CN101587066A - 菁染料在检测g-四链体结构dna中的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了菁染料在检测G－四链体结构DNA中的新用途。应用菁染料检测G－四链体结构DNA，具有简单、快捷、相对廉价的优点，克服了现有检测技术周期长、价格高昂、技术及设备要求高的缺陷。应用菁染料检测G－四链体结构DNA，通过紫外可见吸收光谱、荧光光谱或共聚焦激光扫描显微镜就能迅速识别出溶液中的DNA样品是G－四链体结构还是线性的双螺旋结构。利用共聚焦激光扫描显微镜，还能直观的标记出组装在Au表面的DNA样品，不仅能识别DNA样品的结构，同时还能标记出DNA样品在Au表面组装的具体位置。

Description

菁染料在检测G-四链体结构DNA中的新用途
技术领域
本发明涉及菁染料在检测G-四链体结构DNA中的新用途。
背景技术
单链的端粒DNA很容易通过鸟嘌呤碱基之间的氢键发生四个碱基配对，形成平面的G-四链体结构。人体端粒DNA序列d(TTAGGG)4可以在钾离子或纳离子的作用下形成不同结构的G-四链体。在体外与体内实验中识别G-四链体结构DNA(主要是与线性的双螺旋结构DNA相区别)，对于确定G-四链体结构DNA在人体内的生理功能和抗肿瘤药物的研发等方面都有非常重要的作用。
目前，在体外和体内实验中识别G-四链体结构DNA已有一些文献报道。体内实验中识别G-四链体结构DNA较为困难，目前仍存在较大的争议。体外实验中识别G-四链体结构DNA，大都采用生物方法，最常见的是利用与G-四链体结构DNA特异性相互作用的蛋白质(主要为各种DNA酶类)。目前发现的在体外实验中能与G-四链体结构DNA特异性相互作用的蛋白质已经超过二十种(Bioessays.2007，29，155-165)。但是以纯度较高的蛋白质作为检测物，难以分离纯化，加上蛋白质活性不易保存，价格也非常昂贵，大大的限制了以上方法的使用范围。有报道采用单一荧光分子来特异性的标记G-四链体结构DNA，但是这种方法检测手段复杂，仪器要求非常高，基本上不能普及使用。如有文献报道了一种荧光染料分子分别与G-四链体结构DNA、双螺旋结构DNA结合时，表现出不同的荧光寿命(AnalyticalChemistry.2004，76，4490-4494)。
菁染料是一种常用染料，具有独特的光敏感性质，几个世纪以来，伴随其独特的理化、光学性质被发现，逐渐被用做显影剂、光敏剂、非线性光学材料等。
发明内容
本发明的目的是提供菁染料在检测G-四链体结构DNA中的新用途。
本发明提供了菁染料在检测G-四链体结构DNA中的应用。
应用菁染料，可以通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5小于等于4，避光条件下反应，对反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果菁染料聚集体特征峰(659.5nm)的峰值小于0.01，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
应用菁染料，还可以通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将双链结构DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A′，溶液A′与溶液A的浓度相同；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于1.5；将溶液A′和溶液B混合，使混合液中双链结构DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于1.5，作为对照；避光条件下反应，对两种反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果待测DNA溶液菁染料聚集体特征峰(659.5nm)的峰值小于对照的0.6倍，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
应用菁染料，还可以通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将双链结构DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A′，溶液A′与溶液A的浓度相同；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5小于等于4；将溶液A′和溶液B混合，使混合液中双链结构DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5小于等于4，作为对照；避光条件下反应，对两种反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果待测DNA溶液菁染料单体特征峰(584nm)的峰值大于对照的1.25倍，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
应用菁染料，还可以通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于1.5，避光条件下反应，对反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果菁染料单体特征峰(584nm)的峰值大于0.1，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
应用菁染料，还可以通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于等于4；避光条件下反应，对反应后溶液进行荧光光谱分析，如果待测DNA溶液菁染料单体特征峰(600nm)的峰值为DNA浓度(μM)的3倍以上，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
所述缓冲液具体可为磷酸缓冲液。
所述菁染料具体可用甲醇溶解。
所述避光反应的时间具体可为9～15小时。
应用菁染料，还可以通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
将待测DNA组装到Au表面后放入如下菁染料溶液中，避光染色10-300分钟后取出Au片，用pH值6.0～8.0的缓冲液冲洗，再对该Au片进行共聚焦激光扫描显微镜检测，所述共聚焦激光扫描显微镜检测中所用的激发光波长为559nm，如果只出现600-610nm的荧光，则待测DNA为G-四链体结构DNA；所述菁染料溶液按照如下方法配制：将菁染料溶解，再用pH值为6.0～8.0的缓冲溶液稀释，使菁染料分子浓度为0.5-20μM。
所述缓冲液具体可为磷酸缓冲液。
所述菁染料浓度为10μM时，所述避光染色时间为1小时。
可通过任何常规方法将DNA组装到Au片表面，如将待测DNA与巯基十一酸处理后的Au片反应。
菁染料由于其分子结构的特殊性，具有如下性质：
1)在特定溶液中，可以依靠范德华力的作用形成聚集体。
在磷酸缓冲溶液体系中，菁染料聚集体与G-四链体结构DNA相互作用较强，而与典型的双螺旋结构DNA的相互作用相对较弱。当G-四链体结构DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5∶1时，G-四链体结构DNA可使菁染料从J-聚集体完全解聚为单体。同时，在G-四链体结构DNA与菁染料分子的摩尔比约为1.5∶1时，可使菁染料单体的荧光强度增强80多倍。在双螺旋结构DNA与菁染料分子的摩尔比大于3∶1的情况下，菁染料仍主要以J-聚集体的形式存在。同时，双螺旋结构DNA与染料分子的摩尔浓度比约为1.5∶1时，只能使菁染料单体的荧光强度增强30多倍。因此，通过检测菁染料聚集体与待测DNA相互作用后的荧光强度，能快捷有效的识别待测DNA的结构，判断待测DNA是G-四链体结构DNA还是双螺旋结构DNA。虽然线性双螺旋结构DNA与菁染料聚集体的相互作用较弱，但二者仍有一定的作用，且作用效果和G-四链体结构DNA类似。因此，必须控制溶液中待测DNA与菁染料聚集体的摩尔比在(0.5-4)∶1的范围内。
2)在与特定模板分子相互作用的过程中，菁染料很容易受到模板分子自身结构的影响，表现出不同的分子聚集状态，形成具有不同结构和特性的超分子体系。
组装在金(Au)片表面的DNA与菁染料聚集体有一定的相互作用，能够吸附菁染料聚集体，而直接吸附在Au表面的菁染料聚集体则会被磷酸缓冲溶液冲洗掉。因此，在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下用559nm的激光激发，Au片上只有组装了DNA的部分，才能看到菁染料分子的荧光。由于G-四链体结构DNA与菁染料聚集体的相互作用较大，能将菁染料由J-聚集体解聚为单体状态，同时增强菁染料单体的荧光强度，组装有G-四链体结构DNA的Au片在CLSM下观察到的主要是菁染料单体的荧光，其波长位于约600-610nm范围内，而线性双螺旋结构DNA在一定的浓度比例下不能解聚菁染料J-聚集体，虽然也能增强菁染料单体的荧光强度，但组装有双螺旋DNA的Au片部分，在CLSM下观察到的主要仍是菁染料J-聚集体的荧光，其波长位于约660-670nm范围内。通过在CLSM下采集分波长的荧光图像，即可判断待测DNA是G-四链体结构DNA还是双螺旋结构DNA。在界面对G-四链体结构DNA的识别过程中，用菁染料聚集体染色DNA的过程对于最终CLSM图像的影响非常大，不仅涉及菁染料聚集体与DNA之间的比例，还与菁染料聚集体吸附到Au表面的情况有关。所以为了得到背景清晰，结果正确的识别结果，优选使用10μM的菁染料聚集体染色，染色时间为1小时。
由于溶液的酸碱性不仅会影响聚集体中染料单分子的排列模式，还会影响DNA在溶液中及界面上的结构及表面电荷的分布，所以本发明选用的磷酸缓冲溶液的pH值应控制在6.0～8.0。本发明采用在避光条件下进行识别，这是由于染料对光极其敏感，在光照射下很容易发生反应，因此光照时间过长，会影响染料的光学性质，只有避光保存才能保证菁染料聚集体充分与DNA反应。
本发明提供了菁染料在检测G-四链体结构DNA中的新用途。应用菁染料检测G-四链体结构DNA，具有简单、快捷、相对廉价的优点，克服了现有检测技术周期长、价格高昂、技术及设备要求高的缺陷。应用菁染料检测G-四链体结构DNA，通过紫外可见吸收光谱、荧光光谱或共聚焦激光扫描显微镜能迅速识别出溶液中的DNA样品是G-四链体结构还是线性的双螺旋结构。利用共聚焦激光扫描显微镜，还能直观的标记出组装在Au表面的DNA样品，不仅能识别DNA样品的结构，同时还能标记出DNA样品在Au表面组装的具体位置。
与现有技术相比，本发明提供的方法的优点在于：
1)能够有效的在溶液体系与界面上识别不同的G-四链体结构DNA，如人体端粒DNA序列，主要是实现G-四链体与线性双螺旋DNA之间的识别。
2)按本发明提供的比例将DNA样品与菁染料聚集体溶液混合，用简单的光谱学仪器，就能识别出DNA样品的结构。简单快捷，成本低廉。
3)按本发明的方法染色组装在Au片上的DNA样品，在CLSM下能直观的识别出DNA样品的结构。既可以用于器件的制作，也可以适用于较大规模的识别。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为实施例1中作为对照的检测液丙的紫外可见吸收光谱
图2为实施例1中检测液甲的紫外可见吸收光谱
图3为实施例1中检测液乙的紫外可见吸收光谱
图4为实施例1中作为对照的检测液丙的荧光光谱
图5为实施例1中检测液甲的荧光光谱
图6为实施例1中检测液乙的荧光光谱
图7为实施例2中检测液甲的紫外可见吸收光谱
图8为实施例2中检测液乙的紫外可见吸收光谱
图9为实施例2中检测液甲的荧光光谱
图10为实施例2中检测液乙的荧光光谱
图11为实施例3中检测液甲的紫外可见吸收光谱
图12为实施例3中检测液乙的紫外可见吸收光谱
图13为实施例3中检测液甲的荧光光谱
图14为实施例3中检测液乙的荧光光谱
图15为实施例4中菁染料聚集体与不同结构DNA作用后的共聚焦激光扫描荧光显微镜(CLSM)图像
具体实施方式
样本1：G-四链体结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)4，购自英骏生物技术有限公司。将上述序列为d(TTAGGG)4的寡聚DNA链适量溶解于磷酸缓冲液中，4℃静置24小时即可得到样本1。
样本2：线性双螺旋结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)4/(AATCCC)4，该样品由两条序列分别为d(TTAGGG)4和d(AATCCC)4的互补DNA链(均购自英骏生物技术有限公司)自行合成。将适量上述两条DNA链分别溶于磷酸缓冲液中，按摩尔比1∶1混合后置于85℃水浴中保温15分钟，缓慢冷却至室温后4℃静置24小时即可得到样本2。
样本3：：G-四链体结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)4-NH2，购自英骏生物技术有限公司。将上述序列为d(TTAGGG)4-NH2的寡聚DNA链适量溶解于磷酸缓冲液中，4℃静置24小时即可得到样本3。
样本4：线性双螺旋结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)4-NH2/(AATCCC)4，该样品由两条序列分别为d(TTAGGG)4-NH2和d(AATCCC)4的互补DNA链(均购自英骏生物技术有限公司)自行合成。将适量上述两条DNA链分别溶于磷酸缓冲液中，按摩尔比1∶1混合后置于85℃水浴中保温15分钟，缓慢冷却至室温后4℃静置24小时即可得到样本4。
以下实施例中所用的菁染料的具体制备方法如下(参见文献Hamer，F.M.TheChemistry of Heterocyclic Compounds；Interscience：New York，1964；Vol.18.及Ficken，G.E.The Chemistry of Synthetic Dyes；Academic Press：New York，1971；Vol.4.)：
Figure A20081011239400091
以上合成路线所用原料，均可购自Sigma公司。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、G-四链体结构DNA的检测
1、制备反应液
1)溶液甲
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇(优级纯)溶液；加入60μL 200μM的样本1的磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液甲。溶液甲中，样本1DNA与菁染料的摩尔比为1.5∶1。
2)溶液乙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇(优级纯)溶液；加入60μL 200μM的样本2的磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液乙。溶液乙中，样本2DNA与菁染料的摩尔比为1.5∶1。
3)溶液丙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇(优级纯)溶液，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液丙，作为对照。
2、检测
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的浓度均为4μM。避光反应12小时，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。
1)紫外可见吸收光谱分析
将检测液进行紫外可见吸收光谱分析，测液丙的紫外可见吸收光谱见图1，检测液甲的紫外可见吸收光谱见图2，检测液乙的紫外可见吸收光谱见图3。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上只有菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)，强度为0.917；检测液甲(含有G-四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的特征峰(659.5nm)消失(小于0.01)；检测液乙(含有双链结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)强度为0.755。
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上没有出现菁染料单体的特征峰(584nm)；检测液甲(含有四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.1482；检测液乙(含有双链结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.1165。
2)荧光光谱分析
将检测液进行荧光光谱分析，测液丙的荧光光谱见图4，检测液甲的荧光光谱见图5，检测液乙的荧光光谱见图6。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的发射荧光光谱上只有菁染料聚集体的荧光发射峰(662nm)，强度为0.647，而没有菁染料单体的荧光发射峰(600nm)；检测液甲(含有G-四链体结构DNA)的荧光光谱上出现很强的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为22.83；检测液乙(含有双链结构DNA)的荧光光谱上出现较弱的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为8.576。
3、结果分析
进行紫外可见吸收光谱分析时，当溶液中没有DNA样品时，菁染料呈聚集体状态，只有聚集体的吸收峰(659.5nm)，不会出现单体的峰(584nm)。当加入G-四链体结构DNA时，菁染料与G-四链体结构的DNA发生强烈的相互作用，由聚集体状态转为单体状态，聚集体的峰消失，出现单体峰。当加入双链结构DNA时，只有少部分菁染料由聚集体状态转为单体状态，聚集体的吸收峰强度稍有下降，同时出现单体吸收峰。
进行荧光光谱分析时，当溶液中没有DNA样品时，菁染料呈聚集体状态，只有聚集体的荧光发射峰(662nm)，不会出现单体的峰(600nm)。当加入G-四链体结构DNA时，菁染料与G-四链体结构的DNA发生强烈的相互作用，由聚集体状态转为单体状态，出现很强的单体荧光发射峰。当加入双链结构DNA时，只有少部分菁染料由聚集体状态转为单体状态，因此只出现较弱的单体荧光发射峰。
实施例2、G-四链体结构DNA的检测
1、制备反应液
1)溶液甲
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇溶液；加入20μL 200μM的样本1的磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液甲。溶液甲中，样本1DNA与菁染料的摩尔比为0.5∶1。
2)溶液乙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇溶液；加入20μL 200μM的样本2的磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液乙。溶液乙中，样本2DNA与菁染料的摩尔比为0.5∶1。
3)溶液丙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料分子的甲醇溶液，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液丙，作为对照。
2、检测
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的浓度均为4μM。避光反应9小时，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。
1)紫外可见吸收光谱分析
将检测液进行紫外可见吸收光谱分析，检测液丙的紫外可见吸收光谱图同实施例1中的检测液丙的紫外可见吸收光谱图，检测液甲的紫外可见吸收光谱见图7，检测液乙的紫外可见吸收光谱见图8。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上只有菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)，强度为0.917；检测液甲(含有四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的特征峰(659.5nm)明显减弱，强度为0.5483；检测液乙(双链结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)强度基本没有发生变化，为0.921。
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上没有出现菁染料单体的特征峰(584nm)；检测液甲(四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.1029；检测液乙(双链结构DNA)的吸收谱上没有出现菁染料单体的特征峰(584nm)。
2)荧光光谱分析
将检测液进行荧光光谱分析，检测液丙的荧光光谱图同实施例1中的检测液丙的荧光光谱图，检测液甲的荧光光谱见图9，检测液乙的荧光光谱见图10。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的发射荧光光谱上只有菁染料聚集体的荧光发射峰(662nm)，强度为0.647，而没有菁染料单体的荧光发射峰(600nm)；检测液甲(含有G-四链体结构DNA)的荧光光谱上出现菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为8.585；检测液乙(含有双链结构DNA)的荧光光谱上出现较弱的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为1.737。
实施例3、G-四链体结构DNA的检测
1、制备反应液
1)溶液甲
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的纯甲醇溶液；加入160μL 200μM的样本1的磷酸缓冲溶液(pH 8.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液甲。溶液甲中，样本1DNA与菁染料的摩尔比为4∶1。
2)溶液乙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的纯甲醇溶液；加入160μL 200μM的样本2的磷酸缓冲溶液(pH 8.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液乙。溶液乙中，样本2DNA与菁染料的摩尔比为4∶1。
3)溶液丙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料分子的纯甲醇溶液，用磷酸缓冲液(pH 8.0)定容，混匀，得到溶液丙，作为对照。
2、检测
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的浓度均为4μM。避光反应15小时，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。
1)紫外可见吸收光谱分析
将检测液进行紫外可见吸收光谱分析，检测液丙的紫外可见吸收光谱图同实施例1中的检测液丙的紫外可见吸收光谱图，检测液甲的紫外可见吸收光谱见图11，检测液乙的紫外可见吸收光谱见图12。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上只有菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)；检测液甲(四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的特征峰(659.5nm)消失；检测液乙(双链结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)强度稍有降低，为0.6238。
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上没有出现菁染料单体的特征峰(584nm)；检测液甲(四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.3079；检测液乙(双链结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.1494。
2)荧光光谱分析
将检测液进行荧光光谱分析，检测液丙的荧光光谱图同实施例1中的检测液丙的荧光光谱图，检测液甲的荧光光谱见图13，检测液乙的荧光光谱见图14。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的发射荧光光谱上只有菁染料聚集体的荧光发射峰(662nm)，强度为0.647，而没有菁染料单体的荧光发射峰(600nm)；检测液甲(含有G-四链体结构DNA)的荧光光谱上出现极强的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为51.56；检测液乙(含有双链结构DNA)的荧光光谱上出现相对较弱的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为22.5。
实施例4、G-四链体结构DNA的检测
1)将样本3和样本4分别与巯基十一酸处理过的Au片反应，使DNA分别组装到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2)将处理好的Au片放入浓度为10μM的菁染料磷酸缓冲溶液(pH 6.0)中常温下避光染色1小时；
3)取出Au片后用磷酸缓冲液反复冲洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料聚集体；
4)用氮气吹干后将Au片放到共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下，用559nm的激光激发菁染料分子的荧光，并分波长的接收菁染料分子的发射荧光图像。
见图15，从CLSM荧光图像上可以很清楚的看到菁染料聚集体标记出了Au片表面组装有DNA样品的部分，并且能够识别出组装在Au片表面的不同结构的DNA样品。
实施例5、G-四链体结构DNA的检测
1)将样本3和样本4分别与巯基十一酸处理过的Au片反应，使DNA分别组装到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2)将处理好的Au片放入浓度为0.5μM的菁染料磷酸缓冲溶液(pH 6.0)中常温下避光染色10分钟；
3)取出Au片后用磷酸缓冲液反复冲洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料聚集体；
4)用氮气吹干后将Au片放到共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下，用559nm的激光激发菁染料分子的荧光，并分波长的接收菁染料分子的发射荧光图像。
从CLSM荧光图像上可以很清楚的看到菁染料聚集体标记出了Au片表面组装有DNA样品的部分，并且能够识别出组装在Au片表面的不同结构的DNA样品。
实施例6、G-四链体结构DNA的检测
1)将样本3和样本4分别与巯基十一酸处理过的Au片反应，使DNA分别组装到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2)将处理好的Au片放入浓度为20μM的菁染料磷酸缓冲溶液(pH 6.0)中常温下避光染色300分钟；
3)取出Au片后用磷酸缓冲液反复冲洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料聚集体；
4)用氮气吹干后将Au片放到共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下，用559nm的激光激发菁染料分子的荧光，并分波长的接收菁染料分子的发射荧光图像。
从CLSM荧光图像上可以很清楚的看到菁染料聚集体标记出了Au片表面组装有DNA样品的部分，并且能够识别出组装在Au片表面的不同结构的DNA样品。

Claims (10)

1、菁染料在检测G-四链体结构DNA中的应用。
2、如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5小于等于4，避光条件下反应，对反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果菁染料聚集体特征峰的峰值小于0.01，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
3、如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将双链结构DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A′，溶液A′与溶液A的浓度相同；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于1.5；将溶液A′和溶液B混合，使混合液中双链结构DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于1.5，作为对照；避光条件下反应，对两种反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果待测DNA溶液菁染料聚集体特征峰的峰值小于对照的0.6倍，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
4、如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将双链结构DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A′，溶液A′与溶液A的浓度相同；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5小于等于4；将溶液A′和溶液B混合，使混合液中双链结构DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于1.5小于等于4，作为对照；避光条件下反应，对两种反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如果待测DNA溶液菁染料单体特征峰的峰值大于对照的1.25倍，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
5、如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于1.5，避光条件下反应，对反应后溶液进行紫外可见吸收光谱分析，如过菁染料单体特征峰的峰值大于0.1，则待测DNA为G-四链体结构DNA。
6、如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
1)将待测DNA溶于pH值6.0～8.0的缓冲液，得到溶液A；将菁染料溶解，再用pH值6.0～8.0的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与菁染料分子的摩尔比大于等于0.5小于等于4；避光条件下反应，对反应后溶液进行荧光光谱分析，如果待测DNA溶液菁染料单体特征峰的峰值为DNA浓度的3倍以上，则待测DNA为G-四链体结构DNA；所述DNA浓度的单位为μM。
7、如权利要求2-6中任一所述的应用，其特征在于：所述缓冲液为磷酸缓冲液；所述菁染料用甲醇溶解。
8、如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构DNA：
将待测DNA组装到Au表面后放入如下菁染料溶液中，避光染色10-300分钟后取出Au片，用pH值6.0～8.0的缓冲液冲洗，再对该Au片进行共聚焦激光扫描显微镜检测，所述共聚焦激光扫描显微镜检测中所用的激发光波长为559nm，如果只出现600-610nm的荧光，则待测DNA为G-四链体结构DNA；所述菁染料溶液按照如下方法配制：将菁染料溶解，再用pH值为6.0～8.0的缓冲溶液稀释，使菁染料分子浓度为0.5-20μM。
9、如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述缓冲液为磷酸缓冲液；所述菁染料浓度为10μM时，所述避光染色时间为1小时。
10、如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述待测DNA是通过与用巯基十一酸处理过的Au片反应组装到Au表面的。
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