CN113215222B - 一种免扩增核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种免扩增核酸检测方法,该方法包括以下步骤:1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片;2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品,加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔;3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi,实现对核酸的免扩增单颗粒检测。与现有技术相比,本发明通过对单分子杂交过程的动态检测和数字化分析,极大提高核酸检测的灵敏度,解决了核酸扩增易受气溶胶污染、假阳性高的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器领域,涉及一种基于表面等离子共振显微成像技术的免扩增核酸检测方法。
背景技术
分子诊断技术相较于其他技术具有快速、高灵敏、高特异性等优势,是体外诊断技术最重要的发展和研究方向。核酸检测作为分子诊断技术的一项重要应用发挥着越来越重要的作用,截至2020年12月3日,中国国家药品监督管理局已批准的53个新冠病毒检测试剂中就包含25个核酸检测试剂,可见核酸的单分子检测仍是目前应用最广,实用性最高的技术。如何提高核酸分子检测的速度、灵敏度和特异性,是提高重大疾病诊断能力的重点和难点问题。
目前的核酸检测技术多采用靶标扩增(target-amplification)的策略来实现对待测核酸分子的超灵敏检测。其本质是一种终点检测,即将待测分子与试剂(酶,引物和底物等)充分反应后对扩增后的核酸分子进行信号检测,灵敏度和特异性均受分子结合动力学的限制。如图1所示,Ligand/Target molecule为配体目标分子,Receptor为受体,Non-specific binding为非特异性结合的分子,specific binding为特异性结合的分子,在分子杂交或免疫反应达到平衡状态时,发生结合的分子数取决于可结合位点数、样品浓度以及亲和力,因此当样品浓度降低到一定程度时,发生结合的分子数将不足1个,即使采用最先进的单分子检测技术,也将无法稳定检测到信号。该临界浓度即理论灵敏度极限,通常在100fM量级,同时由于背景噪声的存在无法达到单分子检测,导致在实际应用中的检测限通常在pM或pg/mL级,无法对更低丰度的重要生物分子进行检测。另一方面,虽然通常情况下特异性结合的亲和力要远高于非特异性结合,但在实际检测中,样品中干扰分子的浓度通常远高于待测分子,使得平衡状态下非特异性结合的分子数量变得不可忽略,造成假阳性结果。因此,在核酸检测中,首先需要采用聚合酶链式反应PCR技术进行核酸扩增,将样品浓度提高,通过荧光强度变化检测产物浓度的变化,这通常需要长时间的核酸提取和扩增步骤,如在新冠病毒检测中,核酸检测通常需要数个小时才能得到结果。从原理上来说,PCR技术并没有突破分子结合动力学的限制,也无法解决特异性的问题。最后,基于扩增策略还存在一个不容忽视的问题-气溶胶污染,PCR技术的高扩增效率产生的核酸气溶胶污染,会导致检测结果的假阳性,样本和扩增产物经常出现多批次相同的情况,核酸气溶胶污染在实验区域内不断累积,日积月累从而导致污染风险不断增加,假阳性的发生频率也越来越高。因此,开发一种无扩增的超灵敏的核酸检测装置成了分子诊断领域的一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种突破终点检测极限实现超灵敏检测,无需扩增,大大缩短检测时间且从根本上解决了气溶胶污染的免扩增核酸检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种免扩增核酸检测方法,该方法包括以下步骤:
1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片;
2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品,加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔;
3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi,实现对核酸的免扩增单颗粒检测。
进一步地,所述的免扩增核酸检测传感芯片通过以下方法获得:
a)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3~9nm的铬Cr,再镀27~61nm的金Au,得到30~70nm厚度的镀膜表面;
b)将步骤a)得到的镀有金膜的玻片用食人鱼洗液(体积比为7:3的H2SO4和H2O2混合溶液)冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;
c)将步骤b)得到的芯片与微流控检测腔结合,并对芯片的金片表面进行修饰即得免扩增核酸检测传感芯片。
进一步地,所述的微流控检测腔为带有孔的聚二甲基硅氧烷PDMS板,PDMS板上的预设孔即是反应检测腔室;芯片与微流控检测腔结合是将微流控检测腔固定在芯片的金片表面。
进一步地,对芯片的金片表面进行修饰的方法如下:
i)先在微流控检测腔的腔室加入浓度为10nM~100mM钝化分子,孵育30s~2min以钝化金表面,之后用1xPBS清洗三遍;
ii)加入含有捕获分子的溶液,浓度为10nM~500nM,孵育2~8h;
iii)孵育完成后移去溶液,用稀释20~100倍的PBS溶液清洗三遍,再用钝化分子孵育15~60min以减少非特异吸附;
iv)用PBS清洗三遍以移除多余的化合物,所得芯片储存在4℃冰箱1~3月。
所述的钝化分子为一段巯基修饰或进行了抑制非特异吸附的功能化的分子,如亲水化修饰,代表化合物巯基聚乙二醇(mPEG-SH),浓度在50nM~20mM;又如惰性修饰,代表化合物巯基乙醇(MCH),浓度在100nM~10mM。钝化分子能有效抑制干扰分子和目标分子的非特异吸附,减少检测的假阳性。
所述的捕获分子为长度x取值范围为17~150的ssDNA。表面修饰所用的捕获分子,若为巯基封端的单链DNA,需用10倍于捕获探针摩尔量的三(2-羧乙基)膦TCEP或二硫苏糖醇DTT溶液还原二硫键30min-1h,现配现用。
所述的免扩增核酸检测传感芯片在检测过程中构建了类似ELISA的夹心(sandwich)结构的检测路径,实现单颗粒检测,其中:
下方是修饰在免扩增核酸检测传感芯片金膜表面的捕获分子,为长度x,取值范围为17~150的ssDNA;金膜表面除了捕获分子外还有钝化分子用来抑制非特异性吸附,两者的比例在1:100~1:1000之间;
中间是目标分子,是单链核酸ssDNA、微小核酸microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA、lncRNA)或循环核酸;
上方是跟目标分子特异性结合的核酸作为检测分子,检测分子为ssDNA,其长度为y,取值范围为50~200;检测分子与报告分子紧密结合,通过报告分子实现对信号的放大,以实现对核酸的免扩增检测;
本发明选用纳米颗粒代替荧光分子作为报告分子,其粒径在30~2000nm,材质为二氧化硅(硅球)、金(金球)、银(银颗粒)和聚苯乙烯PS等,纳米颗粒表面连接上检测分子,能有效提高单分子检测的效率。根据碰撞理论,分子间相遇的事件k,受到碰撞事件的频率Z,空间因素ρ和分子的活化能Eact。有公式:
其中,R是气体常数,T是热力学温度。
空间因素ρ受反应介质,空间位阻等影响,而分子的活化能在亲和力确定后只受温度影响。因此,为了提高单分子动态检测的效率,只能通过提高碰撞事件的频率Z,又有公式:
其中,η为介质粘度,ra和rb分别代表两个分子的粒径,不妨设检测分子为ra,目标分子为rb。
可知,纳米颗粒与检测分子连接在一起能有效提高检测分子的粒径,进而提高分子的碰撞事件概率和相遇事件k,意味着能显著提高单分子检测的效率,大大缩短检测时间。本发明所构建无扩增方法可以在10~20min内完成低至fM水平的核酸检测,与PCR技术的检测极限相当。
为了实现单分子动态检测,目标核酸与捕获分子和检测分子的动力学参数需满足一定条件。在本发明中,目标核酸与捕获分子的结合是非常紧密的,分子的结合时间大于1000s,而与检测分子的结合则不牢固,平均结合时间在10s,在热力学平衡时,会出现检测分子反复结合解离到目标核酸的情况。具体来说,捕获分子与目标核酸的互补结合。
进一步地,所述的捕获分子与目标分子核酸的碱基互补链长为15~200nt,结合常数kon≥106M-1s-1,解离常数koff≤0.001s-1;解离平衡常数KD≤1nM;标准情况下的分子结合自由能(standard free energy)≤-27kcal/mol,熔解温度Tm≤47℃;
所述的检测分子与目标分子核酸的碱基互补链长为10~15nt,结合常数kon≥105M-1s-1,解离常数koff≥0.1s-1;解离平衡常数KD≤1μM;标准情况下的分子结合自由能(standard free energy)≥-17kcal/mol,熔解温度Tm≤20℃;
进一步地,检测分子和捕获分子,其动力学参数可以互换。
所述方法用于检测互补链长为8~12bp的目标核酸,检测限依次为44pM、28pM、12.6pM、12fM和1fM。具体步骤为:在修饰有捕获分子的芯片的微流控检测腔中加入40倍稀释的PBS缓冲液,随后加入与纳米颗粒结合的检测分子,静置足够时间后(一般为5~10min)加入与报告分子结合的检测分子,随后加入含有目标分子的待检测样品,用表面等离子共振成像系统记录,之后进行单分子的动态分析,实现免扩增的超灵敏核酸检测。
所述的免扩增核酸检测传感芯片(即SPR传感芯片)适用于多种光学成像系统,如倒置荧光显微镜,全内反射显微镜以及实验室人工搭建的光学平台。芯片的微流控腔室除了传统结构外,还可以设计具有其他功能或复杂流体管道的结构,如前过滤,循环和分选等。
进一步地,用于构建表面等离子成像系统的显微镜是物镜型SPRM、Kretschmann结构的棱镜型SPRM、宽场照明型SPRM,或扫描型SPRM。
进一步地,所述的物镜型SPRM为改进型全内反射显微镜,具有以下特征:
1)物镜是油镜,
2)物镜的数值孔径范围为1.39~1.79;
3)激光光源为p偏振光,光源波长范围为550~780nm;
4)CMOS相机的像素大小范围在30~200nm。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)本发明构建了一种无扩增核酸检测方法,在金属芯片表面修饰互补ssDNA片段,制备金属纳米粒子并在表面包裹另一互补ssDNA片段,将该金属纳米粒子与待测样品加入金属芯片表面的反应腔进行检测。通过表面等离子体共振显微成像系统及数据分析软件实现单分子杂交过程的动态检测,构建样品浓度与单分子杂交事件的定量曲线,实现免扩增超灵敏分析,在灵敏度媲美PCR技术的情况下,所需时间更短,可以在10~20min内完成低至fM水平的核酸检测,与PCR技术的检测极限相当,且从根本上杜绝了气溶胶污染带来的影响。
(2)引入了表面等离子共振成像系统这一分子作用动态分析的利器,能实时地、高通量地监测核酸分子间的相互作用,配合单分子相互作用动力学的筛选,可以实现核酸检测的超特异性。
(3)本发明根据碰撞理论,引入纳米颗粒代替传统的荧光分子作为报告分子,能大幅提高单分子动态检测的效率,直接提高了检测的灵敏度,其检测极限LOD接近PCR技术。
附图说明
图1为目标分子在配体结合检测(ligand-binding assay)中的热力学示意图;
图2A为单分子动态分析方法的示意图;
图2B为用于单分子动态分析技术无扩增核酸检测的夹心结构检测(sandwichassay);
图3为基于表面等离子共振成像SPRi构建单分子动态分析技术无扩增核酸检测的一个实例;
图4A为不同浓度目标核酸与检测分子的互补链长为8bp的单分子结合解离事件Nb+d;
图4B为不同浓度目标核酸与检测分子的互补链长为9bp的单分子结合解离事件Nb+d;
图4C为不同浓度目标核酸与检测分子的互补链长为10bp的单分子结合解离事件Nb+d;
图4D为不同浓度目标核酸与检测分子的互补链长为11bp的单分子结合解离事件Nb+d;
图4E为不同浓度目标核酸与检测分子的互补链长为12bp的单分子结合解离事件Nb+d。
具体实施方式
为了克服扩增检测技术的局限性,本发明提出一种突破上述灵敏度和特异性限制的思路为采用单分子动态分析方法,图2A为单分子动态分析技术如何提高灵敏度的原理图,结合事件记为Nb,解离事件记为Nd,Nb+d为结合事件和解离事件之和,传统的检测方法只关注孵育结束后检测那一刻的结合分子个数(Naive Counts),忽视了分子结合解离本质是一个热力学平衡的过程,而对动态分析所描绘的结合解离事件之和Nb+d能在分子结合解离达到热力学平衡之后继续增长;图2B为用于单分子动态分析技术无扩增核酸检测的夹心结构检测(sandwich assay),从图中可以看出,金膜(Au film)表面修饰上了能跟目标核酸(Target nucleic acid)牢固结合的捕获分子(capture molecule),同时在腔体内存在检测分子(detection molecule)跟金纳米颗粒(GNP)的复合物,其中,检测分子跟目标核酸的结合不紧密,会发生反复的结合解离,金纳米颗粒的作用是代替传统的荧光分子进行信号放大,即作为一个报告分子,这样一个夹心结构能很好地实现单分子动态分析的目的。
对极低含量的待测核酸在无需扩增(amplification-free)的步骤下直接通过配体结合(ligand-binding assay)进行检测,这样在临界浓度下的一段观测时间内,仍然会有分子结合和解离事件的发生,其数量Nb和Nd分别取决于分子结合常数和解离常数,以及待测分子的浓度,因此就可以通过动态监测Nb和Nd突破临界浓度,实现超灵敏检测。另一方面,非特异性结合的结合常数和解离常数与特异性结合间通常有较大差异,即分子结合自由能的差别,这将导致单分子结合特征的差别,如单次结合持续时间,通过检测此信息能有效区别非特异性干扰和特异性结合,实现高特异性的检测。上述无扩增的核酸分子动态分析方法,具有以下两个优点:(1)单分子动态分析突破终点检测极限实现超灵敏检测;(2)无需扩增,大大缩短检测时间且从根本上解决了气溶胶污染。
表面等离子共振成像SPRi技术具有足够的时空分辨率和灵敏度来记录单分子结合动态过程,能得到分子结合自由能分布等重要信息,适合作为单分子动态分析的平台。因此,基于以上思考和对SPRi技术的研究基础,发展高通量SPRi技术,探索对核酸的无扩增检测,利用单分子结合动力学的理论和方法,实现快速、高灵敏和高特异性的分子诊断技术。
具体方法包括以下步骤:
1)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3~9nm的铬Cr,再镀27~61nm的金Au,得到30~70nm厚度的镀膜表面;
2)将镀有金膜的玻片用食人鱼洗液(体积比为7:3的H2SO4和H2O2混合溶液)冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;
3)将2)中所得芯片与微流控检测腔(聚二甲基硅氧烷PDMS板)结合,PDMS板上的预先打出小孔即是反应检测腔室,得到SPR传感芯片;
4)对SPR传感芯片进行表面修饰
i)先在微流控检测腔的腔室加入浓度为10nM~1uM钝化分子,孵育30s~1min以钝化金表面,之后用1xPBS清洗三遍;
ii)加入含有捕获分子的溶液,浓度为10nM~500nM,孵育2~8h;
iii)孵育完成后移去溶液,用稀释20~100倍的PBS溶液清洗三遍,再用钝化分子孵育15~60min以减少非特异吸附;
iv)用PBS清洗三遍以移除多余的化合物,所得芯片储存在4℃冰箱1~3月。
5)在表面修饰后的SPR传感芯片的PDMS检测孔中加入40倍稀释的PBS缓冲液,随后加入与纳米颗粒结合的检测分子,随后加入含有目标检测分子的样品,用表面等离子共振成像系统记录,之后通过软件处理进行单分子的动态分析,实现免扩增的超灵敏核酸检测。
通过上述方法在SPRi上构建了类似于ELISA的夹心(sandwich)结构用于单分子动态分析,如图3所示,Target nucleic acid(目标检测分子)、capture molecule(捕获分子)和detection molecule检测分子)三者构成类似于ELISA的夹心(sandwich)结构。金片表面同时修饰了巯基封端的聚乙二醇以减少非特异性吸附。
上述方法用于检测互补链长为8~12bp的目标核酸,检测限依次为44pM、28pM、12.6pM、12fM和1fM,如图4所示为不同亲和力的待测核酸的浓度-计数曲线;图4A-E目标核酸与检测分子的碱基互补链长分别为8~12base pair(bp)时,动态分析计数随着待测物浓度的变化曲线。
图4A、B说明利用单分子动态分析技术,能实现对弱亲和力(8、9bp)的分子对优于终点检测的测量,体现了单分子动态分析在分子检测领域的重要价值。从图C、D和E可见,随着bp的增大,检测限LOD也在不断降低,意味着检测效果的提升,可见亲和力的强弱影响目标核酸的检测结果。最后,图D、E在目标分子浓度达到1nM时,Nb+d计数发生明显上升,这是由于分子的扩散速度是受浓度和解离平衡常数(即亲和力KD)影响的参数,11bp和12bp在浓度足够大的时候突破了单分子水平下的扩散限制。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
下面各实施例采用原材料均为本领域常用的原材料,如捕获分子选用上海生工公司合成的巯基封端的单链DNA。
钝化分子选用市售巯基聚乙二醇(如可选用Aladdin公司生产的型号M109713),或市售巯基乙醇(如可选Aladdin公司生产的M274256型号)
采用的微流控检测腔为现有文献中公开报道的微流控检测腔。
实施例1:
目标核酸与检测分子的碱基互补链长为12base pair(以下检测12bp)的目标核酸的无扩增检测方法如下:
(1)使用基于商业全内反射显微镜(Olympus IX-81)改建的SPRM作为检测仪器,选用放大倍数100倍,数值孔径N.A=1.49的油镜,光源为超宽带光源SLED,光源控制电流的强度在140mA,观察视野为512×512pixels(full field of view:33.28×33.28μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRi的成像信号。Olympus显微镜自带Cell lens软件用以控制光路的入射角度。
(2)在镀有3nm铬,47nm金的BK-7玻片上,先用食人鱼洗液冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT,flexiPERM)固定在金片表面。其后,用0.5uM的TCEP溶液还原捕获分子内二硫键1h,紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1uM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面,用1xPBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获分子(与目标核酸的互补长度为25bp)的溶液,孵育2h。孵育完成后移去溶液,用1xPBS溶液清洗三遍,再用1uM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附;最后1xPBS清洗后得到检测芯片。
(3)用盐老化法制备核酸包被的金纳米颗粒。将1012NPs/mL的金纳米颗粒与1uM的巯基功能化检测分子在50mM的氯化钠Nacl溶液环境内共孵育,期间每隔4h提高50mM浓度,直至氯化钠浓度达到300mM后,维持盐浓度不变在室温摇床孵育24h,最后离心重悬收集包被检测核酸分子的金纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于SPRi观测位置,改变入射光角度,随着SPR效应发生,CCD相机收集到的光强急剧下降,光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。先往检测腔室内加入10uL,1xPBS缓冲液,然后加入10uL,颗粒浓度为1010NPs/mL,粒径为50nm金颗粒,颗粒表面已通过盐老化法连接上巯基功能化的12bp检测分子。
(5)完成实验的准备工作后,加入含有目标核酸的样品溶液1uL,以100FPS的帧率采集记录SPRi数据。之后对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同,可以区分两者进行分析。最后对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果,实现核酸的无扩增超灵敏检测。12bp的检测分子的检测限为1fM。
实施例2:
目标核酸与检测分子的碱基互补链长为11bp的目标核酸的无扩增检测方法如下:
(1)使用基于商业全内反射显微镜(Olympus IX-81)改建的SPRM作为检测仪器,选用放大倍数60倍,数值孔径N.A=1.49的油镜,光源为超宽带光源SLED,光源控制电流的强度在150mA,观察视野为512×512pixels(full field of view:51.2×51.2μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRi的成像信号。Cell lens软件用以控制光路的入射角度。
(2)在镀有2nm铬,47nm金的BK-7玻片上,先用酒精和纯水冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;之后把微流控管道固定在金片表面。其后,用0.5uM的DTT溶液还原捕获分子内二硫键0.5h,紧接着在微流控管道与金片构成的检测腔室内加入浓度为1uM巯基乙醇的孵育30s以钝化金表面,用1xPBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获分子(与目标核酸的互补长度为25bp)的溶液,孵育2h。孵育完成后移去溶液,用稀释40倍的PBS溶液清洗三遍,再用1uM巯基乙醇孵育30min减少非特异吸附;最后用40倍稀释PBS清洗后得到检测芯片。
(3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidin system,BAS)制备核酸包被的金纳米颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒与1uM的生物素功能化检测分子在共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测核酸分子的金纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于SPRi观测位置,改变入射光角度,随着SPR效应发生,CCD相机收集到的光强急剧下降,光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。先往检测腔室内加入10uL,40倍稀释的PBS缓冲液,然后加入10uL,颗粒浓度为1010NPs/mL,粒径为50nm金颗粒,颗粒表面已连接上11bp检测分子。
(5)完成实验的准备工作后,加入还有目标核酸的样品溶液1uL,以100FPS的帧率采集记录SPRi数据。之后对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同,可以区分两者进行分析。最后对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果,实现核酸的无扩增超灵敏检测。11bp的检测分子的检测限为12fM。
实施例3:
目标核酸与检测分子的碱基互补链长为10bp的目标核酸的无扩增检测方法如下,此实例将检测分子固定在芯片表面,捕获分子与纳米颗粒结合:
(1)使用基于商业全内反射显微镜(Olympus IX-81)改建的SPRM作为检测仪器,选用放大倍数60倍,数值孔径N.A=1.49的油镜,光源为超宽带光源SLED,光源控制电流的强度在169mA,观察视野为512×512pixels(full field of view:51.2×51.2μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRi的成像信号。Cell lens软件用以控制光路的入射角度。
(2)在镀有2nm铬,47nm金的BAK-4玻片上,先用酒精和纯水冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT,flexiPERM)固定在金片表面。其后,用0.5uM的TCEP溶液还原捕获分子内二硫键1h,紧接着在培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度为1uM巯基乙醇的孵育30s以钝化金表面,用1xPBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的检测分子(与目标核酸的互补长度为10bp)的溶液,孵育2h。孵育完成后移去溶液,用1xPBS溶液清洗三遍,再用1uM巯基乙醇孵育30min减少非特异吸附;最后用1xPBS清洗后得到检测芯片。
(3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidin system,BAS)制备核酸包被的硅纳米颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的硅纳米颗粒与1uM的生物素功能化检测分子在共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测核酸分子的硅纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于SPRi观测位置,改变入射光角度,随着SPR效应发生,CCD相机收集到的光强急剧下降,光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。先往检测腔室内加入10uL,1xPBS缓冲液,然后加入10uL,颗粒浓度为1010NPs/mL,粒径为100nm硅颗粒,颗粒表面已连接上功能化的25bp捕获分子。
(5)完成实验的准备工作后,加入还有目标核酸的样品溶液1uL,以100FPS的帧率采集记录SPRi数据。之后对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同,可以区分两者进行分析。最后对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果,实现核酸的无扩增超灵敏检测。10bp的检测分子的检测限为12.6pM。
实施例4:
目标核酸与检测分子的碱基互补链长为9bp的目标核酸的无扩增检测方法如下:
(1)使用实验室自搭建的棱镜型SPRi光学系统作为检测仪器,选用放大倍数40倍,数值孔径N.A=1.49的油镜,光源为p偏振的平行光源,光源控制电流的强度在100mA,观察视野为1024×1024pixels(full field of view:153.6×153.6μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRi的成像信号。Cell lens软件用以控制光路的入射角度。
(2)在镀有3nm铬,47nm金的BK-7玻片上,先用酒精和纯水冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;之后把自制的微流控管道固定在金片表面。其后,用0.5uM的DTT溶液还原捕获分子内二硫键0.5h,紧接着在微流控管道与金片构成的检测腔室内加入浓度为1uM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面,用1xPBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获分子(与目标核酸的互补长度为20bp)的溶液,孵育2h。孵育完成后移去溶液,1xPBS溶液清洗三遍,再用1uM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附;1xPBS清洗后得到检测芯片。
(3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidin system,BAS)制备核酸包被的聚苯乙烯PS颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的PS颗粒与1uM的生物素功能化检测分子在共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测核酸分子的聚苯乙烯颗粒。
(4)将检测芯片置于SPRi观测位置,改变入射光角度,随着SPR效应发生,CCD相机收集到的光强急剧下降,光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。先往检测腔室内加入10uL,1xPBS缓冲液,然后加入10uL,颗粒浓度为1010NPs/mL,粒径为200nm的PS颗粒,颗粒表面已连接上9bp检测分子。
(5)完成实验的准备工作后,加入还有目标核酸的样品溶液1uL,以100FPS的帧率采集记录SPRi数据。之后对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同,可以区分两者进行分析。最后对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果,实现核酸的无扩增超灵敏检测。9bp的检测分子的检测限为28pM。
实施例5:
目标核酸与检测分子的碱基互补链长为8bp的目标核酸的无扩增检测方法如下:
(1)使用实验室自搭建的棱镜型SPRi光学系统作为检测仪器,选用放大倍数40倍,数值孔径N.A=1.49的油镜,光源为p偏振的平行光源,光源控制电流的强度在100mA,观察视野为2048×2048pixels(full field of view:409.6×409.6μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRi的成像信号。Cell lens软件用以控制光路的入射角度。
(2)在镀有3nm铬,47nm金的BK-7玻片上,先用酒精和纯水冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT,flexiPERM)固定在金片表面。其后,用0.5uM的DTT溶液还原捕获分子内二硫键0.5h,紧接着在培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度为1uM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面,用1xPBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获分子(与目标核酸的互补长度为20bp)的溶液,孵育2h。孵育完成后移去溶液,1xPBS溶液清洗三遍,再用1uM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附;1xPBS清洗后得到检测芯片。
(3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidin system,BAS)制备核酸包被的聚苯乙烯PS颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的PS颗粒与1uM的生物素功能化检测分子在共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测核酸分子的聚苯乙烯颗粒。
(4)将检测芯片置于SPRi观测位置,改变入射光角度,随着SPR效应发生,CCD相机收集到的光强急剧下降,光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。先往检测腔室内加入10uL,1xPBS缓冲液,然后加入10uL,颗粒浓度为1010NPs/mL,粒径为200nm的PS颗粒,颗粒表面已连接上8bp检测分子。
(5)完成实验的准备工作后,加入还有目标核酸的样品溶液1uL,以100FPS的帧率采集记录SPRi数据。之后对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同,可以区分两者进行分析。最后对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果,实现核酸的无扩增超灵敏检测。8bp的检测分子的检测限为44pM。
采用上述各实施例进行免扩增核酸检测性能数据如下表所示:-
从上表可以看出,本发明通过金颗粒作为报告分子代替荧光分子,在SPRi系统上构建了可用于单分子动态分析的检测平台,该平台能突破传统终点检测的理论限制,实现超灵敏检测,此方法受检测分子与目标核酸的亲和力大小影响,实施例1和2由于分子对亲和力较高,虽然检测性能更好,检测限更低,检测时间更短,灵敏度更高,但是相应的适用范围也变小了。对于实施例3、4和5,亲和力较低的分子对检测限只能达到pM水平,灵敏度较差,但是可以延长单分子动态分析技术的检测时间,用时间换灵敏度,另一方面,检测浓度的适用范围也更大。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种免扩增核酸检测方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片;
2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品,加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔;
3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi,实现对核酸的免扩增单颗粒检测;
所述方法为非疾病的诊断方法;
所述的免扩增核酸检测传感芯片通过以下方法获得:
a)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3~9nm的铬Cr,再镀27~61nm的金Au,得到30~70nm厚度的镀膜表面;
b)将步骤a)得到的镀有金膜的玻片用食人鱼洗液冲洗吹干,接着用氢焰处理,除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度;
c)将步骤b)得到的芯片与微流控检测腔结合,并对芯片的金片表面进行修饰即得免扩增核酸检测传感芯片;
所述的微流控检测腔为带有孔的聚二甲基硅氧烷PDMS板,PDMS板上的预设孔即是反应检测腔室;
芯片与微流控检测腔结合是将微流控检测腔固定在芯片的金片表面;
对芯片的金片表面进行修饰的方法如下:
i)先在微流控检测腔的腔室加入浓度为10nM~1uM钝化分子,孵育30s~2min钝化金表面,之后用1xPBS清洗;
ii)加入含有捕获分子的溶液,浓度为10nM~500nM,孵育2~8h;
iii)孵育完成后移去溶液,用稀释20~100倍的PBS溶液清洗,再用钝化分子孵育15~60min以减少非特异吸附;
iv)用PBS清洗以移除多余的化合物,所得芯片储存在4℃冰箱;
所述的钝化分子为一段巯基修饰或进行了抑制非特异吸附的功能化的分子,包括巯基聚乙二醇(mPEG-SH)、或巯基乙醇(MCH);
所述的捕获分子为长度x取值范围为17~150的ssDNA;
所述的免扩增核酸检测传感芯片在检测过程中构建了夹心(sandwich)结构实现单颗粒检测,其中:
下方是修饰在免扩增核酸检测传感芯片金膜表面的捕获分子,为长度x,取值范围为17~150的ssDNA;金膜表面除了捕获分子外还有钝化分子用来抑制非特异性吸附,两者的比例在1:100~1:1000之间;
中间是目标分子,是单链核酸ssDNA、微小核酸microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA、lncRNA)或循环核酸;
上方是跟目标分子特异性结合的核酸作为检测分子,检测分子为ssDNA,其长度为y,取值范围为50~200;检测分子与报告分子紧密结合,通过报告分子实现对信号的放大;
报告分子是粒径在30~2000nm的纳米颗粒,材质为二氧化硅、金、银或聚苯乙烯PS;
所述的捕获分子与目标分子核酸的碱基互补链长为15~200nt,结合常数kon≥106M-1s-1,解离常数koff≤0.001s-1;解离平衡常数KD≤1nM;标准情况下的分子结合自由能≤-27kcal/mol,熔解温度Tm≤47℃;
所述的检测分子与目标分子核酸的碱基互补链长为10~15nt,结合常数kon≥105M-1s-1,解离常数koff≥0.1s-1;解离平衡常数KD≤1μM;标准情况下的分子结合自由能≥-17kcal/mol,熔解温度Tm≤20℃。
2.根据权利要求1所述的一种免扩增核酸检测方法,其特征在于,用于构建表面等离子成像系统的显微镜是物镜型SPRM、Kretschmann结构的棱镜型SPRM、宽场照明型SPRM,或扫描型SPRM。
3.根据权利要求2所述的一种免扩增核酸检测方法,其特征在于,所述的物镜型SPRM为改进型全内反射显微镜,具有以下特征:
1)物镜是油镜,
2)物镜的数值孔径范围为1.39~1.79;
3)激光光源为p偏振光,光源波长范围为550~780nm;
4)CMOS相机的像素大小范围在30~200nm。
4.根据权利要求1所述的一种免扩增核酸检测方法,其特征在于,所述的方法中检测的过程具体为:在修饰有捕获分子的芯片的微流控检测腔中加入与报告分子结合的检测分子,静置5~10min加入含有目标分子的待检测样品,用表面等离子共振成像系统记录,之后进行单分子的动态分析,实现免扩增的超灵敏核酸检测。
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