CN105136786A - 一种利用金纳米颗粒和硫黄素t检测富g核酸序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种利用金纳米颗粒和有机小分子硫磺素T检测富G核酸序列的方法,属于生物传感及分析领域。该方法利用硫黄素T能够诱导富G核酸序列形成G‐四链体并嵌入其中发射较强荧光的特点,以及金纳米颗粒在不同聚集状态呈现不同颜色的特点,以金纳米颗粒颜色变化为比色检测信号,以硫黄素T嵌入G‐四链体前后荧光强度的变化为荧光检测信号,建立了一种检测富G核酸序列的灵敏、快速、简便的光学检测新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物传感及分析领域,具体涉及一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法。
背景技术
G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基G的核酸序列形成的一种特殊的DNA二级结构。人类染色体末端也存在单链富G的端粒序列,能够形成G-四链体结构,一旦形成G‐四链体,就不能再被端粒酶所延伸,从而抑制了细胞的正常生长。研究已表明,G‐四链体的形成与肿瘤的发生有着密切的关系,因为在很多恶性肿瘤当中,由于这段单链的端粒序列可被端粒酶所延伸,而避免其在细胞分裂过程中程序性缩短,使细胞得以永生。近年来,G‐四链体的研究引起了研究人员的极大兴趣,相应地,如何快速高效的检测富G核酸序列就显得十分重要和迫切。
硫黄素T(ThT)是一种有机小分子水溶性荧光染料,可以专一的诱导富G核酸序列形成G‐四链体。许多其它的四链体复合染料,如孔雀绿和噻唑橙,能够与单链或双链核酸序列分子发生作用,这使得它们丧失了对于G‐四链体的特异性。硫黄素T的荧光强度较其它的四链体复合染料具有很大的增强,因而可以提高传感的灵敏度。硫黄素T对G‐四链体的高度选择性也可以提高传感的特异性。同时,由硫黄素T直接诱导的具有结构专一性的G‐四链体能够产生更加稳定的荧光。
近年来,纳米材料技术迅速发展并被广泛应用于重金属离子检测、药物输送、疾病诊断等领域。纳米材料本身具有表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等优良特性,使其在发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器领域成为国内外研究热点。尤其是金纳米颗粒(goldnanoparticles,AuNPs)材料作为金属纳米材料中最稳定的纳米材料之一,因其具有高电子密度、介电特性和催化作用,能与多种生物大分子结合,且不影响其生物活性,并在可见光范围内具有优异的光学性能,而成为研究的热点材料,在光电子学、传感器、催化和生物医学等领域有着广泛的应用价值。
比色传感器是一类以吸光度改变或波峰位移加以测量并伴随产生颜色差异的传感器。比色传感器是以特定物质在一定波长范围内对电磁波的吸收特性为依据而建立的定性及定量检测工具,它因具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、特异性强和快速检测等优点而得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,该方法灵敏、快速、简便。
本发明采用的技术方案如下:
一种利用金纳米颗粒和硫磺素T检测富G核酸序列的方法,包括以下步骤:
a)用DNA保存液将待测样品配制成浓度为10μM的溶液;
b)取3μL配制好的核酸溶液加入到1-10μL浓度为100μM的硫黄素T溶液中进行反应;
c)向上述反应液中加入79-95μL浓度为0.437nM的金纳米颗粒溶液,反应5-10min;
d)再加入1-8μL浓度为1M的氯化钠溶液,使总体积为100μL,观察溶液的颜色变化并拍照记录,然后测定反应溶液的吸收光谱;
e)测定完成后,在溶液中加入100μL缓冲溶液,以425nm为激发波长进行荧光检测,记录溶液荧光发射谱带及其在490nm处的荧光强度。
若金纳米颗粒溶液变为蓝色,吸收光谱较纯金纳米颗粒溶液出现红移,且荧光强度增强,490nm处的荧光强度相比于空白组增加大于150%,则说明所测核酸为富G核酸序列;若金纳米颗粒溶液仍为红色,吸收光谱没有发生红移,且荧光强度较弱,490nm处的荧光强度相比于空白组增加小于150%,则说明所测核酸为非富G核酸序列。
进一步的,步骤a)中所述DNA保存液为:50mMTris-HCl,pH8.0。
进一步的,步骤b)中所述反应温度为室温,反应时间为3min。
进一步的,步骤c)中所述金纳米颗粒的粒径为10-20nm。
进一步的,步骤b)和c)中所述的硫黄素T溶液和氯化钠溶液的溶剂均为超纯水。
进一步的,步骤d)中所述加入的氯化钠溶液体积为7μL。
进一步的,步骤e)中所述缓冲溶液为:50mMTris-HCl,pH7.2。
本发明的有益效果:本发明所述的荧光检测方法和比色检测方法,可实现对富G核酸序列的特异性检测,将未修饰的金纳米颗粒应用于富G核酸序列的检测中,通过观察金纳米颗粒光学特性的变化和测试硫黄素T嵌入G-四链体前后荧光强度的变化可以快速、简便地实现对目标物质的检测;此方法还可以推广应用到其它众多富G核酸序列的检测当中。
附图说明
图1是本发明利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法的工作原理图。
图2是实施例1中记录的吸收光谱图。
图3是实施例1中检测PS2.M序列,加入氯化钠后的透射电镜图。
图4是实施例1中检测R-18序列,加入氯化钠后的透射电镜图。
图5是实施例1中记录的荧光光谱图。
图6是实施例2中记录的吸收光谱图。
图7是实施例2中检测22AG-1序列,加入氯化钠后的透射电镜图。
图8是实施例2中检测R-11序列,加入氯化钠后的透射电镜图。
图9是实施例2中记录的荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。
本发明中吸收光谱测量条件:检测仪器为紫外-可见分光光度计(Lambda35,美国);扫描范围400-900nm;用600μL石英比色皿盛放100μL样品;室温。
荧光光谱测量条件:检测仪器为荧光分光光度计(LS55,美国);氙灯激发,激发和发射狭缝宽度分别为5nm和5nm,电压950V,激发波长为425nm,发射波长扫描范围为435-650nm;用600μL石英比色皿盛放200μL样品;室温。
本发明实施例中所用的各种核酸序列(购自上海生物工程技术有限公司)如表1所示,其中PS2.M和22AG-1是富G核酸序列,而R-18和R-11是对应的任意核酸序列。所用的DNA保存液为50mMTris-HCl,pH8.0;所用的缓冲溶液为50mMTris-HCl,pH7.2。
表1寡聚核苷酸碱基组成表
实施例1
用DNA保存液分别配制浓度为10μM的PS2.M溶液和R-18溶液,分别取3μL加入到3μL浓度为100μM的硫黄素T溶液中,室温下反应3min,然后各加入87μL金纳米颗粒溶液反应10min,所述金纳米颗粒的粒径为10-20nm,溶液浓度为0.437nM,再加入7μL浓度为1M的氯化钠溶液(氯化钠溶液和之前提及的硫黄素T溶液的溶剂均为超纯水),使总体积为100μL,观察溶液的颜色变化并拍照记录,然后测定反应溶液的吸收光谱,吸收光谱图见附图2。同时取样测定两组溶液的透射电镜图,结果见附图3和4。测定完成后,在溶液中加入100μL缓冲溶液,进行荧光检测,记录溶液荧光发射谱带及其在490nm处的荧光强度,荧光光谱图见附图5。
检测结果显示,PS2.M溶液最后呈蓝色,吸收光谱发生红移,荧光增强,490nm处荧光强度相比于空白组增加大于150%;而R-18溶液呈红色,吸收光谱未发生红移,荧光强度低,490nm处荧光强度相比于空白组增加小于150%。
这是因为PS2.M溶液中加入硫黄素T可诱导这段富G核酸序列形成G-四链体并嵌入其中发光,此时的G-四链体不能吸附在金纳米颗粒表面,因而加入氯化钠时,金纳米颗粒很容易聚集,此时溶液呈蓝色;R-18溶液中硫黄素T不能诱导任意核酸序列形成G-四链体,因而硫黄素T以游离状态存在,不能发光,加入金纳米颗粒后,由于单链核酸序列能够吸附在金颗粒表面,使金纳米颗粒高度稳定,加入氯化钠时不会发生聚集,故金纳米颗粒呈分散状态且颜色不变,此时溶液呈红色。
实施例2
用DNA保存液分别配制浓度为10μM的22AG-1溶液和R-11溶液,分别取3μL加入到4μL浓度为100μM的硫黄素T溶液中,室温下反应3min,然后各加入86μL金纳米颗粒溶液反应8min,所述金纳米颗粒的粒径为10-20nm,溶液浓度为0.437nM,再加入7μL浓度为1M的氯化钠溶液(氯化钠溶液和之前提及的硫黄素T溶液的溶剂均为超纯水),使总体积为100μL,观察溶液的颜色变化并拍照记录,然后测定反应溶液的吸收光谱,吸收光谱图见附图6。同时取样测定两组溶液的透射电镜图,结果见附图7和8。测定完成后,在溶液中加入100μL缓冲溶液,进行荧光检测,记录溶液荧光发射谱带及其在490nm处的荧光强度,荧光光谱图见附图9。
检测结果显示,22AG-1溶液最后呈蓝色,吸收光谱发生红移,荧光增强,490nm处荧光强度相比于空白组增加大于150%;而R-11溶液呈红色,吸收光谱未发生红移,荧光强度低,490nm处荧光强度相比于空白组增加小于150%。
序列表
<110>南京邮电大学
<120>一种利用金纳米颗粒和硫磺素T检测富G核酸序列的方法
<130>
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gtgggtagggcgggttgg18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcatgcattacaacgtga18
<210>3
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
agggttagggt11
<210>4
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agctactgtta11
Claims (7)
1.一种利用金纳米颗粒和硫磺素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)用DNA保存液将待测样品配制成浓度为10μM的溶液;
b)取3μL配制好的核酸溶液加入到1-10μL浓度为100μM的硫黄素T溶液中进行反应;
c)向上述反应液中加入79-95μL浓度为0.437nM的金纳米颗粒溶液,反应5-10min;
d)再加入1-8μL浓度为1M的氯化钠溶液,使总体积为100μL,观察溶液的颜色变化并拍照记录,然后测定反应溶液的吸收光谱;
e)测定完成后,在溶液中加入100μL缓冲溶液,以425nm为激发波长进行荧光检测,记录溶液荧光发射谱带及其在490nm处的荧光强度。
若金纳米颗粒溶液变为蓝色,吸收光谱较纯金纳米颗粒溶液出现红移,且荧光强度增强,490nm处的荧光强度相比于空白组增加大于150%,则说明所测核酸为富G核酸序列;若金纳米颗粒溶液仍为红色,吸收光谱没有发生红移,且荧光强度较弱,490nm处的荧光强度相比于空白组增加小于150%,则说明所测核酸为非富G核酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,步骤a)中所用的DNA保存液为:50mMTris-HCl,pH8.0。
3.根据权利要求1所述的一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,步骤b)中反应温度为室温,反应时间为3min。
4.根据权利要求1所述的一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,步骤c)中所述的金纳米颗粒的粒径为10-20nm。
5.根据权利要求1所述的一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,步骤b)和c)中所述的硫黄素T溶液和氯化钠溶液的溶剂均为超纯水。
6.根据权利要求1所述的一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,步骤d)中加入的氯化钠溶液体积为7μL。
7.根据权利要求1所述的一种利用金纳米颗粒和硫黄素T检测富G核酸序列的方法,其特征在于,步骤e)中所用的缓冲溶液为:50mMTris-HCl,pH7.2。
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