CN109100339B - 用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒及检测方法，试剂盒包括以下组分：菁染料、Ag+标准溶液、Pb2+标准溶液、序列完全互补且能够分别形成G‑四链体和i‑motif的两条DNA单链以及pH值为6‑7的缓冲溶液。该试剂盒体系简单，可以选择性的检测Pb2+或Ag+浓度，检测方法灵敏度高，检出限低，准确性高，操作便捷，对仪器依赖性小，可适用于现场检测。
Description
技术领域
本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种用于选择性检测Pb2+和Ag+浓度的试剂盒及检测方法。
背景技术
重金属在自然界中广泛存在，在自然状态下从岩石圈扩散到水圈的速度缓慢，浓度及其微小，一般不对人体造成很大的危害。但随着人类社会的发展，尤其是科技进步以及生产技术的改进，人类对重金属的开采量大大增加，重金属被广泛应用于冶金、农业、医药、机械加工、化工合成等社会生产的各个方面。由此使重金属离子进入人类生活圈的含量大大增加，且重金属在环境中不易除去，而是长期累积，直接或间接对人体造成毒性作用，对人类的健康造成了极大的危害。
重金属对人体产生危害的方式主要分两种：一是重金属离子可改变酶的结构，如果体内重金属离子的浓度过高，会与体内蛋白质分子的活性基团紧密结合，改变酶的立体构型，或者改变酶活性中心的电荷，使酶丧失其催化功能；二是有些重金属离子可干扰人体内必需金属离子的代谢，造成体液中金属离子浓度异常，进而影响细胞的正常生理功能，对人体造成极大的危害。
随着近年来人类社会工业的迅速发展，重金属污染的事件屡见不鲜。铅中毒会影响神经及消化系统运作，表现有注意力不集中、多动症、攻击性行为、头痛等，严重者可致命。通常铅中毒的方式是食入或呼吸，这两种方式儿童吸收铅的比例都高于成人。儿童铅中毒会导致永久智力损伤和行为异常。另外， 2010年湖南梆州的大批儿童血铅中毒事件，2016年3月美国2000个自来水系统的重金属铅污染事件无不体现出重金属污染的严重性。
重金属离子的检测方法多样，较为传统的包括原子吸收法(AAS)、紫外可见分光光度法(UV)、紫外荧光法(AFS)、电子耦合等离子体法(ICP)、X荧光光谱(XRF)、电子耦合等离子质谱法(ICP-MS)等。但这些方法存在灵敏度不高，准确性不高，不适用于现场检测且不能选择性的检测多个重金属离子等缺点。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于选择性检测Pb2+和 Ag+浓度的试剂盒及检测方法，该试剂盒体系简单，可以选择性的检测Pb2+或 Ag+浓度，检测方法灵敏度高，检出限低，准确性高，操作便捷，对仪器依赖性小，可适用于现场检测。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于选择性检测Pb2+和Ag+浓度的试剂盒，包括以下组分：菁染料、 Ag+标准溶液、Pb2+标准溶液、序列完全互补且能够分别形成G-四链体和i-motif 的两条DNA单链和以及pH值为6-7的缓冲溶液；
其中，菁染料的结构式为：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、 Se、Te。
进一步地，菁染料的结构式为：
进一步地，能够形成G-四链体的DNA单链的序列为： 5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数， b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基。
进一步地，能够形成G-四链体的DNA单链的序列为： 5′-GGTGGTGGTGGT-3′、5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′、 5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′、5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′、 5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′或5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
进一步地，能够形成i-motif的DNA单链的序列为： 5′-Cn1Xm1Cn2Xm2Cn3Xm3Cn4Xm4-3′；其中，n1-n4代表C的个数且为大于2的整数， m1-m4代表X的个数且为0-3的整数，X表示A、T或G碱基。
进一步地，能够形成i-motif的DNA单链的序列为： 5′-CCACCACCACCACAACCACCACCAAA-3′、 5′-CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA-3′、 5′-CCCACCCACCCACCC-3′、5′-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3′、 5′-CCAACCACACCAACC-3′或5′-ACTCCCACCCCTCCCACCCCTT-3′。
进一步地，Ag+标准溶液为AgNO3溶液，Pb2+标准溶液为PbCl2溶液；缓冲溶液为pH值为6.5，浓度为10mM的Tris-HAc溶液。
采用上述试剂盒选择性检测Pb2+和Ag+浓度的方法，包括以下步骤：
(1)将缓冲溶液、Pb2+标准溶液、能够形成G-四链体的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，制作Pb2+检测标准曲线；
(2)将缓冲溶液、Ag+标准溶液、序列完全互补且能够分别形成G-四链体和i-motif的两条DNA单链以及菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育 15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，制作Ag+检测标准曲线；
(3)将缓冲溶液、待测样品、能够形成G-四链体的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，结合Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度；
(4)将缓冲溶液、待测样品、序列完全互补且能够分别形成G-四链体和 i-motif的两条DNA单链以及菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育 15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，结合Ag+检测标准曲线，计算出Ag+浓度。
进一步地，检测过程中菁染料的终浓度为4×10-6mol/L。
进一步地，检测过程中能够形成G-四链体的DNA单链和能够形成i-motif 的DNA单链的终浓度均为4×10-6mol/L。
本发明提供的用于选择性检测Pb2+和Ag+浓度的试剂盒及检测方法，具有以下有益效果：
(1)灵敏度高，具体表现在重金属离子对于DNA的二级结构有明显的调控作用，即DNA二级结构在低浓度的重金属离子条件下即可发生结构的转化，同时，菁染料对于不同的DNA二级结构有良好的识别反应能力，可将DNA结构的变化转变为可识别的光学信号。
(2)高特异性，具体表现在不同重金属离子对DNA二级结构的调控作用不同，且针对不同的DNA二级结构，通过菁染料识别的信号差异大。
(3)本发明检测方法对所检测的离子具有选择性，当选择检测Pb2+浓度时，就使用能够形成G-四链体的DNA单链，而要选择检测Ag+浓度时，则使用序列完全互补的两条DNA单链，其中一条DNA单链能够形成G-四链体，另一条 DNA单链能够形成i-motif结构。
(4)本发明提供的检测试剂盒，可用于制备生物传感器，实现多通道并行性检测，可将多路输入选择一路进行输出，且通道之间不会互相影响，其操作便捷，对仪器依赖性小，可适用于现场检测。
附图说明
图1为实施例1条件下制作Pb2+检测标准曲线图。
图2为实施例2条件下制作Ag+检测标准曲线。
图3为实施例5中Pb2+检测干扰实验结果图。
图4为实施例6中Ag+检测干扰实验结果图。
具体实施方式
本发明提供的用于选择性检测Pb2+和Ag+浓度的试剂盒，包括以下组分：
(1)试剂I为菁染料溶液，用于识别体系中特殊的DNA二级结构，并将其转换为可检测的荧光信号，检测过程中其终浓度为4×10-6mol/L。
上述试剂I(菁染料)的结构式如下：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、 Se、Te。
(2)试剂II为缓冲液10mM Tris-HAc(含5mM NaNO3)，pH＝6.5。
(3)试剂III为PbCl2溶液(Pb2+标准溶液)，用于诱导富G序列形成G-四链体的特殊结构，检测过程中其终浓度为0-500×10-9mol/L。
(4)试剂IV为AgNO3溶液(Ag+标准溶液)，用于诱导富C序列形成i-motif 的特殊结构，检测过程中其终浓度为0-12×10-6mol/L。
(5)试剂V为富含G碱基的DNA单链(Pb2+响应序列)，用于形成G-四链体结构，检测过程中其终浓度为2-20×10-6mol/L。
富G序列通式为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；
其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3 的整数，Y表示A、T或C碱基。
(6)试剂VI为富含C碱基的DNA单链(Ag+响应序列)，用于形成i-motif 结构，检测过程中其终浓度为2-20×10-6mol/L。
富C序列通式为：5′-Cn1Xm1Cn2Xm2Cn3Xm3Cn4Xm4-3′；
其中，n1-n4代表C的个数且为大于2的整数，m1-m4代表X的个数且为 0-3的整数，X表示A、T或G碱基。
(7)试剂VII为Pb2+响应序列和Ag+响应序列按体积比为1：1形成的互补链与KNO3的混合溶液，KNO3用于诱导富G序列形成G-四链体的特殊结构，终浓度为1-100×10-3mol/L，检测过程中DNA互补链的终浓度为2-20×10-6mol/L。
(8)金属离子(Mn2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Ni2+、Cd2+、Cu2+及Zn2+)的一系列溶液，用于检验方法的抗干扰能力(特异性检测)。
采用上述试剂盒进行选择性检测Pb2+和Ag+浓度的方法，其原理为：通过设计合理的碱基序列，以能够特异性识别Pb2+和Ag+的DNA序列即能够形成G- 四链体的DNA单链可特异性识别Pb2+，序列完全互补的DNA双链，其中一条 DNA单链能够形成G-四链体，另一条DNA单链能够形成i-motif结构，该DNA 双链可特异性识别Ag+，以此为基础，通过重金属离子Pb2 +和/或Ag+对DNA二级结构的调控作用，利用菁染料对特定DNA结构的识别，检测样品中Pb2+和 Ag+的浓度。
检测方法具体见以下实施例：
实施例1 Pb2+检测标准曲线的绘制
取10只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，分别做以下处理：
在1号EP管中加入920μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入910μL试剂II，然后加入10μL浓度为10-6mol/L的试剂 III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入900μL试剂II，然后加入20μL浓度为10-6mol/L的试剂 III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
在4号EP管中加入870μL试剂II，然后加入50μL浓度为10-6mol/L的试剂 III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液4；
在5号EP管中加入840μL试剂II，然后加入80μL浓度为10-6mol/L的试剂 III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
在6号EP管中加入820μL试剂II，然后加入100μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液6；
在7号EP管中加入770μL试剂II，然后加入150μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
在8号EP管中加入720μL试剂II，然后加入200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8；
在9号EP管中加入620μL试剂II，然后加入200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
在10号EP管中加入420μL试剂II，然后加入500μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液10。
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。以各个溶液中Pb2+的终浓度为横坐标，各浓度条件下的荧光强度为纵坐标作标准曲线，结果如图1所示，并进行线性拟合。
线性系数R2＝0.99973，表明在该Pb2+浓度范围内，检测得到的荧光强度值与Pb2+浓度之间有很好的线性关系。
通过线性拟合，得到回归方程为y＝0.43844x+20.95581。其中x为体系中Pb2+的浓度，y为对应Pb2+浓度下的荧光强度。根据检测所得荧光强度即可计算出对应的Pb2+浓度。
实施例2 Ag+检测标准曲线的绘制
取12只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，分别做以下处理：
在1号EP管中加入920μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入915μL试剂II，然后加入5μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入910μL试剂II，然后加入10μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
在4号EP管中加入900μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液4；
在5号EP管中加入895μL试剂II，然后加入25μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
在6号EP管中加入890μL试剂II，然后加入30μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液6；
在7号EP管中加入880μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
在8号EP管中加入870μL试剂II，然后加入50μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8；
在9号EP管中加入860μL试剂II，然后加入60μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
在10号EP管中加入840μL试剂II，然后加入80μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育 20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液10；
在11号EP管中加入820μL试剂II，然后加入100μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育 20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液11；
在12号EP管中加入800μL试剂II，然后加入120μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育 20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液12；
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。以各个溶液中Ag+的终浓度为横坐标，各浓度条件下的荧光强度为纵坐标作标准曲线，结果如图2所示，在1至8×10-6mol/L的浓度范围下进行线性拟合。
线性系数R2＝0.98891，表明在该Ag+浓度范围内，检测得到的荧光强度值与Ag+浓度之间有很好的线性关系。
通过线性拟合，得到回归方程为y＝9.2424x-5.3422。其中x为体系中Ag+的浓度，y为对应Ag+浓度下的荧光强度。根据检测所得荧光强度即可计算出对应的Ag+浓度。
实施例3
在实施例1的条件下进行Pb2+浓度测定，验证本发明检测方法检测Pb2+浓度的能力。
取3只EP管，标号为1、2和3，分别做以下处理：
在1号EP管中加入840μL试剂II，然后加入80μL浓度为10-6mol/L的试剂 III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入720μL试剂II，然后加入200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入420μL试剂II，然后加入500μL浓度为10-6mol/L的试剂III，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。将各个荧光强度代入Pb2+检测标准曲线方程中，即按下式计算该荧光强度下对应的Pb2+浓度：y＝0.43844x+20.95581。
重复测定2次，进一步计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)，计算结果见表1。
表1 Pb2+回收试验统计结果
由统计计算结果可见，该方法对Pb2+有较好的检测能力。
实施例4
在实施例2的条件下进行Ag+浓度测定，验证本发明检测方法检测Ag+浓度的能力。
取3只EP管，标号为1、2和3，分别做以下处理：
在1号EP管中加入900μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入880μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入870μL试剂II，然后加入50μL浓度为100×10-6mol/L的试剂IV，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处荧光强度，记为FIN1b。将各个荧光强度代入Ag+检测标准曲线方程中，即按下式计算该荧光强度下对应的Ag+的浓度：y＝9.2424x-5.3422。
重复测定2次，进一步计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。
表2 Ag+回收试验统计结果
由统计计算结果可见，该方法对Ag+有较好的检测能力。
实施例5
取11只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，分别做以下处理：
在1号EP管中加入920μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号至10号EP管中分别加入900μL试剂II，及20μL浓度为100×10-6mol/L 金属离子(Mn2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+和Ag+)溶液，40μL 浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL 浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2至10；
在11号EP管中加入720μL试剂II、200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液11；
将1至11号溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度，再进行归一化处理，如图3。
进一步可得出结论：在进行Pb2+检测时，其他金属离子无干扰作用。
实施例6
取11只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，分别做以下处理：
在1号EP管中加入920μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号至10号EP管中分别加入820μL试剂II，及100μL浓度为 100×10-6mol/L金属离子(Mn2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+和 Pb2+)溶液，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育 20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2至10；
在11号EP管中加入915μL试剂II、5μL浓度为10-6mol/L的试剂IV，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液11；
将1至11号溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度，再进行归一化处理，如图4。
进一步可得出结论：在进行Ag+检测时，其他金属离子无干扰作用。
其中，实施例1-6中使用的试剂I的菁染料的结构式如下：
DNA双链是通过以下方式制得的，即将富C序列的DNA单链和富G序列的DNA单链等体积混合，于90℃加热2-15min，再自然冷却至室温，制得。
其中，富C序列的DNA单链浓度为50×10-6mol/L，序列为：
5′-CCACCACCACCACAACCACCACCAAA-3′；
富G序列的DNA单链浓度为50×10-6mol/L，序列为5′-GGTGGTGGTGGT-3′。
但本发明并不限于上述菁染料结构和DNA序列，还可以为以下结构的菁染料和DNA序列：
菁染料结构：
DNA序列：
5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′；
5′-CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA-3′；
5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′；
5′-CCCACCCACCCACCC-3′；
5′-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3′；
5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′；
5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′；
5′-CCAACCACACCAACC-3′；
5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′；
5′-ACTCCCACCCCTCCCACCCCTT-3′。
实施例7水溶液样本中Pb2+和Ag+浓度的检测
取电镀废水，过滤除去杂质，作为待测样品，将待测样品稀释50倍，根据本发明检测方法、传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法分别检测待测样品中Pb2+和Ag+浓度，Pb2+和Ag+浓度检测结果分别见表3和表4：
表3 Pb2+浓度检测结果
| 本发明检测方法 | 原子吸收法 | 紫外可见分光光度法 | |
| 样品1 | 0.82mg/L | 0.70mg/L | 0.65mg/L |
| 样品2 | 0.80mg/L | 0.65mg/L | 0.61mg/L |
| 样品3 | 0.85mg/L | 0.67mg/L | 0.53mg/L |
表4 Ag+浓度检测结果
| 本发明检测方法 | 原子吸收法 | 紫外可见分光光度法 | |
| 样品1 | 1.48mg/L | 1.25mg/L | 1.10mg/L |
| 样品2 | 1.49mg/L | 1.30mg/L | 1.02mg/L |
| 样品3 | 1.46mg/L | 1.20mg/L | 1.19mg/L |
由表3和表4可知，采用本发明方法检测电镀废水中Pb2+和Ag+浓度，其准确性明显比传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法要高，平行样品之间的差异相对较小。
当对电镀废水再次进行稀释，当稀释倍数依次增加，即废水中Pb2+和Ag+浓度依次降低时，采用传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法均检测不出废水中的Pb2+和Ag+，而采用本发明检测方法仍然能够检测得到，继续对废水进行稀释，稀释倍数再次增加10倍时，采用本发明检测方法仍然能够检测到较少量 Pb2+和Ag+，继续稀释2倍和4倍，稀释4倍时才检测不出Pb2+和Ag+浓度，说明本发明检测方法的灵敏度明显比传统方法高，检出限低。
本发明检测方法，不仅仅是能检测电镀废水中的Pb2+和Ag+浓度，还可以检测其他水溶液样本，如城市生活废水、其他工业废水、血清、尿液等，此外还可以检测固体中的Pb2+和Ag+浓度，如土壤等。
注：本发明中所出现的菁染料，其结构式、分子式和命名分别如下：
1、
结构式：
分子式为：C38H45N3O6S4；
命名：3,3′-双(3-磺酸基-丙基)-4,5,4′,5′-二苯基-9-甲基-三碳苯并噻唑菁染料三乙胺盐。
2、
结构式：
分子式为：C39H57BrN2O2；
命名：3,3′-双甲基-4,4′-双己基-5,5′-双甲基-9-己基-三碳苯并
唑菁染料溴盐。
3、
结构式：
分子式为：C38H55IN2S2；
命名：3,3′-双丙基-5,5′-双己基-9-异丙基-三碳菁苯并噻唑染料碘盐。
4、
结构式：
分子式为：C40H40ClN3；
命名：3,3′-双异丙基-4,5-二吡啶基-4′,5′-二苯基-9-间二甲基苯基-三碳苯并吡咯菁染料氯盐。
5、
结构式：
分子式为：C34H39IN2OS；
命名：3-甲基-4,5-二苯基苯并
唑--3′-丙基-4′,5′-二环庚烷基苯并噻唑-9-丁基-三碳菁染料碘盐。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒及检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggtggtg gt 12
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggtggtg gtgttggtgg tggtggttt 29
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtgggtgg gtggg 15
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggattggga ttgggattgg gatt 24
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgagggtggg gagggtgggg aa 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaccaccac cacaaccacc accaaa 26
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaccaccac cacaaccacc accaccaaa 29
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccacccacc caccc 15
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccctaaccct aaccctaacc ctaa 24
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccaaccacac caacc 15
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actcccaccc ctcccacccc tt 22
Claims (8)
1.一种用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：菁染料、Ag+标准溶液、Pb2+标准溶液、序列完全互补且能够分别形成G-四链体和i-motif的两条DNA单链以及pH值为6-7的缓冲溶液；
其中，菁染料的结构式为：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te；
能够形成G-四链体的DNA单链的序列为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基；
能够形成i-motif的DNA单链的序列为：5′-Cn1Xm1Cn2Xm2Cn3Xm3Cn4Xm4-3′；其中，n1-n4代表C的个数且为大于2的整数，m1-m4代表X的个数且为0-3的整数，X表示A、T或G碱基。
2.根据权利要求1所述的用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒，其特征在于，菁染料的结构式为：
3.根据权利要求1所述的用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒，其特征在于，能够形成G-四链体的DNA单链的序列为：5′-GGTGGTGGTGGT-3′、5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′、5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′、5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′、5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′或5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
4.根据权利要求1所述的用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒，其特征在于，能够形成i-motif的DNA单链的序列为：5′-CCACCACCACCACAACCACCACCAAA-3′、5′-CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA-3′、5′-CCCACCCACCCACCC-3′、5′-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3′、5′-CCAACCACACCAACC-3′或5′-ACTCCCACCCCTCCCACCCCTT-3′。
5.根据权利要求1所述的用于选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的试剂盒，其特征在于，Ag+标准溶液为AgNO3溶液，Pb2+标准溶液为PbCl2溶液；缓冲溶液为pH值为6.5，浓度为10mM的Tris-HAc溶液。
6.采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将缓冲溶液、Pb2+标准溶液、能够形成G-四链体的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，制作Pb2+检测标准曲线；
(2)将缓冲溶液、Ag+标准溶液、序列完全互补且能够分别形成G-四链体和i-motif的两条DNA单链以及菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，制作Ag+检测标准曲线；
(3)将缓冲溶液、待测样品、能够形成G-四链体的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，结合Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度；
(4)将缓冲溶液、待测样品、序列完全互补且能够分别形成G-四链体和i-motif的两条DNA单链以及菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，结合Ag+检测标准曲线，计算出Ag+浓度。
7.根据权利要求6所述的选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的方法，其特征在于，检测过程中菁染料的终浓度为4×10-6mol/L。
8.根据权利要求6所述的选择性检测Pb离子和Ag离子浓度的方法，其特征在于，检测过程中能够形成G-四链体的DNA单链和能够形成i-motif的DNA单链的终浓度均为4×10-6mol/L。
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