CN114594248A - 一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于外力调控的单分子动态检测方法。所述单分子动态检测方法使用外力调控模块来调节目标分子与检测探针、捕获探针、纳米颗粒之间的结合与解离，并采用单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述目标分子的动态。本发明还公开了一种检测单分子动态的系统及其应用。本发明能实现快速、超灵敏且高通量的单分子免疫检测，检测限可达fM级甚至更低；并解决了探针不具有普适性的问题，装置成本更低，使用门槛更低，通量更大。

Description

一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统
技术领域
本发明属于生物医学检测、处理与分析领域，涉及一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统，用于低丰度蛋白、核酸和生物小分子的检测。
背景技术
体外诊断技术(In vitro diagnosis，IVD)在许多疾病和癌症的早期诊断、预后检测和治疗评估中发挥着重要作用。目前临床中80％以上的疾病诊断都依靠体外诊断技术。传统IVD技术，如酶联免疫吸附(ELISA)的检测限(limit of detection，LoD)在pM水平(10-12M)，这大大限制了IVD技术的运用领域。据报道，人体内仍有大量低丰度蛋白、核酸及生物小分子无法被传统IVD技术检出(J.Am.Chem.Soc.2019,141,1162-1170)。因此开发具有单分子水平(<pM)的超灵敏生物传感器具有重大意义。单分子阵列SiMoA和单分子计数SMC是目前商业化最成功的单分子检测技术，前者是在ELISA原理的基础上，通过纳米孔阵列技术构建超低的反应体系，实现单分子酶促反应荧光信号的数字化检测，其基本原理与数字PCR技术类似(Nature Biotechnology.2010,28,595-599)；而后者则是通过将激光聚焦于艾里斑，提高荧光分子的光子产量来实现单分子的计数测量，相当于一台超灵敏的流式分子检测仪(Anal Chem,1996,68(4)：690-696；Anal Chem,1998,70(3)：431-437)。但是，这些单分子检测技术都存在一定的局限性，导致目前单分子检测技术主要服务于实验室，无法推广到临床IVD中。SiMoA技术的操作流程复杂，微流控芯片加工精度要求高，生产成本高昂，而SMC的检测通量不足，对光学系统和环境稳定性要求严苛，且两项技术的检测时间普遍过久；这是因为目前的单分子检测技术仍然无法突破传统检测的理论极限。在传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)中，检测限依赖于抗体的亲和力以及非特异吸附的抑制处理，同时在终点读出检测(Endpoint readout assay)，这带来了浓度限制(concentration limit)和热动力学限制(thermodynamics limit)两个关键问题，导致其检测灵敏度在pg/mL水平。
动态分析作为一种新型的检测策略，有望突破单分子检测的热动力学限制，实现更灵敏的检测，其原理在于在分子结合的热力学平衡状态下，分子的结合和解离事件仍在持续发生，对过程的持续记录能实现检测信号的放大，最终实现fM水平的检测，优于ELISA技术1000倍。
遗憾的是动态分析尚不具有普适性，这是因为动态分析在免疫检测中需要抗体与抗原能快速结合和解离，利用不断反复的结合解离事件的累计实现信号放大，因此在免疫检测中需要繁琐的流程筛选合适的抗体(弱亲和力，快速结合快速解离)，而商用的抗体试剂往往对目标蛋白的亲和力很高，分子虽能快速结合但解离事件发生缓慢，进而导致动态分析免疫检测的耗时过长。基于泊松平衡的单分子识别技术SiMREPS作为一种动态检测技术，在检测亲和力易于调控的核酸检测中实现了15-30分钟的单分子检测，检测限达到了fM水平(Nature Biotechnology,2015,33,7,730-732)，但该技术在蛋白检测的应用中受限于复杂的抗体筛选的流程以及不合适抗体导致的较长耗时(>2h)。
随着医疗水平的提升，社会对临床诊断有了更高的要求，如对群众的病毒携带检测需尽可能的快，传统PCR难以满足快速检测的需求，目前国内外所售卖的诊断试剂盒也基本依赖于对病毒的蛋白识别，检测总时间在15-30分钟以内。当前的单分子检测技术总的检测时间尚不能达到临床检测应用的最低要求。如SiMoA的单次检测耗时2小时，SMC往往需要4小时以上，动态检测更是存在固有的检测耗时问题。因此开发一种快速超灵敏的单分子检测技术具有极大的研究意义和实践价值。
现有单分子检测技术的缺点在于成本高、通量低、耗时及不具普适性。SiMoA和SMC技术依赖于检测芯片和聚焦成艾里斑的激光光源，其成本较高，不利于临床IVD的运用。其次，SiMoA、SMC和SiMREPS都存在检测耗时的问题，虽然SiMREPS的检测效率可以通过选择合适的亲和力抗体来提升，但复杂的抗体筛选过程导致了该方法不具备普适性。最后，目前所有单分子检测技术都存在检测通量过低的问题，限制了其在临床实践中的推广。
发明内容
如背景所述，单分子检测中目前存在两个关键的科学问题急需解决，分别是浓度限制和热动力学限制。浓度限制是由于单分子检测中待检测分子的浓度都低于pM水平，而待检测分子抵达传感器表面在低浓度下耗时更久(远大于60min，ELISA中为最可能低的检测限一般过夜孵育)。此外就是热动力学限制带来的检测极限，对于终点检测来说，其检测结果为读出某一时刻(经孵育后达到热力学平衡态)结合的目标分子。其检测极限可以定义为临界浓度：在该浓度下无论平衡多久都无法检测到一个待检测分子。浓度限制可以通过微流控芯片技术加速目标分子扩散到传感器表面，如SiMoA，但高精度的芯片加工带来的是检测芯片的成本高昂；热动力学的限制SiMREPS技术已经解决了一部分，其动态(过程)的检测能真正的突破热动力学检测的理论极限，灵敏度比ELISA提高1000倍以上，但是受限于抗体筛选不具有普适性，且SiMREPS并未解决浓度限制带来的孵育时间过久的问题。
本发明所要解决的问题是：突破浓度限制和抗体筛选的瓶颈，开发出快速、超灵敏且高通量的一种基于外力调控的单分子动态检测方法。
本发明的第一方面提供了一种单分子动态检测方法，其使用外力调控模块来调节目标分子与检测探针、捕获探针、纳米颗粒之间的结合与解离，并采用单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述待检测分子的动态；
其中，所述捕获探针的末端与目标分子的头部互补，所述目标分子的末端与检测探针互补；所述捕获探针或检测探针与所述纳米颗粒形成纳米颗粒复合物；当所述纳米颗粒复合物与目标分子结合后，在所述外力调控模块驱动下被牵引到检测探针或捕获探针附近，与所述捕获探针或检测探针特异性结合，再在所述外力调控模块驱动下被提拉离开所述检测探针或捕获探针。
本发明中，捕获探针、纳米颗粒、检测探针和目标分子构成了夹心体系。其中检测探针和捕获探针的位置可以互换，不会对检测结果产生本质影响。例如，当捕获探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物时，检测探针结合至检测芯片上；当检测探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物时，捕获探针结合至检测芯片上。
在一些优选的实施例中，所述外力调控模块包括电场调控、磁力调控和非接触力发生装置。
较佳地，所述电场调控使用双电极、三电极电场发生装置例如电化学工作站，工作电极可选用的材料选自玻碳电极、铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、铅(Pb)、导电玻璃(ITO)和汞(Hg)，所述磁力调控使用电磁铁或永磁体例如镍铬磁铁或磁镊，所述非接触力发生装置包括光镊、声镊、热泳和原子力显微镜AFM；和/或，
所述外力调控模块施加的外力范围在0.01-1000pN例如20-60pN。
此外，本发明中，捕获探针又称捕获分子；检测探针又称检测分子；目标分子又称待检测分子。这些术语分别可以无差别地使用。
在一些优选的实施例中，所述目标分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕获探针和检测探针包括天然或工程化的抗体、核酸和适配体，或与目标分子结合的任意化学物质或代谢产物。
在一些优选的实施例中，所述单分子成像系统包括SPRi、TIRFM、暗场成像和iSCAT；和/或，所述纳米颗粒的粒径为30nm-5μm，材质选自包括但不限于纳米硅、纳米金、纳米银、聚苯乙烯和包被超顺磁颗粒的二氧化硅磁珠。
较佳地，所述SPRi的结构包括物镜耦合型SPRi和棱镜耦合型SPRi，物镜耦合型SPRi优选物镜式SPRM，例如全内反射显微镜改建的物镜式SPRM，棱镜耦合型SPRi例如Kretschmann棱镜耦合结构；和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光光源；和/或，所述纳米颗粒包括纳米金或磁纳米颗粒。本发明的物镜耦合型SPRi的放大倍数通常为60～100倍。
更佳地，所述SPRi的结构为棱镜耦合型SPRi；和/或，所述纳米颗粒的粒径为50nm～300nm，例如50nm、150nm或300nm。本发明的棱镜耦合型SPRi的放大倍数通常为2～60倍，例如2～12、10、40或60倍。
在一些优选的实施例中，所述捕获探针或检测探针吸附于检测芯片上。
较佳地，当所述目标分子为核酸时：所述捕获探针末端的12～25个核苷酸与目标分子一端的核苷酸互补，目标分子另一端的核苷酸与检测探针互补；或，所述捕获探针和检测探针其中之一为锁核酸，另一为生物素功能化的目标分子例如一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA，所述纳米颗粒为链霉亲和素包被的纳米颗粒。本发明中，所述核酸可以为单链核酸，例如单链的DNA，RNA包括mRNA以及miRNA等。当目标分子为双链核酸时，可以通过解旋酶或加热等方法打开双链，使其成为可检测的单链DNA片段。
当所述目标分子为蛋白或多肽或小分子时：所述检测探针为与目标分子结合的抗体，所述捕获探针为与所述目标分子牢固结合的抗体；优选所述检测探针为Fc端修饰了生物素的抗目标分子的抗体，所述捕获探针为Fc端生物素功能化的抗体。其中捕获探针与目标分子的结合常数kon≥1010M-1s-1，解离常数koff≤0.0002s-1，解离平衡常数KD≤0.2fM。检测探针与目标分子的结合常数kon≤5×108M-1s-1，解离常数koff≥0.05s-1；解离平衡常数KD≥1.56pM；标准情况下的分子结合自由能(standard free energy)≥-12kcal/mol。
生物小分子的化学探针的原理与对miRNA等核酸类目标分子并无本质区别，如对别构转录因子(allosteric transcription factor，aTF)的检测，aTF上存在DNA结合结构域和小分子识别结构域，小分子的结合能够使aTF从特定的DNA序列上解离，通过竞争抑制的相互作用实现对生物小分子的检测。
在一些优选的实施例中，(1)所述检测芯片的制备包括以下步骤：
在镀有2-3nm铬、47nm金的玻片上，先除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，再将检测腔室例如PDMS腔室或硅基细胞培养板固定在金片表面并制成工作电极；其后，用还原溶液还原巯基修饰的检测探针或捕获探针、脱盐并除去还原溶液，加入钝化剂钝化金片表面，清洗后加入还原后的检测探针或捕获探针并孵育；最后清洗并加入溶液减少非特异性吸附并清洗，即得所述检测芯片。
上述步骤中，检测芯片只吸附检测探针和捕获探针的其中之一。即，当检测芯片吸附有检测探针时，捕获探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物；当检测芯片吸附有捕获探针时，检测探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物。
(2)所述纳米颗粒复合物的制备包括以下步骤：
用盐老化法制备核酸包被的纳米金颗粒，即，将纳米金颗粒与巯基还原后的捕获探针或检测探针共孵育，离心、重悬即得；优选地，所述共孵育在梯度氯化钠溶液例如50～300mM氯化钠溶液中进行；更优选地，每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到300mM后，维持盐浓度不变孵育24h；或，
用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒例如纳米金颗粒，即，将链霉亲和素包被的金纳米颗粒与生物素功能化检测分子共孵育，离心、重悬即得；所述生物素功能化检测分子例如一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA；优选地，所述共孵育在梯度浓度的氯化钠溶液例如50～500mM中进行；更优选地，每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到500mM后，维持盐浓度不变孵育24h；或，
用生物素-亲和素系统制备抗体包被的纳米颗粒例如金纳米颗粒和或磁纳米颗粒，即，将链霉亲和素包被的金纳米颗粒与Fc端生物素功能化检测抗体共孵育，离心、重悬即得。
所述(1)和(2)无先后次序。
在一些更优选的实施例中，所述单分子动态检测方法包括以下步骤：
(a)将制备好的检测芯片置于所述单分子成像系统的观测位置，往检测腔室中加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子；优选地，在加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子前，先加入PBS缓冲液或SSC缓冲液或含300mM NaCl的Tris-HCL缓冲液，所述SSC缓冲液例如为1×或2×SSC缓冲液。
(b)使用所述外力调控模块施加外力，以15-60FPS例如16.7或30FPS的帧率采集单分子的成像数据并分析所述目标分子的动态：首先，对纳米颗粒复合物施加吸引力加速目标分子和纳米颗粒复合物的扩散；其后，对纳米颗粒复合物施加斥力；调整目标分子与检测探针或捕获探针之间的结合时间，所述结合时间为5-500s优选25-250s。
同样地，调整所述结合时间时，只需调整目标分子与检测探针，或目标分子与捕获探针之间的结合时间。调整的目标取决于纳米颗粒复合物上结合的时检测探针还是捕获探针。
(c)采集记录SPRi数据，对数据进行差分处理，得到去除背景噪声的单分子成像信息；统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，获得每个分子的结合时间；最后，筛选出特异性结合占主导的结合时间内的事件，进行浓度响应拟合，得到特异性更高的浓度响应曲线；优选地，所述结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-Exp Go1模型拟合而来，迭代算法为正交距离回归。
在一些更优选的实施例中，当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，施加-0.6v-+1.0v例如-0.4V-+0.8V的电压；较佳地，先使用正电场例如0-0.8V(不含0)优选+0.4V，对纳米颗粒施加吸引力5min-20min；后使用负电场例如-0.4-0V(不含0)优选-0.2V，对纳米颗粒施加斥力10-45min。
本发明中，经研究发现，在金表面施加过大的电压时会发生电化学反应，导致预期之外的实验结果。如在小于-0.6v的电压下，捕获探针与金表面的Au-s键将被还原会巯基-SH。磁场力由电磁铁或永磁体贡献，磁场强度恒定，磁场力大小主要受磁铁与粒子的距离(1-3cm，本发明优选1.5cm)决定。
当所述外力调控模块施加的外力为磁场力时，使用12vDC、占空比25％、20s的电源驱动磁镊，先对纳米颗粒施加吸引力15min；后对纳米颗粒施加斥力15min。
在一些具体的实施例中，(1)所述检测芯片的制备具有以下特征中的一种或多种：所述玻片为BK-4或BK-7玻片；使用洗液与氢焰除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，所述洗液为食人鱼洗液，或酒精和纯水；所述还原溶液为TCEP或DTT例如5μM的TCEP或0.1M DTT；所述钝化剂为巯基聚乙二醇、巯基乙醇，或巯基聚乙二醇甲氧基和巯基聚乙二醇生物素，例如1μM巯基聚乙二醇；所述清洗使用PBS；所述减少非特异性吸附使用巯基乙醇或BSA，例如1μM巯基聚乙二醇；捕获探针或检测探针与钝化分子的比例为1:100-1:1000；和/或，
所述捕获探针或检测探针的浓度例如为50nM；和/或，
所述捕获探针为锁核酸单链，例如锁核酸分子占单链的10～50％优选20％。
本发明的洗液为具有强氧化性，可清洁玻片表面的有机物。其可以为无水乙醇和纯水，也可以为食人鱼洗液。食人鱼洗液制备方法如下：用量筒量取70mL浓硫酸倒进烧杯中，再用量筒量取30mL双氧水，缓慢倒进装有浓硫酸的烧杯中，边倒边用玻棒搅拌。食人鱼洗液能有效清洁玻片表面，有利于后续的探针修饰。
本发明的检测腔为具有抗氧化、抗水性和良好的热稳定性的带孔模具，能较牢固的固定在镀金芯片表面，必要时可以用环氧树脂粘牢。所述检测腔例如PDMS腔室的制备方法是用道康宁SYLGARD DC184，其中A、B胶以10:1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置2h以上，用直径1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室。
由于ssDNA-SH和mEPG-SH等物质的巯基能相互反应变成双硫键-S-S-，本发明的还原溶液目的是还原巯基-SH。考虑到还原溶液对修饰效果的影响，优选为三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐TCEP和二硫苏糖醇DTT，其中后者在运用中需要葡聚糖凝胶柱(比如NAP-25)进行脱盐处理，去除DTT。
本发明的清洗液为可以清洗玻片的液体，一般使用PBS。
本发明的第二方面提供一种检测单分子动态的系统，其中所述系统包括：
(i)如本发明的第一方面中所定义的纳米颗粒复合物；
(ii)如本发明的第一方面中所定义的检测探针或捕获探针。
较佳地，所述系统还包括如本发明的第一方面中所定义的检测芯片；和/或，如本发明的第一方面所定义的单分子成像系统和/或如本发明的第一方面所定义的外力调控模块。
本发明的第三方面提供一种如本发明第二方面所述的系统在检测单分子动态中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.能实现快速、超灵敏且高通量的单分子免疫检测；其中检测限可达fM级甚至更低；
2.通过外力调控解决了动态检测方案中目标分子例如抗体分子不具有普适性的问题；
3.对比SiMoA和SMC，装置成本更低，使用门槛更低，通量更大；
4.本发明优选的使用棱镜耦合结构的检测方法，具有大视野，能高通量的记录目标分子特异性结合解离带来的信号放大，更加适合临床实践中对检测技术的通量需求。
附图说明
图1为基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi平台改建的外力调控下单分子动态检测的原理示意图。
图2为基于蒙特卡洛仿真得到的不同外力介导下的结合时间的概率分布：a.有外力下的势垒0.048×KBT；b.无外力下的势垒0.193×KBT。
图3为不同结合行为所带来的特征性结合时间。
图4为电场力对分子间相互作用的影响：a.结合时间随外加电压的变化；b.结合解离事件随外加电压的变化。
图5显示了不同结合时间范围的颗粒绘制的浓度响应曲线图：a.hsa-miR-29a的结合时间分布图；b.根据时间筛选窗口进行拟合的浓度标准曲线。
图6显示了本发明的工作流程和miRNA的浓度响应曲线：a.基于电场力调控下15min检测fM水平的miRNA的工作流程；b.两种miRNA(hsa-miR-155和hsa-miR-21)的浓度响应曲线。
图7为不同外力调控下对蛋白的动态检测：a.电场调控下Aβ1-42的标准曲线；b.磁场调控下Aβ1-42的标准曲线。
具体实施方式
现有单分子动态分析技术受限于抗体的筛选不能成为一种通用的检测技术去取代终点检测，同时经过复杂设计和筛选的抗体的弱亲和力进一步加剧了浓度限制的问题，使得单分子动态分析的耗时较传统终点检测更久。本发明用纳米颗粒代替传统的酶催化发光或化学发光的分子，通过光路优化设计和深度学习识别模型，在具有大视野(>mm2)的棱镜型表面等离子共振成像SPRi平台实时对颗粒的散射光进行动态分析，高通量记录和分析单个颗粒的结合解离事件，更重要的是，利用纳米颗粒的理化特性，可以给检测系统施加不同大小和方向的外力，借助外力对纳米颗粒的调控，对受配体结合检测(ligand bindingassay)的动力学特性的调节，最终实现一种快速超灵敏的单分子动态检测技术。该技术方案的核心原理在于运用外力去调控与纳米颗粒结合的目标分子与芯片表面的受体结合解离的行为，在施加引力时，目标分子与浓度更高的纳米颗粒结合并随着纳米颗粒快速的抵达传感器表面，从被动扩散变成主动扩散，解决了浓度限制带来的孵育时间过久的问题；在施加斥力阶段，通过对纳米颗粒-受配体夹心体系的微调控，使商业高亲和力试剂也展现出与目标分子快速结合快速解离的动力学特性，实现了通用普适的单分子动态检测。最后，基于大视野的棱镜型SPRi有着高通量的特点，在光路优化后，能同时检测到更大量的目标分子，从而推进单分子检测的临床实践。
本发明构建了夹心结构的单分子检测体系，在棱镜型SPRi上实时获得大视野的成像数据，手动统计单个纳米颗粒的结合和解离事件来获得每个分子的结合时间，对纳米颗粒的操纵一方面是借助外力加速分子的扩散，把被动扩散变为主动扩散；另一方面是当纳米颗粒与目标分子结合后，对其施加斥力减少结合时间，可实现对不同亲和力大小的抗体探针的微调，使动态分析成为一种通用技术。之后通过设定与微调控下匹配的结合时间窗口，最大程度上的排除非特异性吸附的影响，实现了对低丰度蛋白、核酸和生物小分子fM水平的超灵敏检测(图1)。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
1)为了探究施加外力的大小和方向对分子结合时间的影响，本发明专利通过蒙特卡洛仿真进行了一维估算。根据郎之万方程：
Figure BDA0003513711620000111
由于实验中的采样率为0.02s，其贡献的二次项
Figure BDA0003513711620000112
远小于布朗运动的特征时间(10-6s)，因此可以忽略部分
Figure BDA0003513711620000113
方程变为：
Figure BDA0003513711620000114
zn＝zn-1+dz
其中，dz可以分为两部分。一种是由生物分子例如链核酸，适配体或抗体的形变引起的。另一个是由布朗运动引起的。从布朗运动的研究来看，由它引起的位移将服从高斯分布。标准偏差
Figure BDA0003513711620000115
D为扩散系数。
Figure BDA0003513711620000116
在模拟过程中，如果纳米颗粒的位移大于某个值，则判断纳米颗粒解离。蒙特卡罗仿真在这个实验中发挥了重要作用。我们记录了数百万个纳米粒子的解散时间以获得其分布(图2)。在斥力作用下，分子间的结合势垒从图2的b的0.193KBT变成图2的a的0.048KBT，根据公式F＝-kΔx，可知此时施加的外力大小为20-60pN。图2的a能量为0.2×10-21J，图2的b能量为0.8×10-21J，1KBT＝4.14×10-21J。
分子在有无斥力作用下的势垒变化，将直观的反映在结合时间分布上，证明了外力调控的可行性。
2)根据上述仿真结果，本发明使用纳米颗粒作为报告分子(reporting agent)和操纵分子(manipulating agent)构建类似酶联免疫吸附ELISA的夹心结构，优化施加外力的参数以实现调控纳米颗粒对分子的动力学参数的微调。具体包括：
a)下方是修饰在芯片表面的捕获探针，是能与目标分子特异性牢固结合的受体探针。芯片表面除了捕获探针外还有钝化分子用来抑制非特异性吸附，两者的比例在1:100-1:1000之间；
b)中间是目标分子(即待检测分子)，如低丰度蛋白、核酸和生物小分子。捕获探针和检测探针分别结合于目标分子的不同位点，如捕获探针和检测探针分别结合在多肽的N端(N-terminus)和C端(C-terminus)，若目标分子是核酸，则分别结合在5’和3’端。
c)上方采用能与目标分子反复结合解离的探针作为检测探针，检测探针锚定在作为报告分子和操纵分子的纳米颗粒上，通过报告分子实现对信号的放大，并借助外力调控以实现对目标分子的快速超灵敏检测；
d)在构建的夹心体系中，检测探针和捕获探针的位置可以互换，不会对系统产生本质影响。
3)本发明提出的表面等离子共振成像(Surface plasmon resonance imaging，SPRi)技术可分为基于Kretschmann棱镜耦合结构搭建的SPRi，以及油镜耦合结构的物镜式SPRM，其中棱镜型SPRi具有大视野，能高通量的记录目标分子特异性结合解离带来的信号放大，更加适合临床实践中对检测技术的通量需求。为了实现大视野、高通量的单分子动态检测，本发明对光路和检测系统进行了以下优化：
a)选用超辐射发光二极管SLED作为光源，相较于相干性极高的激光光源，SLED光源有着更少的相干条纹，为成像带来了更纯净的背景。
b)选用棱镜耦合实现表面等离子共振SPR，有着比物镜式耦合更大的视野，但其缺点是分辨率不足，因此棱镜型SPRi往往更常用于对大量样品(bulk solution sample)的检测。本发明通过光源改进和差分的图像处理，极大的提高了图像的信噪比SNR，最终使棱镜型SPRi能实时检测到金纳米颗粒(粒径≥30nm)和磁纳米颗粒(超顺磁颗粒内核，外壳二氧化硅，粒径约300nm)。
c)生物分子的相互作用(如核酸杂交和抗原抗体结合)需要在盐溶液中进行，而金纳米颗粒在高盐溶液中极其不稳定。这是由于高盐溶液下，金颗粒的德拜双电层会被压缩，颗粒间的稳定性由此打破，这对本发明所提出的基于外力的动态检测造成了极大干扰。为此，本发明优选了合适的盐浓度用于50nm和150nm的金纳米颗粒的单分子动态检测，在该浓度下，生物分子间的相互作用依然能进行，同时金纳米颗粒也能稳定存在。
d)在开源软件imageJ上对数据进行差分处理(后一帧减前一帧)，即可得到去除背景噪声的单分子成像信息，通过手动统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，可以获得每个分子的结合时间，进一步筛选更符合特异性结合的结合寿命的事件进行浓度响应的拟合
4)本发明提出的外力调控的力场发生装置，为了满足高通量的调控和低成本的要求，选择电化学工作站和磁铁来实现。根据蒙特卡洛仿真估算，外力的范围在20-60pN。通过外力调控，原本高亲和力的受体-目标分子的结合时间会减少，有别于非特异结合的结合时间(<5s或>300s)，能在一定时间内观察到反复的结合解离事件，实现了普适的动态检测(图3)。
5)为了验证仿真结合及外力调控理论，先基于易于设计亲和力的核酸链探针构建了外力调控的单分子动态检测，对25个碱基配对长度的核酸目标分子和检测探针施加-0.4V-+0.8V的电压，通过分子对结合和解离的总事件以及分子结合时间的两者的变化证明外力调控确实能起到调控分子运动及动力学行为的作用(图4的a和b)。
6)本发明基于外力调控的单分子动态检测，涉及到对分子动力学参数的调节，而研究分子相互作用的经典研究工具表面等离子共振SPR，从SPR发展而来的单分子成像系统表面等离子共振成像SPRi不单能离散的观察到单个颗粒的信号，同时还能极好的反映单个分子的结合解离事件，因此基于SPRi构建本发明实例。
7)本发明中为了更好的识别外力调控的分子动力学变化，以及减少非特异性吸附带来的干扰，设置了结合时间窗口来筛选合适的分子结合时间，对特异性结合时间范围的颗粒绘制的浓度响应曲线图证明，5-500s(优选25-250s)范围内的结合时间更倾向于是外力调控下的分子特异性结合所产生。随着时间范围的缩小，特异性会进一步增高，但会损失一部分检测事件，在优选的时间范围25-250s内，线性拟合的拟合优度可以达到0.98(图5的a和b)。
8)本发明不同于SiMoA和SMC的一大特点是低成本和快速高通量地实现超灵敏检测，SiMoA的检测芯片售价为2000美元，而本技术所用检测芯片总成本在50元人民币内；此外能将检测时间控制在15-30分钟，通过对两种miRNA(hsa-miR-155，hsa-miR-21)的超灵敏检测，证明本技术能在15分钟内实现亚fM水平的检测(图6的a和b)。
9)本发明与SiMREPS不同在于，SiMREPS的目标分析物和探针都是亲和力易于调节的核酸，且只能对短链的核酸(如miRNA)有较好的应用，而在对蛋白的检测中，SiMREPS只能通过筛选抗体Fab和FcR来满足动态分析的需求。本发明的外力调控方法能兼容现有的商业试剂，抗体试剂盒所用的检测抗体，与目标分子的结合常数kon≥1010M-1s-1，解离常数koff≤0.0002s-1；解离平衡常数KD≤0.2fM；标准情况下的分子结合自由能(standard freeenergy)≤-25kcal/mol的各种抗体的结合解离进行微调。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：
使用表面等离子共振显微镜SPRM进行动态分析检测，联用电化学工作站，利用电化学工作站为检测体系提供电场力。目标核酸与检测探针的碱基互补链长为25base pair的目标核酸的外力调控动态分析核酸检测方法如下：
(1)使用基于商业全内反射显微镜(Olympus IX-81)作为检测仪器，选用放大倍数60倍，数值孔径N.A＝1.49的物镜，光源为超宽带光源SLED，光源控制电流的强度在140mA，观察视野为512×512pixels(full field of view:33.28×33.28μm2)。采用micromanager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRM的成像信号。Cellsens软件用以控制光路的入射角度。电化学工作站为上海辰华的CHI660e，采用三电极法。
(2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片上，依次用用无水乙醇和纯水冲洗后吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后用环氧树脂胶水将自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康宁SYLGARD DC184，A、B胶以10：1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置2h以上，用直径1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金片表面并用导电银胶将导线固定在金表面构成工作电极。其后，用0.1M的二硫苏糖醇DTT溶液(购于上海生工，产品编号A100281)还原捕获探针(巯基修饰的单链核酸)内二硫键1h，之后葡聚糖凝胶柱(比如NAP-25)进行脱盐处理，去除DTT，紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获探针(与目标核酸的互补长度为25bp)的溶液，孵育2h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附；最后1×PBS清洗后得到检测芯片。
(3)用盐老化法制备核酸包被的金纳米颗粒。将1012NPs/mL的金纳米颗粒与1μM的巯基功能化检测探针(与目标核酸的另一端的25bp特异性结合)在50mM的氯化钠NaCl溶液环境内共孵育，期间每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到300mM后，维持盐浓度不变在室温摇床孵育24h，最后离心重悬收集包被检测核酸分子的金纳米颗粒。巯基修饰的检测探针在使用前用DTT溶液还原1h，随后脱盐并除去还原溶液。
(4)将检测芯片置于SPRM观测位置，改变入射光角度，随着SPR效应发生，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。往检测腔室内加入10μL，1×PBS缓冲液；然后加入10μL，颗粒浓度为1010NPs/mL，粒径为50nm金颗粒，颗粒表面已通过盐老化法连接上巯基功能化的25bp检测探针和含有目标核酸的样品溶液1μL。
(5)完成实验的准备工作后，进行检测，先对颗粒施加向下的吸引力5min，加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力10min，调整分子的结合时间，以16.7FPS的帧率采集记录SPRM数据。之后在开源软件imageJ上对数据进行差分处理(后一帧减前一帧)，即可得到去除背景噪声的单分子成像信息，通过手动统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，可以获得每个分子的结合时间，进一步筛选更符合特异性结合的结合寿命的事件进行浓度响应的拟合，可得到拟合优度R2更好的曲线。
实施例2：
实施例1中使用高分辨率的表面等离子共振显微镜SPRM作为单分子成像平台进行基于外力调控的单分子动态检测，对颗粒粒径有着极高的灵敏度，可以看到并区分粒径30-160nm的纳米颗粒，但本发明基于夹心结构进行的单分子动态检测中，没有必要用粒径非常小的颗粒，因此，视野较小的SPRM不能很好满足实际应用。因此，发明人进一步优化检测系统，使用具有大视野的表面等离子共振成像平台SPRi进行动态分析检测，联用电化学工作站，利用电化学工作站为检测体系提供电场力。目标分子(本实施例中目标分子为核酸，因此又称目标核酸)与检测探针的碱基互补链长为25base pair(以下简称bp，互补链长可以为12～50bp或更长)的目标核酸的外力调控动态分析核酸检测方法如下：
(1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数2-12倍(优选地用于观测50nm～5μm的金颗粒)，数值孔径N.A＝0.06-0.40的可变透镜组，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics)，光源控制电流的强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(field of view:1.33×1.33mm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics Prime)记录SPRi的成像信号。电化学工作站为上海辰华的CHI660e，采用三电极法。
(2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片购于赛默飞科技，后续在苏州中科院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，优选地，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30％过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液(制备方法：用量筒量取70mL浓硫酸倒进烧杯中，再用量筒量取30mL双氧水，缓慢倒进装有浓硫酸的烧杯中，边倒边用玻棒搅拌。食人鱼洗液能有效清洁玻片表面，有利于后续的探针修饰。)冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后用环氧树脂胶水将自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康宁SYLGARD DC184，A、B胶以10：1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置2h以上，用直径1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金片表面并用导电银胶将导线固定在金表面构成工作电极。其后，用5μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h，紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获探针(与目标核酸的互补长度为25bp的锁核酸单链，其中锁核酸占整体链段的10-50％，优选20％)的溶液，孵育2h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附；最后1×PBS清洗后得到检测芯片。
(3)制备核酸探针包被的金纳米颗粒，优选地，使用生物素-链霉亲和素系统取代经典盐老化法中的金硫键Au-S，使修饰流程更加简便和稳定。将1012NPs/mL的链霉亲和素包被金纳米颗粒(Nanopartz，C11-150-TS-PBS-50-1，粒径150nm)与1μM的巯基功能化检测探针(上海生工合成，一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA，能与目标核酸互补配对结合，配对长度25bp)在50mM的氯化钠(NaCl)溶液环境内共孵育，期间每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到500mM后，维持盐浓度不变在室温摇床孵育24h，最后离心重悬收集包被检测探针的金纳米颗粒。经本发明研究发现，由于核酸链的包被，会使原本不耐盐的金纳米颗粒在500mM-1M的NaCl缓冲液中依然能维持稳定。
(4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(Olympus，F30CC，折射率n＝1.518)，改变入射光角度至69-72度(优选71度)，即可产生SPR效应。随着SPR效应的增强，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为150mM的NaCl的柠檬酸钠缓冲液，即1×SSC缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为1010NPs/mL，流速为5μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品中，形成回路，用于电化学工作站施加电场力。
(5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力15min(正电场，优选+0.4V)，加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力45min(负电场，优选-0.2V)，调节目标分子与探针的结合时间，以16.7FPS的帧率采集记录SPRi数据。
(6)对所采集的图像进行处理，包括通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧)，得到去除背景噪声的单分子成像信息；通过手动统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，可以获得每个分子的结合时间，进一步筛选更符合特异性结合的结合寿命的事件，根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。
(7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果，结合解离事件的总数和结合时间(该结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-Exp Go1模型拟合而来，迭代算法为正交距离回归)随外加电压的变化的结果证明外力调控的效果(图4a和b)。
实施例3：
微小核酸miRNA作为肿瘤早筛的一项生物标志物具有广阔的应用前景，本实例选用hsa-miR-29a(miR-29a)作为目标核酸，其与检测探针的碱基互补链长为12bp，其外力调控动态分析核酸快速检测方法如下：
(1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数60倍，数值孔径N.A＝1.49的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics)，光源控制电流的强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(field of view:221.2×221.2μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics Prime)记录SPRi的成像信号。电化学工作站为上海辰华的CHI660e，采用三电极法。
(2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片购于赛默飞科技，后续在苏州中科院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30％过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后用环氧树脂胶水将自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康宁，A、B胶以10：1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置2h以上，用直径0.2mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金片表面并用导电银胶将导线固定在金表面构成工作电极。其后，用1μM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(经筛选发现，TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，本实施例采用优选的浓度为5μM)，紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为10-500nM(优选50nM)的捕获探针(与目标miRNA的互补长度为12bp的锁核酸单链，插入整体链段的10-50％的锁核酸分子，锁核酸比例优选20％)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附；最后1×PBS清洗后得到检测芯片。
(3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidin system，BAS)制备核酸包被的金纳米颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒(Nanopartz，C11-50-TS-PBS-50-1，粒径50nm)与1μM的生物素功能化检测分子(单链核酸ssDNA)在TE缓冲液中共孵育30min，最后离心重悬收集包被检测探针的金纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(Olympus，F30CC，折射率n＝1.518)，调节入射光角度至71度，即可产生SPR效应。随着SPR效应的增强，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的柠檬酸钠缓冲液，即2×SSC缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为1010NPs/mL，流速为5μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品中，形成回路，用于电化学工作站施加电场力。
(5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力5min(正电场，+0.4V)，加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-0.2V)，调节目标分子与探针的结合时间，以16.7FPS的帧率采集记录SPRi数据。
(6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧)，得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。
(7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果。miR-29a的结合时间分布图可以分特异性吸附和非特异性吸附，通过进一步优化参数可以得到，在25-250s的时间窗口内浓度标准曲线有着较好的线性拟合优度R2＝0.98(图5的a)，图5的b中虚线代表空白组时检测到的颗粒事件，通过虚线和浓度响应曲线的交点获得样品的检测限LoD。
实施例4：
为了证明本发明具有快速超灵敏检测核酸的能力，本实例选取两种癌症相关miRNA，hsa-miR-21(miR-21)和hsa-miR-155(miR-155)作为目标核酸，与检测探针的碱基互补链长都为12bp。具体方法如下：
(1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数40倍，数值孔径N.A＝0.65的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics)，光源控制电流的强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(field of view:1106×1106μm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics Prime)记录SPRi的成像信号。电化学工作站为上海辰华的CHI660e，采用三电极法。
(2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片购于赛默飞科技，后续在苏州中科院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30％过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT，flexiPERM)固定在金片表面，同时用焊锡将工作电极固定在金片表面。其后，用1μM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，优选的浓度为5μM)，紧接着在硅基培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为10-500nM(优选50nM)的捕获探针(与目标miRNA的互补长度为12bp的锁核酸单链，插入整体链段的10-50％的锁核酸分子，锁核酸比例优选20％)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附；最后1×PBS清洗后得到检测芯片。
(3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidin system，BAS)制备核酸包被的金纳米颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒(Nanopartz，C11-50-TS-PBS-50-1，粒径50nm)与1μM的生物素功能化检测分子(单链核酸ssDNA)在TE缓冲液中共孵育30min，最后离心重悬收集包被检测探针的金纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(Olympus，F30CC，折射率n＝1.518)，调节入射光角度至71度，即可产生SPR效应。随着SPR效应的增强，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的柠檬酸钠缓冲液，即2×SSC缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为1010NPs/mL，流速为5μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品中，形成回路，用于电化学工作站施加电场力。
(5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力5min(正电场，+0.4V)，加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-0.2V)，调节目标分子与探针的结合时间，以30FPS的帧率采集记录SPRi数据。
(6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧)，得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。
(7)统计特异性结合时间内的结合解离事件，可以得到两种miRNA的结合解离事件随浓度变化曲线，拟合出标准曲线(standard curve)，并根据空白对照组(blank)的结合解离事件的mean+3std(n＝3)作为基线，计算出两种目标核酸的检测限(limit ofDetection，LoD)。miR-21和miR-155的检测限分别为0.26和0.17fM(图6的a和b)，其中，miR-21的R2为0.96，miR-155的R2为0.83。
实施例5：
使用表面等离子共振成像系统SPRi进行基于外力调控的高通量动态分析检测，联用电化学工作站，利用电化学工作站为检测体系提供电场力。对阿兹海默症的生物标志物Aβ1-42进行单分子检测：
(1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数10倍，数值孔径N.A＝0.25的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics)，光源控制电流的强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(field of view:1.33×1.33mm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics Prime)记录SPRi的成像信号。电化学工作站为上海辰华的CHI660e，采用三电极法。
(2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片购于赛默飞科技，后续在苏州中科院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30％过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT，flexiPERM)固定在金片表面，同时用焊锡将工作电极固定在金片表面。其后，用1μM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(本发明中，TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，本实施例优选的浓度为5μM)，紧接着在硅基培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度比例为50:1～500:1(优选100:1)的巯基聚乙二醇甲氧基(HS-mPEG，Mw＝500Da)和巯基聚乙二醇生物素(HS-PEG5K-biotin，Mw＝3400-15000Da，优选5000、7000Da)孵育4h修饰金表面。之后加入浓度为1mg/mL链霉亲和素孵育1h，接着加入Fc端修饰了生物素的捕获抗体(多克隆抗体clone 12F4，特异性结合Aβ1-42的C-terminus，BioLegend,Inc.)溶液，浓度5-50ng/mL(优选10ng/mL)孵育2h。最后用1％BSA封闭30min以减少非特异性吸附。其中，上述每个步骤前先移除上一步骤的原液并用1×PBS溶液清洗三遍。
(3)制备检测抗体包被的金纳米颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒(Nanopartz，C11-50-TS-PBS-50-1，粒径50nm)与500ng/mL-5μg/mL(优选2μg/mL)的Fc端生物素功能化检测抗体(多克隆抗体clone6E10，特异性结合Aβ1-42的N-terminus，BioLegend,Inc.)共孵育30min，最后离心重悬收集包被检测抗体的金纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(Olympus，F30CC，折射率n＝1.518)，调节入射光角度至71度，即可产生SPR效应。随着SPR效应的增强，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的Tris-HCL缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标蛋白的样品溶液，其中，颗粒浓度为1010NPs/mL，流速为5-15μL/min，优选15μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品溶液中，形成回路，通过电化学工作站施加电场力。
(5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力5min(正电场，+0.4V)，加速目标蛋白和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-0.2V)，调节目标蛋白与检测探针的结合时间，以15-60FPS(优选16.7FPS)的帧率采集记录SPRi数据。
(6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧)，得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。
(7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果(图7的a)。电场调控下目标多肽的检测限为4.34fg/mL(～1.08fM)，可见电场力调节范围较小，对亲和力较强的抗原抗体的结合难以实现满意的调控，后续选用更大的外力对颗粒进行调控。
实施例6：
本实例在实例5的基础上，将电场调控变为磁场调控，通过更大的外力来调节高亲和力抗体与目标蛋白的结合时间，其外力调控的通用动态分析方法如下：
(1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数4倍，数值孔径N.A＝0.25的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics)，光源控制电流的强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(field of view:3.325×3.325mm2)。采用micro manager控制CCD相机(Photometrics Prime)记录SPRi的成像信号。磁场力用磁镊提供，磁镊为Magnetech Corporation的OP-2025，通过光学支架固定在芯片上方1.5cm处。
(2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片购于赛默飞科技，后续在苏州中科院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30％过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT，flexiPERM)固定在金片表面。其后，用1μM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，优选的浓度为5μM)，紧接着在硅基培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度比例为50:1～500:1(优选100:1)的巯基聚乙二醇甲氧基(HS-mPEG，Mw＝500Da)和巯基聚乙二醇生物素(HS-PEG5K-biotin，Mw＝3400-15000Da，优选5000、7000Da)孵育4h修饰金表面。之后加入浓度为1mg/mL链霉亲和素孵育1h，接着加入Fc端修饰了生物素的捕获抗体(多克隆抗体clone 12F4，特异性结合Aβ1-42的C-terminus，BioLegend,Inc.)溶液，浓度为5-50ng/mL(优选10ng/mL)孵育2h。最后用1％BSA封闭30min以减少非特异性吸附。注意每个步骤前应先移除上一步骤的原液并用1×PBS溶液清洗三遍。
(3)制备检测抗体包被的磁纳米颗粒。将1012NPs/mL链霉亲和素包被的磁纳米颗粒(Aladdin，S8040-A300nm-1EA，粒径300nm)与500ng/mL-5μg/mL(优选2μg/mL)的Fc端生物素功能化检测抗体(多克隆抗体clone6E10，特异性结合Aβ1-42的N-terminus，BioLegend,Inc.)共孵育30min，最后离心重悬收集包被检测抗体的磁纳米颗粒。
(4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(Olympus，F30CC，折射率n＝1.518)，调节入射光角度至71度，即可产生SPR效应。随着SPR效应的增强，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的Tris-HCL缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标蛋白的样品溶液，其中，颗粒浓度为1010NPs/mL，流速为5-15μL/min，优选15μL/min。
(5)样品检测，优选地用12vDC，占空比25％，20s的电源驱动磁镊，先对磁纳米颗粒施加向下的吸引力5min(磁镊在芯片下方1.5cm)，加速目标蛋白和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(磁镊在芯片上方1.5cm)，调节目标蛋白与检测探针的结合时间，以15-60FPS(优选16.7FPS)的帧率采集记录SPRi数据。
(6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧)，得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。
发现磁场调控下，由于所施加的外力更大，分子的结合时间能更短，有利于动态分析的信号放大，对应的对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果，证明合适的外力调控能获得更灵敏的检测限0.21fg/mL(～0.05fM)(图7的b)。
本发明中：
1.对于单分子成像系统，除了技术方案中的SPRi，任何单分子成像技术都可以成为替代方案，如全内反射荧光显微镜TIRFM、暗场成像、干涉散射成像iSCAT等。
2.对于外力调控的模块，除了电化学工作站用于电场调控，和镍铬磁铁用于磁力调控，众多非接触力发生装置均可满足需求，如磁镊、光镊、声镊、热泳和原子力显微镜AFM。
3.作为报告分子和操纵分子的纳米颗粒，是一种粒径在30nm-5μm的纳米颗粒或微球，材质包括但不限于二氧化硅(硅球)、金(金颗粒)、银(银颗粒)和聚苯乙烯PS，以及复合材料如包被超顺磁颗粒的二氧化硅磁珠等；其物理化学特性适合受到电场力，磁场力等外力的调控。
4.捕获探针和检测探针，除了技术方案中所抗体，还包括单链核酸，适配体，工程化的抗体、核酸、适配体，以及能与目标分子相结合的任意化学物质，代谢产物等。
5.对于SPRi系统，除了SLED光源，也可以使用合适波段的激光光源，如600-800nm的激光光源用于50nm的金膜的SPR激发。或者使用银膜、氮化硅/氧化硅的结构实现SPR。SPRi的结构可以为物镜耦合型，也可以用棱镜耦合(Kretschmann结构)。
6.对于磁场调控，电磁铁，永磁体均可；对于电场调控，除去技术方案中的电化学工作站，还可以使用任意的双电极，三电极电场发生装置代替。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的所涵盖。

Claims (11)

1.一种单分子动态检测方法，其特征在于，其使用外力调控模块来调节目标分子与检测探针、捕获探针、纳米颗粒之间的结合与解离，并采用单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述目标分子的动态；
其中，所述捕获探针的末端与目标分子的头部互补，所述目标分子的末端与检测探针互补；所述捕获探针或检测探针与所述纳米颗粒形成纳米颗粒复合物；当所述纳米颗粒复合物与目标分子结合后，在所述外力调控模块驱动下被牵引到检测探针或捕获探针附近，与所述捕获探针或检测探针特异性结合，再在所述外力调控模块驱动下被提拉离开所述检测探针或捕获探针。
2.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述外力调控模块包括电场调控、磁力调控和非接触力发生装置；
较佳地，所述电场调控使用双电极、三电极电场发生装置例如电化学工作站，工作电极可选用的材料选自玻碳电极、铂、金、银、铅、导电玻璃和汞；所述磁力调控使用电磁铁或永磁体例如镍铬磁铁或磁镊；所述非接触力发生装置包括光镊、声镊、热泳和原子力显微镜AFM；和/或，
所述外力调控模块施加的外力范围在0.01-1000pN例如20-60pN。
3.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述目标分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕获探针和检测探针包括天然或工程化的抗体、核酸和适配体，或与所述目标分子结合的任意化学物质或代谢产物。
4.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述单分子成像系统包括SPRi、TIRFM、暗场成像和iSCAT；和/或，所述纳米颗粒的粒径为30nm-5μm，材质包括但不限于纳米硅、纳米金、纳米银、聚苯乙烯和包被超顺磁颗粒的二氧化硅磁珠；
较佳地，所述SPRi的结构包括物镜耦合型SPRi和棱镜耦合型SPRi，物镜耦合型SPRi优选物镜式SPRM，例如全内反射显微镜改建的物镜式SPRM，棱镜耦合型SPRi例如Kretschmann棱镜耦合结构；和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光光源；和/或，所述纳米颗粒包括纳米金或磁纳米颗粒；
更佳地，所述SPRi的结构为棱镜耦合型SPRi；和/或，所述纳米颗粒的粒径为50nm～300nm，例如50nm、150nm或300nm。
5.如权利要求1～4任一项所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述捕获探针或检测探针吸附于检测芯片；
较佳地，当所述目标分子为核酸时：所述捕获探针末端的12～25个核苷酸与目标分子一端的核苷酸互补，目标分子另一端的核苷酸与检测探针互补；或，所述捕获探针和检测探针其中之一为锁核酸，另一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA，所述纳米颗粒为链霉亲和素包被的纳米颗粒；
当所述目标分子为蛋白或多肽或小分子时：所述检测探针为与目标分子结合的抗体，所述捕获探针为与所述目标分子牢固结合的抗体；优选所述检测探针为Fc端修饰了生物素的抗目标分子的抗体，所述捕获探针为Fc端生物素功能化的抗体，更优选捕获探针与目标分子的结合常数kon≥1010M-1s-1，解离常数koff≤0.0002s-1，解离平衡常数KD≤0.2fM；检测探针与目标分子的结合常数kon≤5×108M-1s-1，解离常数koff≥0.05s-1；解离平衡常数KD≥1.56pM。
6.如权利要求5所述的单分子动态检测方法，其特征在于，
(1)所述检测芯片的制备包括以下步骤：
在镀有2-3nm铬、47nm金的玻片上，先除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，再将检测腔室例如PDMS腔室或硅基细胞培养板固定在金片表面并制成工作电极；其后，用还原溶液还原巯基修饰的检测探针或捕获探针、脱盐并除去还原溶液，加入钝化剂钝化金片表面，清洗后加入还原后的检测探针或捕获探针并孵育；最后清洗并加入溶液减少非特异性吸附并清洗，即得所述检测芯片；和/或，
(2)所述纳米颗粒复合物的制备包括以下步骤：
用盐老化法制备核酸包被的纳米金颗粒，即，将纳米金颗粒与巯基还原后的捕获探针或检测探针共孵育，离心、重悬即得；优选地，所述共孵育在梯度氯化钠溶液例如50～300mM氯化钠溶液中进行；更优选地，每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到300mM后，维持盐浓度不变孵育24h；或，
用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒例如纳米金颗粒，即，将链霉亲和素包被的金纳米颗粒与生物素功能化检测分子共孵育，离心、重悬即得；所述生物素功能化检测分子例如一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA；优选地，所述共孵育在梯度浓度的氯化钠溶液例如50～500mM中进行；更优选地，每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到500mM后，维持盐浓度不变孵育24h；或，
用生物素-亲和素系统制备抗体包被的纳米颗粒例如金纳米颗粒和磁纳米颗粒，即，将链霉亲和素包被的纳米颗粒与Fc端生物素功能化检测抗体共孵育，离心、重悬即得；
所述(1)和(2)无先后次序。
7.如权利要求6所述的单分子动态检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(a)将检测芯片置于所述单分子成像系统的观测位置，往检测腔室中加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子；优选地，在加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子前，先加入PBS缓冲液或SSC缓冲液或含300mM NaCl的Tris-HCL缓冲液，所述SSC缓冲液例如为1×或2×SSC缓冲液；
(b)使用所述外力调控模块施加外力，以15-60FPS例如16.7或30FPS的帧率采集单分子的成像数据并分析所述目标分子的动态：首先，对纳米颗粒复合物施加吸引力加速目标分子和纳米颗粒复合物的扩散；其后，对纳米颗粒复合物施加斥力；调整目标分子与检测探针或捕获探针之间的结合时间，所述结合时间为5-500s优选25-250s；
(c)采集记录SPRi数据，对数据进行差分处理，得到去除背景噪声的单分子成像信息；统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，获得每个分子的结合时间；最后，筛选出特异性结合占主导的结合时间内的事件，进行浓度响应拟合，得到特异性更高的浓度响应曲线；优选地，所述结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-Exp Go1模型拟合而来，迭代算法为正交距离回归。
8.如权利要求7所述的单分子动态检测方法，其特征在于，
当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，施加-0.6v-+1.0v例如-0.4V-+0.8V的电压；较佳地，先使用正电场例如0-0.8V优选+0.4V，对纳米颗粒施加吸引力5min-20min；后使用负电场例如-0.4-0V优选-0.2V，对纳米颗粒施加斥力10-45min；
当所述外力调控模块施加的外力为磁场力时，使用12vDC、占空比25％、20s的电源驱动磁镊，先对纳米颗粒施加吸引力15min；后对纳米颗粒施加斥力15min。
9.如权利要求6所述的单分子动态检测方法，其特征在于，(1)所述检测芯片的制备具有以下特征中的一种或多种：所述玻片为BK-4或BK-7玻片；使用洗液与氢焰除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，所述洗液为食人鱼洗液，或酒精和纯水；所述还原溶液为TCEP或DTT例如5μM的TCEP或0.1M DTT；所述钝化剂为巯基聚乙二醇、巯基乙醇，或巯基聚乙二醇甲氧基和巯基聚乙二醇生物素，例如1μM巯基聚乙二醇；所述清洗使用PBS；所述减少非特异性吸附使用巯基乙醇或BSA，例如1μM巯基聚乙二醇；捕获探针或检测探针与钝化分子的比例为1:100-1:1000；和/或，
所述捕获探针或检测探针的浓度例如为50nM；和/或，
所述捕获探针为锁核酸单链，例如锁核酸分子占单链的10～50％优选20％。
10.一种检测单分子动态的系统，其特征在于，所述系统包括：
(i)如权利要求1～9任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的纳米颗粒复合物；
(ii)如权利要求1～9任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的检测探针或捕获探针；
较佳地，所述系统还包括如权利要求5～9任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的检测芯片；和/或，如权利要求1～9任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的单分子成像系统和/或所定义的外力调控模块。
11.如权利要求10所述的系统在检测单分子动态中的应用。
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