CN104745589B - 一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异识别链霉素的核酸适配子筛选方法，其步骤为：A、环氧基凝胶与链霉素偶联；B、制备阴极柱和阳极柱；C、构建ssDNA随机文库，对链霉素亲和性较高的适配子的筛选及测定；D、荧光法鉴定最高亲和性、特异性识别链霉素的核酸适配子。本发明还将筛选到的核酸适配子应用于定性及定量检测食品中的链霉素。本发明提供的筛选方法条件严谨度高，易于消除其他因素干扰，所筛选的适配子不仅具有很高的亲和力和高度的特异识别性，而且能够降低假阳性的出现，是一种简单、快速、科学、精准筛选适配子的新方法，将筛选到的核酸适配子与胶体金比色法相结合，能够简单、快速、准确地检测链霉素，可广泛应用于食品、卫生及进出口检验等多个领域。

Description

一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地说是一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法和应用。

背景技术

链霉素（streptomycin）是一种广谱氨基糖苷类抗生素，可抑制革兰氏阴性杆菌和部分革兰氏阳性杆菌的，广泛应用于医药、农业及畜牧业中。但是，在实际使用中，由于使用不合理或非法使用，导致其在肉类、肝脏、肾脏、牛奶和蜂蜜等动物源性食品中的大量残留，严重地危害了人类健康，可使人产生一系列过敏反应和肾毒性、耳毒性等病症，甚至会导致失聪。因此，FDA、欧盟和我国等许多国家和地区均对链霉素的最大残留限量做了严格的规定，可见，检测链霉素在食品中是否有残留以及残留量多少具有重要的意义。

目前，链霉素残留的检测方法主要有以下三种。第一，微生物法。微生物法依赖于抗生素对微生物的生理机能、代谢过程的抑制作用，主要有琼脂扩散法、纸片法、杯碟法、TTC法等。此类方法检测链霉素所需设备简单、花费低廉，适用于大批量样品的检测，但是此方法耗时长、稳定性差、灵敏度低，不能满足链霉素的准确高效测定的要求。第二，仪器分析法。主要有气相色谱、液相色谱、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等。仪器分析法是一种可靠灵敏的方法，具有高效率、高速度分离，操作自动化的特点，但是也存在如下缺陷。如液相色谱法在应用中由于链霉素为非挥发性化合物，且在紫外可见光区无吸收，所以采用气相色谱的方法时，样品脱蛋白后，检测需要用三甲基咪唑、七氟丁酰咪唑进行柱后衍生或者荧光标记，这就导致实验操作繁琐；而且液相色谱都需要进行样品前处理，昂贵的仪器还有专业的人员操作，因此其应用受到一定限制。如毛细管电泳法相对于液相色谱法具有样品用量少的优点，常见的分离模式是毛细管区带和胶束电动，但是因为其检测器是传统的分光光度检测器，检测的灵敏度很低，所以用其检测氨基糖苷类的报道很少。如薄层色谱法是一种微量、操作简单的色谱分离方法，且链霉素具有伯氨基，显色剂中的茚三酮可与伯氨基发生显色反应，因此能够实现链霉素的检测，但是该方法灵敏度和准确性不高，不适合定量检测。第三，免疫法检测。许多基于抗原抗体反应的免疫反应也能检测链霉素：如酶联免疫、化学发光免疫、荧光免疫以及免疫胶体金等。这些方法在食品检测方面与液相色谱相比，具有简单、高特异性、高灵敏性、适于大批量检测的优点。但是，制备单克隆抗体花费大量的时间和金钱，而且不同批次间性能也不稳定，尤其是小分子的抗体不能直接筛选，小分子属于半抗原，只有修饰后小分子才能产生抗体。可见，当前这些检测小分子链霉素的方法并不十分完善，所以建立一种新的快速、精确、灵敏、经济的检测链霉素残留的方法是行业内积极探索的课题。

适配子是用SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸序列库中人工筛选出的与靶标有高亲和力和特异性的寡核苷酸序列，它可特异性识别并结合蛋白、小分子、离子、细胞等靶物质。由于链霉素等小分子抗体制备较为困难，所以适配子作为检测小分子物质的分析工具，将具有广阔的应用前景。SELEX技术利用大容量的随机寡核甘酸文库与靶分子的相互作用，从中筛选出与靶分子特异性结合的寡核苷酸并结合体外PCR扩增技术，使其得到指数级富集，如此循环数轮最终进化成为高亲和力和高特异性的寡核苷酸配体。到目前为止，人们已筛选了许多小分子物质的特异性适配子，并以适配子为基础开发了一系列小分子物质的检测系统。但是，目前在国内外的研究中，还没有发现关于特异性识别链霉素的适配子以及利用筛选到的适配子对链霉素进行快速、准确定性及定量检测的相关报道。究其原因，主要是由于采用现有通用的SELEX技术筛选适配子不仅存在方法步骤繁杂，更主要的是筛选到的适配子假阳性高、亲和性和特异性差，根本达不到应用的需求。因此，开发一种用于筛选亲和性高、特异识别小分子链霉素的适配子的方法，并将筛选到的适配子应用于链霉素的检测中具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种特异性识别链霉素的核酸适配子的筛选方法，以解决现有普通适配子的筛选方法步骤复杂，所筛选的适配子假阳性高、亲和性和特异性差的问题。

本发明的目的之二是利用所述筛选方法获得的特异性识别链霉素的适配子在检测链霉素中的应用，以解决现有技术检测链霉素存在要么检测工序繁琐、费时费力、成本较高，要么精确度和灵敏性相对较差的问题。

本发明是这样实现的：一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法，包括以下步骤：

（A）将环氧基活化凝胶与链霉素偶联缓冲液按体积比为3:10混合，35-37℃孵育15-18h，用PBS溶液洗涤，加入乙醇胺进行封闭，室温孵育1-2 h；洗涤，抽滤干燥，得链霉素-环氧基凝胶偶联复合物；所述链霉素偶联缓冲液为每毫升含20mg链霉素的0.1mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液；

（B）将所述链霉素-环氧基凝胶偶联复合物装入层析柱内，洗脱，得阳极柱；同时将没有偶联链霉素的环氧基活化凝胶洗涤，装入层析柱内，得阴极柱；

（C）构建ssDNA随机文库，设计80 bp的单链寡核苷酸随机文库，中间为40 bp随机序列，两端分别为20 bp固定序列，序列全长为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’；

（D）将500 pmol所述ssDNA随机文库溶解于1ml结合缓冲液中，95-100℃预变性5min，4℃冷却10 min，得ssDNA随机文库结合缓冲液；将所述ssDNA随机文库结合缓冲液加入到阴极柱内，36-37℃孵育10-15 min，收集未与阴极柱内物质结合的ssDNA随机文库结合缓冲液，加入到阳极柱内，36-37℃孵育1-1.5 h后，用淋洗缓冲液淋洗，再加入洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱缓冲液，除杂质，使洗脱缓冲液中的ssDNA沉淀，得ssDNA沉淀；

（E）将所述ssDNA沉淀溶解，以溶解后的ssDNA为模板，加入生物素标记的上游引物和荧光标记的下游引物进行对称PCR扩增，将扩增产物纯化，得纯化产物；

（F）在纯化产物中加入等体积的链霉亲和素磁珠，37℃孵育30 min，磁分离已结合纯化产物的链霉亲和素磁珠，洗涤，解链，得荧光标记的ssDNA，将所述荧光标记的ssDNA作为第二轮筛选的次级文库，以次级文库为模板溶解于结合缓冲液中，加入阳极柱内，37℃孵育1 h，淋洗，洗脱，沉淀，溶解，对称PCR扩增，纯化，磁珠分离，解链，得到的ssDNA作为第三轮筛选的次级文库，如此循环筛选10轮，以最后一轮筛选到的荧光标记的ssDNA作为模板，加入上游引物和下游引物进行对称PCR扩增，得扩增产物；将所述扩增产物连接pUCM-T载体，转入大肠杆菌，挑取含ssDNA单克隆质粒进行测序，得到与链霉素亲和性较高的ssDNA核苷酸序列；

（G）取步骤（F）中含有与链霉素亲和性较高的ssDNA所述对应的转化菌进行培养，提取质粒，以所述质粒为模板，加入生物素标记的上游引物和荧光标记的下游引物进行对称PCR扩增，纯化，将纯化产物用所述链霉亲和素磁珠37℃孵育30 min，磁分离，洗涤，解链，获得不同核苷酸序列的荧光标记的ssDNA；

（H）将每种荧光标记的ssDNA分别溶解于结合缓冲液中，加入到阳极柱内，37℃孵育30 min，用淋洗缓冲液淋洗，加入洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱缓冲液，检测洗脱缓冲液的荧光强度，将洗脱缓冲液所测得的荧光强度与加入阳极柱最初的荧光标记的ssDNA的荧光强度相比较，其荧光强度最大的所对应的ssDNA即为特异识别链霉素的最高亲和力核酸适配子，其核苷酸序列为：CCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTC（见SEQ ID NO:1）。

本发明所述核苷酸适配子加上固定序列后其核苷酸序列为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCCAGTAT GAGCGAGCGTTGCG-3’，其二级结构特征如图1所示。

本发明步骤（D）和步骤（H）所述的结合缓冲液包括20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和5 mmol/L MgCl₂，其pH值为8.0。

本发明步骤（D）和步骤（H）所述的淋洗缓冲液包括20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L MgCl₂和质量比浓度为0.01%的Tween20，其pH值为8.0。

本发明步骤（D）和步骤（H）所述的洗脱缓冲液包括20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L MgCl₂和10 mmol/L的链霉素，pH值为8.0。

本发明步骤（E）、（F）和（G）中所述的上游引物为：5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’、下游引物为：5’-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3’；步骤（E）和步骤（G）中所述的生物素标记的上游引物为：5’-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’；所述的荧光标记的下游引物为：5’-FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3’。

本发明步骤（E）、（F）和（G）所述对称PCR扩增的体系为为浓度均为10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，ddNTP 1 μL，buffer 2 μL，Taq酶0.1 μL，无菌水15.4 μL；扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，68℃退火45 s，72℃延伸45 s，6轮循环。

本发明步骤（C）所述的构建构建ssDNA随机文库是利用Oligo 6.0和primerpremier 5.0设计80bp的随机单链寡核苷酸文库，中间为40bp的随机序列，两端分别为20bp的固定序列，全长为80bp的ssDNA随机文库为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’。

本发明步骤（F）所述的循环筛选10轮中，每三轮筛选进行一次反筛选，所述反筛选是将筛选到的300 pmoL次级文库溶于结合缓冲液中定容至1 mL，95℃变性2 min，放置4℃水浴10 min，加入到所述阴极柱中，36-37℃孵育10 min，收集未与阴极柱内物质结合的ssDNA，作为下一轮筛选的次级文库。

本发明提供的特异性识别链霉素的筛选方法利用指数富集配基系统进化法技术，经亲和色谱法从随机ssDNA随机文库筛选链霉素特异结合的寡核苷酸适配子，筛选条件严紧度高，易于消除其他因素干扰，本发明提供的方法筛选到的适配子通过荧光法鉴定和Kd值的检测得知，其对链霉素具有很高的亲和力和高度的特异性。可见，本发明所筛选的适配子不仅具有很高的亲和力和高度的特异识别性，而且能够避免适配子假阳性的出现，所筛选到的核酸适配子能够在链霉素的检测中广泛地应用。

本发明提供的筛选方法科学严谨、成本低、稳定性好，是一种快速、科学、精准、操作性好的筛选适配子的新方法，同时，该方法也为其他小分子物质检测提供了新的思路，其应用前景广阔。

通过本发明所述的筛选方法得到的如SEQ ID NO:1所示的特异识别链霉素的核酸适配子在链霉素检测中的应用。

一种定性及定量测定链霉素的方法，包括以下步骤：

（a）制备胶体金：将20 mL质量比浓度为0.015%的HAuCl₄加热煮沸，边搅拌边加入500 μL质量比浓度为0.95%的柠檬酸钠，溶液变色后，煮沸并持续8min，冷却至室温，得胶体金；

（b）定性检测：以50 µL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将两者混合，室温孵育0.8 h，制得了适配子标记的胶体金；在适配子标记的胶体金中加入待测样品，若溶液颜色为酒红色，则待测样品中链霉素浓度小于200 nmol/L；若溶液颜色由酒红色变为紫色，则待测样品中链霉素的浓度为200~800 nmol/L；若溶液颜色由酒红色变为蓝色，则待测样品中链霉素的浓度为大于800 nmol/L；所述特异识别链霉素的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示；

（c）定量检测：在步骤（b）制得的适配子标记的胶体金中加入浓度分别为25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素，室温孵育1 h，加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl，在波长为A520和A620分别测定其吸光值，以链霉素的浓度为横坐标，以同一浓度链霉素所述测得的A620和A520的比值为纵坐标，作链霉素浓度与A620/520比值的曲线图，拟合其标准曲线；测定样品时，将待测样品加入到适配子标记的胶体金中，测定其在波长为A520和A620的吸光值，求A620/520比值，将其带入标准曲线中得到所对应的链霉素含量值，即为待测样品中所含链霉素的含量。

本发明将上述筛选的高亲和性、特异识别链霉素的核酸适配子与胶体金比色法相结合，建立了基于寡核苷酸适配子的链霉素新型检测方法，可简单、快速、准确、经济、特异地对链霉素进行定量或定性检测，为开发新型链霉素分析方法或检测工具奠定良好基础，同时也为其他小分子物质的检测提供思路，可以在食品、卫生及进出口检测等领域得到广泛应用。

附图说明

图1为本发明核酸适配子的二级结构特征图。

图2环氧基活化凝胶与链霉素-环氧基凝胶偶联复合物的红外图谱。其中图中a为链霉素-环氧基凝胶偶联复合物，b为环氧基活化凝胶。

图3氨基磁珠与链霉亲和素磁珠的红外图谱。其中图中a为氨基磁珠，b为链霉亲和素磁珠。

图4每轮筛选PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图5每轮筛选PCR产物的荧光值。

图6为荧光标记法测定的适配子亲和力结果图。

图7为本发明实施例1中适配子A17、A25以及A15的二级结构特征图。

图8为不同浓度的链霉素与适配子标记胶体金聚沉状态图。

图9为不同浓度的链霉素加入标记适配子的胶体金的光谱图。

图10为A₆₂₀/A₅₂₀比值与链霉素浓度关系曲线图。

图11为A₆₂₀/A₅₂₀比值与链霉素浓度的标准曲线图。

图12为链霉素及对比例的定性检测图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1 特异识别链霉素的核酸适配子的获得

（1）环氧基凝胶与链霉素的偶联：取3 ml环氧基活化凝胶用双蒸水洗五次，然后抽滤干燥；将干燥后的环氧基活化凝胶中加入到10 ml含20 mg/ml链霉素的0.1mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃偶联缓冲液（pH值为10.5）中，37℃孵育16h；反应结束后，将孵育产物用0.1mol/L的PBS溶液冲洗三次，再加入1 mol/L的乙醇胺进行封闭，室温孵育1 h；封闭后的凝胶偶合物依次用5倍的去离子水、0.1 mol/L含0.5 mol/L NaCl的HAc-NaAc缓冲液（pH值为4.0）、去离子水、0.1 mol/L含0.5 mol/L NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液（pH值为8.0）和去离子水充分洗涤，抽滤干燥，去除了未反应的配基，得链霉素-环氧基凝胶偶联复合物；将链霉素-环氧基凝胶偶联复合物重悬于4℃的质量比浓度为20%的乙醇溶液中备用；将所得的链霉素-环氧基凝胶偶联复合物与环氧基活化凝胶进行红外检测，验证其偶联结果，结果见图2所示。环氧基开环形成C-O键和C-N键，从图2中可以看出链霉素-环氧基凝胶偶联复合物在1180 cm^-1处有一特征峰，环氧基活化凝胶在此处无特征峰，而此峰就是由C-N伸缩震动产生的，这说明链霉素已通过化学反应固定在环氧基凝胶上。

（2）阳极柱和阴极柱的制备：

阳极柱的制备：将3 mL链霉素-环氧基凝胶偶联复合物装入亲和层析柱空柱中，用1 mol/L NaCl溶液分5洗进行洗脱，每次10 mL，洗脱总体积50 mL（每次洗脱必须保证凝胶浸于液体中）再用去离子水洗10个柱体积，得阳极柱，最后保存于10 mL质量百分比为20%的乙醇溶液中；

阴极柱的制备：将3 mL未与链霉素偶合的环氧基活化凝胶用10-20倍体积的去离子水冲洗5次，以除去DMSO，在砂芯漏斗中抽干，转移至10 mL的亲和层析柱中，得阴极柱。

（3）构建ssDNA随机文库：

利用Oligo6.0和primer premier 5.0设计80 bp的随机单链寡核苷酸（singlestrand DNA，ssDNA）文库，中间为40 bp随机序列，两端分别为20 bp固定序列，具体序列全长为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’。

设计PCR扩增引物如下：

上游引物P1：5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’，

生物素标记的上游引物P2：5’-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’；

下游引物P3：5’-CGCAACGC TCGCTCATACTG-3’，

荧光标记的下游引物P4：5’-FAM-CGCAACGC TCGCTCATACTG-3’。

所述ssDNA随机文库序列及上、下游引物及标记引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

（4）适配子筛选与鉴定：

a、偶联：取步骤（3）合成的ssDNA随机文库500 pmol溶解于1ml结合缓冲液（包括20mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和5 mmol/L MgCl₂，pH值为8.0）中，100℃变性5 min，4℃冷却10 min后，将其加入到阴极柱内，37培养箱中孵育10 min，收集未与阴极柱内环氧基活化凝胶相结合的ssDNA随机文库加入到阳极柱内，37℃孵育1 h；然后用淋洗缓冲液（包括20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl₂和质量比浓度为0.01%的Tween20，pH值为8.0）淋洗200个柱体积，流出速度1 mL/min，最后加入1 mL洗脱缓冲液（包括20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl₂和10 mmol/L的链霉素，pH值为8.0），洗脱五次，收集每次洗脱缓冲液，在收集的洗脱缓冲液中加入洗脱液1/10体积的3 mol/L NaAc，使其最终浓度为0.3 mol/L，充分混匀后加入等体积的预冷异丙醇，-20℃静置过夜，在4℃下，12000 rpm离心15 min，弃上清，用质量比浓度为70%的乙醇溶液洗两次（12000 rpm离心15 min），小心移出上清液，滤纸吸去管壁上所有的液滴，于室温下以使残留的液体挥发至干，得ssDNA沉淀，记为（1，目）；

b、对称PCR扩增：将ssDNA沉淀用60℃预热的100 μL ddH₂O溶解，以0.5 μL溶解后的ssDNA为模板，用生物素标记的上游引物P₂（5’-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’）、荧光标记的下游引物P₄（5’-FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3’）进行对称PCR扩增，其所述对称PCR扩增的体系为：取浓度均为10 μmol/L的生物素标记的上游引物P₂、荧光标记的下游引物P₄各0.5 μL，ddNTP 1 μL，PCR buffer 2 μL，Taq酶0.1 μL，灭菌水15.4 μL。扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，68℃退火45 s，72℃延伸45 s，6轮热循环。平行做5管，得到第一轮筛选扩增产物，记为（1，d）；

c、PCR纯化：PCR产物用纯化试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）进行纯化，将PCR产物加入到平衡好的吸附柱中，12000 rpm离心，筛掉50 bp以下的DNA序列，回收50bp以上序列，去除杂带，得纯化对称PCR产物，记为（1，c）；

d、次级文库的制备：先制备链霉亲和素磁珠，取5 mg（1 mL）氨基磁珠超声混匀，装入10 mL的EP管中，用5 mL的PB（0.1 mol/L pH 7.4）混悬，磁分离，吸弃上清液，用PB洗三次；加入质量百分比浓度12%的新配的戊二醛5 mL，37℃摇床孵育4 h，PB洗三次；加入1 mL100 μg/mL的链霉亲和素（链霉亲和素溶于双蒸水中），37℃摇床孵育4 h，得链霉亲和素磁珠，磁分离链霉亲和素磁珠，清洗干净备用；将氨基磁珠和链霉亲和素磁珠进行红外检测，验证其偶联结果，结果见图3；其中图中a为氨基磁珠，b为链霉亲和素磁珠。

由图3中b可见，红外图谱显示链霉亲和素磁珠在544 cm^-1和1606 cm^-1处有吸收峰，而席夫碱的特征峰在1650～1590 cm^-1范围，说明有C=N缩振动峰产生；红外图谱区别于氨基磁珠，证明链霉亲和素磁珠成功偶联；

取6~7×10⁷（1 mg）链霉亲和素磁珠，用2倍B&W缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，1mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl）洗涤磁珠一次；上磁力架1-2 min，吸弃洗涤液；取100μL 1倍B&W缓冲液混悬；加入100 μL等体积的纯化对称PCR产物（1，c），37℃摇床结合30min；上磁力架1~2 min，分离已结合对称PCR产物dsDNA的链霉亲和素磁珠，用1倍B&W缓冲液洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠2~3次，对链霉亲和素磁珠结合的dsDNA进行解链，具体为：加入200 μL的150 mmol/L NaOH，37℃孵育15 min，使dsDNA解链；上磁力架，含生物素的一条ssDNA留在链霉亲和素磁珠上并吸附在管壁，而另一条与其互补的荧光标记的ssDNA存在于上清中，记为目标产物，记为（1，s）。测量链霉亲和素磁珠制备的（1，s）产物以及纯化后（1，c）的荧光强度，计算其回收效率。计算结果为：将荧光强度为112.67荧光标记的PCR产物加入链霉亲和素磁珠解链后得到的上清液中荧光强度为38.67，回收率为34.32%。并可根据荧光强度，计算其每一轮的亲和力。

e、每一轮筛选：取目标产物（1，s）500 pmol结合缓冲液定容至1 mL，95℃变性2min后，立即放置4℃水浴10 min，加入阳极柱，孵育1 h，通过淋洗，洗脱得到（2，目），（2，d）,（2，c），（2，s）。第三轮同第二轮类似，取（2，s）500 pmol与阳极柱孵育得到（3，s），用于第四轮的筛选。第四轮相比于第三轮，需要进行反筛，取（3，s）300 pmoL，用结合缓冲液定容至1mL，95℃变性2 min后，立即放置 4℃ 水浴10 min，加入阴极柱，孵育10 min，转入阳极柱孵育1 h，通过淋洗，洗脱，进行第四轮筛选得到（4，目），（4，d），（4，c），（4，s）。

第五轮到第十轮重复第一轮的筛选，每三轮筛选进行一次反筛，用于除去非特异性结合的序列。将第十轮筛选到的ssDNA（10，目）作为模板加入上述上游引物P1和下游引物P3进行PCR扩增，扩增程序同上，将每轮的对称PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到图4，图中1、2、3、4分别为第3轮、5轮、7轮、9轮筛选的PCR产物，M表示Marker；从图中可以看出条带清晰，无杂带；以每一轮的次级文库测量其荧光强度，作为评价每一轮亲和力的标准，洗脱收集的次级文库荧光强度越高，亲和力越高，结果见图5，图中1~10分别表示SELEX筛选每轮PCR产物的荧光值。

将第十轮筛选得到的ssDNA为模板对称PCR扩增得到的产物纯化后，连接pUCM-T载体，转入大肠杆菌，挑取含ssDNA单克隆进行测序，共测序31个阳性克隆，经测序后获得13个不同序列的适配子，即为与链霉素亲和性较高的ssDNA；通过Mfold program软件分析ssDNA二级结构，根据一级序列同源性及二级结构的相似性对所获适配子进行分类，见表1。

表1 ssDNA随机区的一级序列

（5）荧光法检测筛选与链霉素亲和力最高的适配子：

取测序鉴定后的与链霉素亲和性较高的ssDNA的13种转化菌30 μL接种于3 mL含Amp的LB液体培养基，摇菌过夜，加入1.5 mL EP管，12000 rmp离心1 min，弃上清。采用质粒抽提试剂盒（上海生工）进行质粒小提；以所述质粒作为模板与生物素标记上游引物P2和荧光标记的下游引物P4进行对称PCR扩增，扩增体系与扩增程序同上，纯化，将纯化产物用链霉亲和素磁珠结合，磁分离，解链，将得到13种荧光标记的适配子。

将13种不同序列适配子分别与阴极柱阳极柱进行孵育，按上述工艺进行淋洗，洗脱步骤，测定阳极柱洗脱液的荧光强度，每300 μL测一次荧光强度。记录阳极柱中最强峰的强度，比较13个不同序列适配子峰高，做柱形图，作为亲和力测定的标准，见图6。由于适配子与阴极柱孵育，加入淋洗液，随着加入量的增加，荧光强度逐渐减少，加入洗脱液，荧光强度不再变化，证明适配子不会吸附在阴极柱上，随着淋洗液的加入，适配子会逐渐流出；适配子与阳极柱孵育，加入淋洗液，随着加入量的增加，荧光强度不变，加入洗脱液，荧光强度由小变大，证明适配子与阳极柱产生了特异性结合，淋洗液不会将适配子淋洗下来，当加入洗脱液时，适配子被逐渐洗脱。其中阳极孵育加入洗脱液，洗脱下来的溶液荧光强度越高，证明适配子与阳极柱亲和力越高。根据阳极柱峰值的高低，判断亲和力大小。所获得适配子的荧光值均极显著高于阴性对照（P<0.01），表明筛选获的适配子均可与链霉素稳定结合。从图6中可见，第三家族中A15与A31亲和力高于其他两家族中适配子，选取每个家族中亲和力最高的适配子进行比较，第三家族中A15亲和力显著高于第一家族中的A17和第二家族中的A25。

（6）根据亲和力柱形图可选择每个家族中亲和力最高的一个适配子求其Kd值并做二级结构预测。将每个家族中选出的适配子作为模板，与荧光标记的下游引物和生物标记的上游引物进行对称PCR扩增，用磁珠法进行解链得到纯化的荧光标记适配子，稀释成不同浓度（0.02、0.04、0.08、0.1、0.15 μg）与1 mg的磁珠复合物进行孵育，测量孵育前后不同浓度适配子的荧光强度，计算结合的荧光强度作为纵坐标。根据origin绘图软件，作非线性拟合。根据米氏方程：y/2=y_max•[ssDNA]/(Kd+[ssDNA])，计算出Kd值，其中y为吸附适配子的荧光强度，纵坐标；y_max吸附适配子最大的荧光强度；[ssDNA]为适配子浓度，横坐标；Kd值为解离常数，Kd值越小则亲和力越高。通过测定，结果显示适配子A15、A17、A25的Kd值分别为6.07nmol/L，8.56nmol/L和10.31nmol/L，其二级结构及Kd值见图7，其中A15适配子Kd值显著低于其他适配子，说明A15号与链霉素亲和力最高，即如SEQ ID NO:1所示。

实施例2 利用实施例1筛选到的适配子定性及定量检测链霉素

（1）胶体金制备：将20 mL质量比浓度为0.015%的HAuCl₄加热煮沸，边搅拌边加入500 μL质量比浓度为0.95%的柠檬酸钠，颜色变化后，溶液持续煮沸10min，移除热源搅拌直至室温，得胶体金；可将胶体金储存在质量比浓度为0.05%的叠氮化钠中，备用；

（2）定性检测：在50 µL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子，室温孵育0.8 h，制得了适配子标记的胶体金；把终浓度分别为25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素加入到适配子标记的胶体金中，室温孵育1 h；最后加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl，观察颜色变化，如图8所示。

图8显示当链霉素浓度大于200 nmol/L时，胶体金溶液由酒红变为紫色或蓝色，说明颜色变化与链霉素浓度相关。当链霉素浓度小于200 nmol/L时为红色，表明有少量的胶体金发生聚沉，裸眼不能区分颜色变化情况，但可以通过光吸收值变化检测链霉素浓度。当链霉素浓度为200~800 nmol/L，颜色变为紫色，表明大部分的胶体金发生聚沉。当链霉素浓度大于800 nmol/L，颜色为蓝色，表明全部的胶体金发生聚沉。以此实验结果，可以以50 µL的胶体金中加入100 nmol/L的适配子的比例制成适配子标记的胶体金，将其作为测试卡的底物或试剂盒的测试液，用来检测样品中是否含有链霉素，具体操作为：在适配子标记的胶体金中加入待测样品，裸眼观察溶液的颜色，若溶液的颜色仍为酒红色，则待测样品中链霉素的浓度小于200 nmol/L；若溶液颜色由酒红色变为紫色，则待测样品中链霉素的浓度为200~800 nmol/L；若溶液颜色由酒红色变为蓝色，则待测样品中链霉素的浓度为大于800nmol/L。这样可以初步定性测定待测样品中链霉素的含量范围。

当待测样品中含有链霉素，但其浓度小于200 nmol/L时，溶液为酒红色，表明有少量的胶体金发生聚沉，裸眼不能区分颜色变化情况，但可以通过光吸收值变化检测链霉素浓度；当待测样品中链霉素浓度为200~800 nmol/L，溶液颜色变为紫色，表明大部分的胶体金发生聚沉；当链霉素浓度大于800 nmol/L，溶液颜色为蓝色，表明全部的胶体金发生聚沉；透射电镜结果显示，适配子标记的胶体金聚沉程度与链霉素浓度正相关，与颜色变化及光吸收变化结果相一致。

（3）定量检测：在步骤（2）制得的适配子标记的胶体金中加入浓度分别为25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素，室温孵育1 h，加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl，在波长为A520和A620分别测定其吸光值，对步骤（2）中胶体金聚沉程度利用紫外可见分光光度计扫描，如图9所示，从链霉素浓度为0、800 nmol/L、1600 nmol/L测得吸光值观察，当胶体金聚沉程度随着链霉素浓度增加而加大时，A520有所下降，而A620逐渐上升，两处的吸光值变化与链霉素浓度变化具有明显相关性，经过分析后发现A620/A520的比值与链霉素浓度的变化更接近线性相关，因此，选择A620/520比值变化定量检测链霉素浓度，其测定结果见图10。从图10中显示，当链霉素浓度为25-800nmol/L时，其A620/A520的比值与链霉素浓度基本呈线性关系；对其进行拟合，所得标准曲线如图11所示，其R²为0.998；在实际测定样品时，将待测样品加入到适配子标记的胶体金中，测定其在波长为A520和A620的吸光值，求A620/520比值，将其在带入标准曲线中，即可得知待测样品中所含链霉素的含量；

（4）适配子高度特异识别的验证：为了测定链霉素适配子的特异性，选择与链霉素同一类的氨基糖苷类抗生素及其他非氨基糖苷类抗生素（硫酸卡那霉素、G418、红霉素、氯霉素以及盐酸托普霉素）作为阴性对照与适配子A15标记的胶体金进行反应。结果如图12所示，肉眼可直接观察胶体金颜色变化。其中待测样品1为阳性对照、2为800 nmol/L链霉素、3为200 nmol/L链霉素、4为硫酸卡那霉素、5为G418、6为红霉素、7为氯霉素、8为盐酸托普霉素。从图12可见，仅加入链霉素可导致胶体金颜色由红变为紫色或蓝色，其他抗生素均不能与适配子A15结合而不能使胶体金变色。虽然链霉素，硫酸卡那霉素和G418均属于氨基糖苷类抗生素，具有相似的结构，但适配子A15仅与链霉素结合，表现了高度的特异性。通过分光光度计检测A620/A520光度值吸，结果与胶体金比色法相一致，均表明适配子A15可对特异性识别并结合链霉素。

实施例3牛奶及蜂蜜中链霉素残留量的定量检测

从本地超市采购不含链霉素的蜂蜜和牛奶样品，采用加标回收实验对链霉素进行定量检测，具体操作如下：

牛奶样品处理：在1 mL牛奶样品中加入3 mL乙酸乙酯和3 mL水，漩涡混合15 min；然后在4℃下，8000 rpm/min离心15min；混合物分为三层，收集水层作为下一步检测样品；

蜂蜜样品处理：蜂蜜用双蒸水稀释五倍进行稀释，作为检测样品；

将一系列标准浓度链霉素：25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L分别加入处理后的牛奶及蜂蜜样品中，利用实施例2定量检测方法检测样品中链霉素浓度，其检出结果与添加链霉素浓度一致，其定性检测结果与定量检测相一致。这说明本发明利用适配子检测链霉素准确性较高，而且从表中数据可以得知，牛奶样品中链霉素的回收率为70~90%，蜂蜜中为76~98%之间，二者检测的相对标准偏差（RSD）均值小于4.58 %。该结果表明本发明所获核酸适配子可成功应用于实际样品中链霉素的检测，而且准确性和精确度都相对较高。

检测结果见表3。

表3 牛奶和蜂蜜样品中链霉素检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 河北大学

<120> 一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法和应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 核算适配子

<400> 1

cccgtttaaa gtagttgaga gtattccgtt tctttgtgtc 40

Claims (2)

1.一种特异识别链霉素的核酸适配子在链霉素检测中的应用，其特征在于，所述核酸适配子的核苷酸序列为：

2.一种定性及定量检测链霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）制备胶体金：将20 mL质量比浓度为0.015%的HAuCl₄加热煮沸，边搅拌边加入500 μL质量比浓度为0.95%的柠檬酸钠，溶液变色后，煮沸并持续8 min，冷却至室温，得胶体金；

（b）定性检测：以50 µL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将两者混合，室温孵育 0.8 h，制得了适配子标记的胶体金；在适配子标记的胶体金中加入待测样品，室温孵育1 h；最后加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl，若溶液颜色为酒红色，则待测样品中链霉素浓度小于200 nmol/L；若溶液颜色由酒红色变为紫色，则待测样品中链霉素的浓度为200~800 nmol/L；若溶液颜色由酒红色变为蓝色，则待测样品中链霉素的浓度为大于800 nmol/L；所述特异识别链霉素的核酸适配子的核苷酸序列为：

（c）定量检测：在步骤（b）制得的适配子标记的胶体金中加入浓度分别为25 nmol/L、50nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素，室温孵育1 h，加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl，在波长为A520和A620分别测定其吸光值，以链霉素的浓度为横坐标，以同一浓度链霉素所述测得的A620和A520的比值为纵坐标，作链霉素浓度与A620/520比值的曲线图，拟合其标准曲线；测定样品时，将待测样品加入到适配子标记的胶体金中，测定其在波长为A520和A620的吸光值，求A620/520比值，将其带入标准曲线中得到所对应的链霉素含量值，即为待测样品中所含链霉素的含量。