CN102703453A - 特异性识别链霉素的dna适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性识别链霉素的单链DNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明提供了利用改良的磁珠SELEX技术优选链霉素适配体的方法和得到的序列A1、A3、A6、A12四种与链霉素具有高亲和力的单链DNA适配体，为链霉素、特别是食品中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。

Description

特异性识别链霉素的DNA适配体及其应用

技术领域

本发明涉及对链霉素特异性的新型识别元件-DNA适配体（Aptamer）的筛选及其应用，涉及生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。

背景技术

氨基糖苷类抗生素，如链霉素、庆大霉素、新霉素、双氢链霉素等，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，可以有效抑制细菌的生长和繁殖，因此是目前我国农业、畜牧业和水产业中常用的兽药之一。但是该类抗生素的主要毒副作用体现为对于脑神经、听觉以及肾脏的损害，因此，针对该类药物在食品中的残留，许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量(MRIJs)。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中氨基糖苷类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。美国、加拿大等国官方机构调查发现链霉素是仅次于青霉素的最常在动物中残留超标的药物。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发，特别是研究建立特异性强、灵敏度高、高效快速的链霉素残留的检测方法，对于食品安全控制及质量体系与国际标准接轨具有十分重要的意义。

目前链霉素等氨基糖苷类抗生素的检测方法主要包括微生物法、仪器分析法和免疫分析方法等。微生物检测法是根据抗生素对特异微生物的抑制作用，来定性或定量检测受检样品中残留的抗生素的方法，该方法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，因此不能适应高通量高灵敏定量检测的需求。仪器检验方法是利用抗生素分子结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，包括气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）及各种联用技术等。此类方法灵敏度高，准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质，在食品抗生素残留检测领域已较为广泛地应用。酶联免疫吸附测定（ELISA）将抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合，有效保证分析中的高选择性和高灵敏度，报道最多的是免疫分析方法。目前欧美已有一些公司生产针对抗生素残留检测的ELISA 试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，只能检测少数种类常见的抗生素残留。由于链霉素是小分子化合物，本身不具有免疫原性，需将其与生物大分子如蛋白质连接后作为载体的抗原决定簇刺激动物才能产生特异性抗体，生产与应用存在较多的限制，包括：抗原制备中免疫原性弱的抗生素半抗原难以产生高效价的抗体；产生于鼠、兔等动物的异源抗体在使用中有可能产生非特异性反应（假阳性）；抗体的制备成本高，费时费力，克隆株不易保存；批间质量不一；抗体的活性难以长时间保持，对温度敏感，易发生不可逆变性。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在链霉素检测中的应用。

随着DNA 结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，Tuerk和Gold构建了一种研究核酸结构、功能及进化的有效方法——指数富集配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）。该技术是建立随机寡核苷酸文库，并在体外筛选能与各种配体特异性结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术，该技术对靶分子无特殊要求，可以是蛋白质、核酸、寡肽、小分子有机物甚至是金属离子，筛选出的寡核苷酸被称为适配体。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，易于进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。链霉素等氨基糖苷类抗生素，在生物体内的自然作用靶点正是通过结合细菌核糖体，抑制细菌蛋白质的合成，因此它们与核酸类分子存在天然的亲和性。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。

本发明筛选到可以与链霉素高亲和力结合的单链DNA（ssDNA）适配体序列，为链霉素尤其是食品中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。

发明内容

本发明目的：鉴于链霉素分子的结构特点，设计了改良的磁珠SELEX技术优选链霉素的方法，借助基于SELEX的组合化学技术，筛选得到能特异性结合链霉素的DNA适配体。该适配体是链霉素的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。

本发明的技术方案，提供了：

1．特异性结合链霉素的单链DNA（ssDNA）适配体，选自序列表A1~A16所示序列的一种或多种，包括含有A1~A16所述序列的ssDNA。其中，序列表A1~A16在结构上均符合下述通式1所示的结构特征，5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’ （通式1）其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

2．在序列表A1~A16，优选序列A1、A3、A6或A12所示的序列，包括含有A1、A3、A6、A12所述序列的ssDNA。

3．根据序列表A1~A16所述的适配体，其被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。

4．用于链霉素检测的组合物、试剂盒和芯片，其中含有序列表A1~A16中任一项的适配体。

5．用于链霉素检测的方法，包括使可能含有链霉素的样品与序列表A1~A16中任一项的适配体接触，并检测链霉素与所述适配体的结合。

6．筛选特异性结合链霉素的ssDNA适配体的方法，包括步骤（a）-（j）：

（a）筛选文库：ssDNA文库；

5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’ 其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

（b）亲和磁珠：环氧基修饰磁珠，粒径1-2μm，浓度为10mg/ml；

（c）偶联有链霉素的亲和磁珠（b）；

（d）使步骤（a）中的筛选文库和步骤（c）中的偶联链霉素的亲和磁珠在适宜的条件下保温、洗涤；所述适宜条件是指使筛选文库中的成员能和偶联链霉素的亲和磁珠特异性结合的条件，包括温度是室温25℃，作用时间30min，结合缓冲液成分为含有100mM NaCl、2mM MgCl₂、5mM KCl、1mM CaCl₂和0.02% Tween 20的20mM Tris-HCl，pH7.6；

（e）收集经步骤（d）处理的与（c）中偶联链霉素亲和磁珠结合的文库成员；

（f）对步骤（e）的文库成员用上游引物跟生物素标记的下游引物进行PCR扩增处理；

（g）将步骤（f）中的文库成员与链霉亲和素磁珠在适宜条件下接触，得到单链次级文库，将单链次级文库与步骤（c）中偶联链霉素的亲和磁珠在适宜条件下接触；

单链次级文库制备：取链霉亲和素磁珠，用Bind and Wash buffer（B&W 10mM Tris-HCl中含1mM EDTA、2M NaCl，pH7.5）冲洗，将第一轮筛选后用上游引物跟生物素标记的下游引物进行扩增的产物加入链霉亲和素磁珠中，室温结合15min（轻微震荡），用B&W缓冲液冲洗，磁性分离，洗去未结合到磁珠上的DNA，在链霉亲和素磁珠中加入NaOH溶液，37℃孵育15min，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链DNA即为下一轮筛选的次级文库。

（h）收集步骤（e）或（g）中与（c）特异性结合的文库成员；

（i）重复步骤（d）-（h），重复次数1、2、3、4、5、6、7或8次，优选重复8次；

（j）任选地，对（g）步骤获得的文库成员进行确定，优选序列测定。

本发明的有益效果：本发明采用改良的磁珠SELEX技术，筛选得到对链霉素具有高亲和力的ssDNA适配体，方法简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟链霉素结合，为食品中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。

附图说明  

图1：链霉素固定至环氧基修饰磁珠表面的示意图。

图2：每一轮筛选，适配体跟靶链霉素的结合率。

图3：测定适配体序列A1的 K_d值的拟合曲线图。

具体实施方式

实施例1. 链霉素在环氧基修饰的磁珠表面的固定

链霉素跟磁珠的偶联示意图如图1所示，具体过程为：

（a）配制10mM的链霉素溶液，调节pH至8.0，取50μL、10mg/mL环氧基修饰的磁珠，用pH7.4的PBS缓冲液清洗3-5遍，加入配制好的链霉素溶液200μL，在37℃摇床过夜结合。未结合到磁珠上的链霉素用pH7.4的PBS缓冲液冲洗，磁性分离。在链霉素-磁珠复合物中加入pH8.0的0.5M乙醇胺200μL，37℃摇床结合6小时，封闭磁珠上的未偶合基团，提高适配体筛选的特异性。将未结合到磁珠上的乙醇胺用pH7.4的PBS缓冲液清洗，得到偶联有链霉素的亲和磁珠，往其中加200μL 0.02%的叠氮钠保存，备用。未结合至磁珠的链霉素溶液用麦芽酚比色法测含量，计算出1mg环氧基磁珠能结合0.6μmol链霉素。

（b）取50μL环氧基修饰的磁珠，用pH7.4的PBS缓冲液清洗3-5遍，加入pH8.0的0.5M乙醇胺溶液200μL，在37℃摇床过夜结合。将未结合的乙醇胺用PBS缓冲液冲洗干净，得到偶联有乙醇胺的亲和磁珠，加入200μL 0.02%的叠氮钠保存，用作反筛选。

实施例2. 随机 ssDNA文库及其引物的构建 

（a）构建长度79个碱基的随机ssDNA文库

5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’ 其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

（b）合成上游引物

上游引物1：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGAT-3’

上游引物2：5’-biotin-TAGGGAATTCGTCGACGGAT-3’

（c）合成下游引物

下游引物1：5’-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3’ 

下游引物2：5’-biotin-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3’

实施例3. 核酸适配体体外筛选

为筛选出与链霉素有着高亲和力和高特异性的ssDNA适配体，共进行了8轮核酸适配体的筛选。为了提高筛选的特异性，每经过两轮筛选，进行一次乙醇胺固定磁珠的反筛选实验，每一轮筛选，适配体跟靶链霉素的结合率如图2所示。

（a）取1μL ssDNA初级文库，加入200μL结合缓冲液，90℃水浴10min，迅速冷却到4℃，放置15min，再放置室温7min，然后将其加入到偶联有链霉素的亲和磁珠中，室温反应30min（轻微震荡）。用结合缓冲液冲洗5次，磁性分离，除去未结合的ssDNA。在结合有DNA的链霉素亲和磁珠复合物中加入150μL洗脱缓冲液（40mM Tris-HCl，10mM EDTA，3.5M尿素，0.02% Tween 20，pH8.0），80℃反应10min，轻微震荡，将此过程重复3遍将结合在磁珠上的DNA全部洗脱下来。

（b）将洗脱下来的DNA用苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，加入10μL无菌水后作为模板，50μL PCR反应体系如下：

  Taq酶               0.2μL

                     Buffer                 5μL

                     dNTP                 4μL

                     模板                 10μL

                    上游引物1（20μM）     1μL   

                    下游引物2（20μM）     1μL 

                    加入无菌水，补充体系至50μL。

扩增条件：94℃，预变性3min；94℃，变性30s；55℃，退火1min；72℃，延伸1min；72℃，延伸5min；20个循环。

（c）单链次级文库的构建：取5μL链霉亲和素磁珠，用B&W缓冲液冲洗3遍，加入80μL B&W缓冲液，将第一轮筛选后用上游引物1跟下游引物2进行扩增的产物20μL加入链霉亲和素磁珠中，室温结合15min（轻微震荡），用B&W缓冲液冲洗5遍，磁性分离，洗去未结合到磁珠上的DNA，在磁珠中加入50μL 100mM的NaOH溶液，37℃孵育15min，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下的50μL不带有生物素的一条单链DNA即为下一轮筛选的次级文库。

（d）下一轮筛选根据上面的筛选方法重复进行，重复8次。

实施例4. 测定每一轮筛选的适配体跟靶链霉素的结合率

取每一轮筛选的适配体1.5μg，加入200μL结合缓冲液，90℃加热10min，迅速加入到偶联有链霉素的亲和磁珠中，室温反应30min，洗去未结合的DNA，用洗脱缓冲液将结合在磁珠上的DNA洗下来，80℃加热10min，重复此步骤洗三次，保证结合在磁珠上的DNA完全洗脱下来。将结合在磁珠上的DNA和未结合在磁珠上的DNA用苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，提纯。用核酸定量仪测核酸含量。计算适配体跟链霉素的结合率用以评估每轮筛选后所得适配体序列与链霉素的亲和力变化情况。如图2所示，在第八轮筛选后结合率不再增加，所以确定筛选进行到第八轮。对筛选得到的ssDNA进行克隆、测序得到A1～A16的16个适配体序列。

实施例5. 用平衡渗透法结合HPLC，测定适配体序列的解离常数K_d值

对16个适配体序列的中间35个随机序列做了同源性分析，选择同源性相对较高的序列A1、A3、A6、A9、A12、A13进行Kd值的测定。用结合缓冲液配200μM的链霉素母液，每次取10μL此母液，再分别加入适配体，然后用结合缓冲液补充体系至200μL。混合液的链霉素终浓度为10μM，适配体的终浓度分别为65nM，326nM，665nM，860nM，1080nM、1440nM。将此混合溶液置于室温25℃保温30min。然后将此混合溶液转移至截留分子量3kDa的超滤离心管中，12000rpm离心5min。离心管下层的溶液即未结合到适配体上的游离链霉素，用HPLC分析游离链霉素的含量，进而计算出适配体结合的链霉素含量。根据方程：y=B_max.free ssDNA/（K_d+free ssDNA），用1stopt软件进行非线性回归分析，计算适配体的K_d值。式中y为饱和度；B_max为最大结合位点的数目；free ssDNA是未结合链霉素的游离适配体。用此方法确定了序列A1、A3、A6、A9、A12、A13的K_d值分别为199.1nM、221.31nM、272nM、675.33nM、340.64nM、631.15nM。其中K_d值最小的适配体序列是A1，其K_d值为199.1nM，该序列与链霉素的亲和力最高。A1的K_d值非线性拟合曲线如图3所示。

A1

tagggaattc gtcgacggat ccggggtctg gtgttctgct ttgttctgtc gggtcgtctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                 79

A2

tagggaattc gtcgacggat ccgtgtgttt gtggtgtggt ttgtttgtgt gttgtttctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A3

tagggaattc gtcgacggat cctgaagggt cgactctaga ggcaggtgtt cctcaggctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A4

tagggaattc gtcgacggat cctgcagagg attactatca ttggccacgc tagttccctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A5

tagggaattc gtcgacggat ccaggccctc cagtggagat taaacggttc gtcatctctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A6

tagggaattc gtcgacggat ccagcttggg tggggccacg tagaggtata gcttgttctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A7

tagggaattc gtcgacggat ccagggagtc catgtcgtag tgatcggctg taattggctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A8

tagggaattc gtcgacggat ccggcctgtc accgatcgct aattcatact ctcgttcctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A9

tagggaattc gtcgacggat ccgcgaactc gcgttttgtc tttttgcttt gggtgttctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A10

tagggaattc gtcgacggat ccgcaaagct gataatcgtt ctttggcctg atatgtgctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A11

tagggaattc gtcgacggat ccccgcggaa gtggcgcgca aagagggttg gcattcgctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A12

tagggaattc gtcgacggat cctgtgtgtt cggtgctgtc gggttgtttc ttggtttctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A13

tagggaattc gtcgacggat cctgggttgt ctaggttggt atgctcagtg ctaaatactg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A14

tagggaattc gtcgacggat ccacagcctc tcgtggatgc agttttcgcg tggcgccctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A15

tagggaattc gtcgacggat ccacgcccgc agtccgtttt atttgtctca ttgctacctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

A16

tagggaattc gtcgacggat ccatccgtga gccgagtggt acttatagct ctcacatctg       60

caggtcgacg catgcgccg                                                    79

 

Claims (6)

1.特异性识别链霉素的单链DNA（ssDNA）适配体，选自序列表A1~A16所示序列的一种或多种，包括含有A1~A16所述序列的ssDNA。

2.根据权利要求1所述的适配体，选自序列A1、A3、A6或A12所示的序列，包括含有A1、A3、A6、A12所述序列的ssDNA。

3.根据权利要求1或2所述的适配体，其特征在于被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。

4.用于链霉素检测的组合物、试剂盒或芯片，其特征在于其中含有权利要求1-3中任一项的适配体。

5.用于链霉素检测的方法，其特征在于使可能含有链霉素的样品与权利要求1-3中任一项的适配体接触，并检测链霉素与所述适配体的结合。

6.筛选特异性结合链霉素的ssDNA适配体的方法，其特征在于包括步骤（a）-（j）：

（a）筛选文库：ssDNA文库；

（b）亲和磁珠：环氧基修饰磁珠，粒径1-2μm，浓度为10mg/mL；

（c）偶联有链霉素的亲和磁珠（b）；

（d）使步骤（a）中的筛选文库和步骤（c）中的偶联链霉素的亲和磁珠在适宜的条件下保温、洗涤；所述适宜条件是指使筛选文库中的成员能和偶联链霉素的亲和磁珠特异性结合的条件，包括温度、作用时间、结合缓冲液成分；

（e）收集经步骤（d）处理的与（c）中偶联链霉素亲和磁珠结合的文库成员；

（f）对步骤（e）的文库成员进行PCR扩增处理，下游引物5’-端标记生物素；

（g）将步骤（f）中的文库成员与链霉亲和素磁珠在适宜条件下接触，得到单链次级文库，将单链次级文库与步骤（c）中偶联链霉素的亲和磁珠在适宜条件下接触；

（h）收集步骤（e）或（g）中与（c）特异性结合的文库成员；

（i）重复步骤（d）～（h），重复次数1、2、3、4、5、6、7或8次；

（j）任选地，对（g）步骤获得的文库成员进行确定，进行序列测定。

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