattacagg 10
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uauugcacuu cucccggccu gu 22

Claims (1)

1.一种非疾病诊断目的的数字化检测miRNA的方法，其特征在于，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔；引物与所述分子信标杂交后，新合成的链逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测荧光强度；
所述分子信标的两端具有能够互补配对的序列，所述分子信标的两端能够通过互补配对形成茎环结构；所述分子信标的两个末端分别被荧光基团和荧光淬灭基团修饰；
所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；
所述数字化检测miRNA的方法在基于液滴微流控技术生成的微液滴中进行，并对各个所述微液滴的反应单元的荧光信号进行统计学分析，实现直接数字化检测；
所述液滴微流控技术包括油相、第一水相和第二水相；所述第一水相通入靶标miRNA；所述第二水相通入引物、克列诺片段、游离的核苷酸、分子信标以及可接受的循环反应物；
所述第二水相还通入缓冲液以及可接受的助剂；
所述分子信标的序列如SEQ ID No.1所示；所述靶标miRNA的序列如SEQ ID No.2所示；所述引物的序列如SEQ ID No.3所示。
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US20130046528A1 (en) * 2011-08-17 2013-02-21 Harry C. Shaw Cryptographic approach to microrna target binding analysis
CN106521019A (zh) * 2017-01-03 2017-03-22 成都仕康美生物科技有限公司 一种基于数字PCR平台的miRNA‑21的检测试剂盒及其应用
CN106967794B (zh) * 2017-03-14 2020-04-14 清华大学深圳研究生院 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法
CN107119124B (zh) * 2017-05-10 2021-05-11 清华大学 一种检测待测样本中目标miRNA的含量的方法
CN110760571A (zh) * 2018-08-27 2020-02-07 浙江达普生物科技有限公司 数字化定量的多靶标共同、生物检测
CN109988821A (zh) * 2019-03-15 2019-07-09 山东师范大学 基于液滴微流控技术的单细胞内miRNA高灵敏多组分同时检测方法和系统
CN113215222B (zh) * 2021-04-25 2023-06-27 上海交通大学 一种免扩增核酸检测方法

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