CN104502585A - 用于抗生素检测的纳米传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
用于抗生素检测的纳米传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于抗生素检测的纳米传感器，所述的纳米传感器包括金纳米颗粒，所述的金纳米颗粒的表面通过Au-S键修饰有至少一种能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，所述的核酸适配体上标记有荧光染料。本发明的目的在于提供一种能够快速准确的定性定量测定一种或同步测试多种抗生素的纳米传感器，同时还提供该纳米传感器的制备方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析和食品安全检测领域，更具体地，涉及用于抗生素检测的纳米传感器，及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们生活质量的提高，食品安全问题越来越为广大消费者所关注，特别是食品中抗生素残留问题更成为广大消费者关注的焦点问题。吃了有抗生素残留的肉、蛋、奶等后，会造成抗生素在人体内蓄积，使人产生对抗生素的抗性，引起各种组织器官病变，甚至癌变。在食品安全这个全球关注的热点问题上，如何快速、准确地检测食品安全的问题已成为重中之重。
卡那霉素和新霉素都是氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌有极好的抑制作用。但是卡那霉素和新霉素的吸收毒性大，其在动物性食品中残留可能会引起过敏，长期食用还可导致耳和肾毒性等毒副作用，因此，对卡那霉素的定量检测具有重要意义。欧共体规定卡那霉素的最大残留限量为150μg kg-1，新霉素的最大残留限量为500μg kg-1。氯霉素是一种价格低廉的广谱抗生素，是我国动物养殖中常用的抗菌药物之一，氯霉素对人类存在潜在的危害，可引起再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，因此动物源性食品中氯霉素的残留受到世界各国和地区的高度重视。欧盟、美国、加拿大等国家禁止在食用动物中使用氯霉素，欧盟规定进口食品中氯霉素不得检出，方法检出限要求为0.3μg kg-1。链霉素是一种常见的氨基糖苷类抗生素，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有显著的抗菌效果，可有效抑制细菌的生长和繁殖，因此是目前我国畜牧业和水产业中的常用药物之一。链霉素的毒副作用主要表现为对脑神经、听觉及肾脏的损害，因此。欧盟规定动物性食品肌肉中链霉素的最大残留限量为500μg kg-1。氨苄青霉素是目前较常用的广谱半合成青霉素，抗菌谱比青霉素更广，毒性极低，具有较强的杀菌作用。食用残留有氨苄青霉素的食品后，会诱导耐药菌株的产生，敏感的人群会产生过敏反应。欧盟规定牛奶中氨苄青霉素的最大残留限量(MRLs)为4μg L-1。四环素是由金霉素催化脱卤生物合成的抗生素，毒性低，作为一种广谱抗菌药常被用于治疗动物感染性疾病或促进动物生长。动物性食品中残留的四环素进入人体后可引起会引起肝损伤，与骨骼或牙齿中的钙质结合后，使骨骼及牙齿黄染，还可影响儿童的生长发育。欧共体规定四环素的最大残留限量为0.1μg kg-1。
目前，检测抗生素的方法主要有微生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法、分光光度法、荧光法、电化学法等。微生物法虽然方法简单、费用低，但是重现性差，灵敏度低，耗时长，且易受多种因素干扰而影响结果的准确性，在实际应用中受到很大的限制。酶联免疫法可以快速筛选，但是影响因素多，易出现假阳性结果。仪器分析方法设备昂贵，对实验人员的操作技术要求较高，分析费时而不易推广。同时，它还需要进行复杂繁琐的样品前处理，并且不能同时筛选大量的样品，这对药物残留的及时监控是不适用的。为适应当前食品安全检测的要求，需要敏感、特异、省时和经济的筛选检测技术，缩短检测时间，提高检测的灵敏度和准确性。
近年来，金纳米颗粒由于其表面效应和量子尺寸效应而表现出特异的化学物理性质，例如，表面等离子效应能够引起颜色的改变，高的摩尔消光系数使其能够对很宽波谱范围内的荧光物质有猝灭作用等，因此在分析检测、生物医学等领域得到越来越多的应用。在中国专利申请CN 201310069037.5一种基于纳米金的可视化快速检测牛奶中抗生素的方法，其公开了一种基于纳米金的可视化快速检测牛奶中抗生素的方法。其主要特征在于利用邻苯二酚紫还原氯金酸来制备纳米金。在纳米金合成的过程中因抗生素(单硫酸卡那霉素，硫酸新霉素，硫酸链霉素和硫酸伯来霉素)的加入影响了金纳米的合成，使其颜色发生变化，利用肉眼和紫外可见吸收光谱仪可以对抗生素进行定量检测。但是该方法操作复杂，并且并不能特异性的指示抗生素的种类。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，结合高亲和性和高特异性的核酸适配体，以及金纳米颗粒对很宽波谱范围内的荧光物质的强猝灭作用，构建一种新型的纳米传感体系用于食品中抗生素的同步定量检测。核酸适配体(aptamer)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和、高特异性地和靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适配体能识别的靶分子范围广，而且制备、修饰方便快速，并可通过生物分子进行剪裁，提高其亲和力，为化学和生物传感器的理想识别分子，因此提出一种将标记有荧光染料的核酸适配体作为识别分子，金纳米粒子作为荧光淬灭分子，提高了传感检测体系的灵敏度和选择性，缩短了检测时间的用于抗生素检测的纳米传感器。
同时，本发明的另外一个目的在于，提供该纳米传感器的制备方法，同时还提供该纳米传感器在抗生素测试时的应用。
本发明的技术方案为：一种用于抗生素检测的纳米传感器，所述的纳米传感器包括金纳米颗粒，所述的金纳米颗粒的表面通过Au-S键修饰有至少一种能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，所述的核酸适配体上标记有荧光染料。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器中，所述的金纳米颗粒的粒径为5～30nm。优选为10～20nm，更加优选为为12～14nm。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器中，所述的特定的抗生素为卡那霉素或氯霉素或链霉素或氨苄青霉素或新霉素或四环素，本发明中特定的抗生素还可以为妥布霉素、利维霉素和紫霉素等，所述的核酸适配体为能够与卡那霉素进行特异性结合的核酸适配体，或能够与氯霉素进行特异性结合的核酸适配体，或能够与链霉素进行特异性结合的核酸适配体，或能够与氨苄青霉素进行特异性结合的核酸适配体，或能够与新霉素进行特异性结合的核酸适配体，或能够与四环素进行特异性结合的核酸适配体。本发明并不限于上述的核酸适配体和抗生素，可以根据抗生素的种类设计可以与特定种类的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，如还可以为能够与妥布霉素、利维霉素和紫霉素等进行特异性结合的核酸适配体，对此本发明不作过多限制。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器中，当所述的金纳米颗粒的表面修饰有两种或以上的核酸适配体时，不同种类的核酸适配体所标记的荧光染料的激发波长和发射波长不同。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器中，所述的荧光染料为Cy系列荧光染料(2,3,3-三甲基-3H-吲哚类碳菁染料)，如Cy3(三甲川菁染料)和Cy5(五甲川菁染料)、FAM荧光染料(5-羧基荧光素)或Rox荧光染料(6-羧基-X-罗丹明)、Alexa系列染料，如Alexa Fluor350、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647。本发明选用上述荧光染料，但是并不限于上述的荧光染料，可选用的荧光染料还包括d6过渡金属配合物如铱配合物和铼配合物，或荧光纳米粒子如CdSe/ZnS量子点、碳量子点，通用的用于标记DNA或RNA的荧光染料均可适用。
本发明的另一个目的在于提供用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法，所述的制备方法为：将含有至少一种能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体的溶液加入到含有金纳米颗粒的溶液中，混合孵育10～20小时；然后加入NaCl溶液进行陈化，最后用缓冲溶液洗涤后保存在缓冲溶液中，其中，所述的核酸适配体的一端具有巯基且另一端标记有荧光染料。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法中，所述的陈化的时间为20～30小时，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法中，所述的金纳米颗粒的粒径为5～30nm。优选为10～20nm，更加优选为为12～14nm。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法中，所述的特定的抗生素为卡那霉素或氯霉素或链霉素或氨苄青霉素或新霉素或四环素，所述的核酸适配体为能够与卡那霉素进行特异性结合的核酸适配体、能够与氯霉素进行特异性结合的核酸适配体、能够与链霉素进行特异性结合的核酸适配体和能够与氨苄青霉素进行特异性结合的核酸适配体,或能够与新霉素进行特异性结合的核酸适配体，或能够与四环素进行特异性结合的核酸适配体。
在上述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法中，所述的荧光染料为Cy系列荧光染料或FAM荧光染料或Rox荧光染料或Alexa系列染料。
所述的纳米传感器的应用方法为：向含有所述用于抗生素检测的纳米传感器的溶液加入待测物，混合均匀后加入到荧光比色皿中，分别在所述荧光染料对应的激发波长条件下，测试所述荧光染料对应的发射波长处的荧光强度，根据所测得的荧光强度与预先测定好的荧光强度标准曲线进行比对，获得抗生素的种类和抗生素的浓度。更加具体来说，需要预先制定单一抗生素的不同浓度的荧光强度标准曲线，然后测试待测物的荧光强度，根据荧光强度表来判断待测物中的抗生素的种类和浓度。
本发明的用于抗生素检测的纳米传感器的优点在于：核酸适配体能通过巯基与金原子形成Au-S键而修饰在金纳米粒子表面，未与靶标物结合的核酸适配体形成茎环结构，使核酸适配体上的荧光分子与金纳米粒子间的距离靠近，使其荧光被金纳米粒子猝灭，呈“OFF”态。当有与核酸适配体能特异性结合的靶分子存在时，由于核酸适配体形成G-四链体与靶分子的特异性结合，导致核酸适配体上的荧光分子与金纳米粒子间的距离变远，使其被金纳米粒子猝灭的荧光恢复，呈“ON”态。
通过上述设计可以准确的判断抗生素的种类，利于定性和定量判断，特别是通过在金纳米粒子表面修饰不同的核酸适配体，不同种类的核酸适配体上标记有不同的荧光染料，在不同的激发波长和发射波长的条件下，测试该纳米传感器是否可以产生荧光达到定性判断的目的，以及测试该荧光强度可以达到对不同种类的抗生素的同步定量判断的目的，极大的缩短的测试时间、提高了测试效率，彻底解决了传统的抗生素检测定量困难、测试用时长的问题。
附图说明
图1为实施例1的用于抗生素检测的纳米传感器的组装和应用原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
用于氯霉素和卡那霉素检测的纳米传感器的制备以及该纳米传感器的应用：
(1)直径13nm的金纳米粒子的制备：称取0.04726g HAuCl4溶于已经放有100mL超纯水的圆底烧瓶中，放入磁力搅拌子，然后在双颈瓶的两个口上接上冷凝管和塞子，开启冷凝水，打开磁力搅拌器并开始加热。另外取1.3693g柠檬酸三钠溶解在超纯水中，配置成120mL溶液得到38.8mM的柠檬酸三钠溶液。当看到反应液沸腾，冷凝水开始以1秒1滴的速度回流时，取出塞子，快速加入12mL 38.8mM柠檬酸三钠，重新塞上塞子。这时溶液的颜色会从淡黄色逐渐变为深红色，变为深红色后继续加热回流15分钟。然后停止加热，同时持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温(25℃)。将冷凝好的溶液用孔径0.45μm的醋酸滤膜过滤即可。将制备好的溶液在室温条件下储存于干净的棕色玻璃瓶中。需要说明的是：在本发明中，mM、μM、M均为浓度单位，M的意思为mol/L。
(2)将巯基ssDNA(单链DNA)修饰到AuNPs(金纳米颗粒)表面上：本发明选择对卡那霉素和氯霉素有高亲和性和高特异性的、并标记有荧光分子的核酸适配体作为识别分子，其序列分别为：
特异性识别氯霉素的核酸适配体A：5′-SH-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-Cy3-3′
特异性识别卡那霉素的核酸适配体B：5′-SH-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-Cy5-3′
将核酸适配体A和核酸适配体B按摩尔比1:1混合，使混合溶液中核酸适配体A和核酸适配体B的浓度均为10μM，取100μL上述DNA溶液与50μL金纳米颗粒混合孵育16h后，加1M NaCl使其最终浓度为0.1M，陈化24h后，用0.1M PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液pH＝7.2)缓冲溶液离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200μL 0.1M PBS(pH7.2)缓冲溶液中。
(3)在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的氯霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为550nm，测发射波长为570nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于氯霉素检测的标准曲线。
(4)在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的卡那霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为650nm，测发射波长为670nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于卡那霉素检测的标准曲线。
(5)在步骤(2)所得溶液中加入待测样品，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为550nm，测发射波长为570nm处的荧光强度，若纳米传感器在570nm波长处有荧光，则可判断样品中含有氯霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤(3)所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中氯霉素的浓度。
继续在激发波长为650nm，测发射波长为670nm处的荧光强度，若纳米传感器在670nm波长处有荧光，则可判断样品中含有卡那霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤(4)所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中卡那霉素的浓度。
为了更加具体形象的表示本实施例1，参考图1，当待测样品中不含有卡那霉素和氯霉素时，纳米传感器的状态如标号4所示；
当待测样品中仅含有卡那霉素时，纳米传感器的状态如标号1所示，测得的曲线如标号1-1所示，将其与步骤4所测得的卡那霉素检测的标准曲线比对，即可得到卡那霉素的浓度；
当待测样品中仅含有氯霉素时，纳米传感器的状态如标号3所示，测得的曲线如标号3-1所示，将其与步骤3所测得的氯霉素检测的标准曲线比对，即可得到氯霉素的浓度；
当待测样品中同时含有卡那霉素和氯霉素时，纳米传感器的状态如标号2所示，测得的曲线如标号2-1所示，通过与步骤4和步骤3分别得到的卡那霉素检测的标准曲线、氯霉素检测的标准曲线比对，即可得到卡那霉素和氯霉素的浓度。
实施例2
用于新霉素检测的纳米传感器的制备以及该纳米传感器的应用：
(1)直径5nm的金纳米粒子的制备：将70mL蒸馏水和10mL质量分数为0.1％氯金酸，加入到250mL三颈烧瓶中，并在剧烈搅拌的条件下加热至沸腾。然后，迅速将新鲜配制的4mL质量分数为1％柠檬酸钠和5mL质量分数为1％单宁酸的混合溶液加到上述沸腾溶液中，反应10min后，继续搅拌使溶液冷却至室温,于4℃保存。
(2)将巯基ssDNA修饰到AuNPs表面上：本发明选择对新霉素有高亲和性和高特异性的、并标记有荧光分子的核酸适配体作为识别分子，其序列分别为：
特异性识别新霉素的核酸适配体E：5′-SH-GGACUGGGCGAGAAGUUUAGGCC-Rox-3′
将核酸适配体E的浓度配置为10μM，取100μL上述DNA溶液与50μL金纳米颗粒混合孵育16h后，加1M NaCl使其最终浓度为0.1M，陈化24h后，用0.1M PBS(PhosphateBuffered Saline,磷酸盐缓冲液pH7.2)离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200μL 0.1MPBS(pH7.2)缓冲溶液中。
(3)在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的新霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为575nm，测发射波长为600nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于新霉素检测的标准曲线。
(4)在步骤(2)所得溶液中加入待测样品，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为575nm，测发射波长为600nm处的荧光强度，若纳米传感器在600nm波长处有荧光，则可判断样品中含有新霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤(3)所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中新霉素的浓度。
实施例3：
用于氨苄青霉素和链霉素检测的纳米传感器的制备以及该纳米传感器的应用：
(1)直径为30nm的金纳米粒子的制备：将100mL质量分数为0.01％氯金酸，加入到250mL三颈烧瓶中，并在剧烈搅拌的条件下加热至沸腾。然后，迅速将新鲜配制的1mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液加入到上述沸腾溶液中，反应15min后，继续搅拌使溶液冷却至室温，于4℃保存。
(2)将巯基ssDNA修饰到AuNPs表面上：本发明选择对链霉素和氨苄青霉素有高亲和性和高特异性的、并标记有荧光分子的核酸适配体作为识别分子，其序列分别为：
特异性识别链霉素的核酸适配体C：5′-SH-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGT-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-Rox-3′
特异性识别氨苄青霉素的核酸适配体D：5′-SH-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-CACGGCATGGTGGGCGTCGTG-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-FAM-3′
将核酸适配体C和核酸适配体D按摩尔比1:1混合，使混合溶液中核酸适配体C和核酸适配体D的浓度均为10μM，取100μL上述DNA溶液与50μL金纳米颗粒混合孵育16h后，加1M NaCl使其最终浓度为0.1M，陈化24h后，用0.1M PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)(pH7.2)离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200μL 0.1M PBS(pH7.2)缓冲溶液中。
(3)在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的氨苄青霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为494nm，测发射波长为522nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于氨苄青霉素检测的标准曲线。
(4)在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的链霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为575nm，测发射波长为600nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于链霉素检测的标准曲线。
(5)在步骤(2)所得溶液中加入待测样品，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为494nm，测发射波长为522nm处的荧光强度，若纳米传感器在522nm波长处有荧光，则可判断样品中含有氨苄青霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤3-1所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中氨苄青霉素的浓度。
继续在激发波长为575nm，测发射波长为600nm处的荧光强度若纳米传感器在600nm波长处有荧光，则可判断样品中含有链霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤3-2所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中链霉素的浓度。
在本实施例中，在实际测试的过程中，实验人员可以以上述步骤3和步骤4中所得到的两条标准曲线，测试未知溶液的抗生素浓度，即，将未知溶液加入到步骤(2)所得到的溶液中，在激发波长为494nm，测发射波长为522nm处的荧光强度，并同时在激发波长为575nm，测发射波长为600nm处的荧光强度。
如果仅在激发波长为494nm，测出发射波长为522nm处的荧光强度，则根据步骤3所测得的标准曲线得到氨苄青霉素的浓度值；
如果仅在激发波长为575nm，测得发射波长为600nm处的荧光强度，则根据步骤4所测得的标准曲线得到链霉素的浓度值；
如果在激发波长为494nm，测得发射波长为522nm处的荧光强度，并同时在激发波长为575nm，测得发射波长为600nm处的荧光强度，则根据步骤3和4所测得的不同发射波长下的标准曲线得到链霉素和氨苄青霉素的浓度值。
实施例4
用于氯霉素、氨卡青霉素和四环素检测的纳米传感器的制备以及该纳米传感器的应用：
(1)直径13nm的金纳米粒子的制备：称取0.04726g HAuCl4溶于已经放有100mL超纯水的圆底烧瓶中，放入磁力搅拌子，然后在双颈瓶的两个口上接上冷凝管和塞子，开启冷凝水，打开磁力搅拌器并开始加热。另外取1.3693g柠檬酸三钠溶解在超纯水中，配置成120mL溶液得到38.8mM的柠檬酸三钠溶液。当看到反应液沸腾，冷凝水开始以1秒1滴的速度回流时，取出塞子，快速加入12mL 38.8mM柠檬酸三钠，重新塞上塞子。这时溶液的颜色会从淡黄色逐渐变为深红色，变为深红色后继续加热回流15分钟。然后停止加热，同时持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温(25℃)。将冷凝好的溶液用孔径0.45μm的醋酸滤膜过滤即可。将制备好的溶液在室温条件下储存于干净的棕色玻璃瓶中。
将巯基ssDNA修饰到AuNPs表面上：本发明选择对氯霉素、氨卡青霉素和四环素有高亲和性和高特异性的、并标记有荧光分子的核酸适配体作为识别分子，其序列分别为：
特异性识别氯霉素的核酸适配体A′：
5′-SH-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-ACTGAGGGCACGGACAGGAGGGGGAGAGATGGCGTGAGGT-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-Alexa350-3′
特异性识别氨苄青霉素的核酸适配体D：5′-SH-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-CACGGCATGGTGGGCGTCGTG-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-Alexa488-3′
特异性识别四环素的核酸适配体F：
5'-SH-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTGTTTTTTTT-Alexa647-3'
将核酸适配体A′，核酸适配体D和核酸适配体F按摩尔比1:1:1混合，使混合溶液中核酸适配体A，核酸适配体D和核酸适配体F的浓度均为10μM，取100μL上述DNA溶液与50μL金纳米颗粒混合孵育16h后，加1M NaCl使其最终浓度为0.1M，陈化24h后，用0.1M PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)(pH7.2)离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200μL 0.1M PBS(pH7.2)缓冲溶液中。
(3)步骤3-1：步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的氯霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为346nm，测发射波长为422nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于氯霉素检测的标准曲线。
步骤3-2：在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的氨苄青霉素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为490nm，测发射波长为525nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于氨苄青霉素检测的标准曲线。
步骤3-3：在步骤(2)所得溶液中分别加入不同浓度的四环素标准品溶液，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为650nm，测发射波长为665nm处的荧光强度，以获得纳米传感器用于四环素检测的标准曲线。
步骤3-4：在步骤(2)所得溶液中加入待测样品，震荡1min后，在室温下放置30min。取上述溶液于1cm的荧光比色皿中，在激发波长为346nm，测发射波长为422nm处的荧光强度，若纳米传感器在422nm波长处有荧光，则可判断样品中含有氯霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤3-1所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中氯霉素的浓度。
在激发波长为490nm，测发射波长为525nm处的荧光强度，若纳米传感器在525nm波长处有荧光，则可判断样品中含有氨苄青霉素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤3-2所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中氨苄青霉素的浓度。
在激发波长为650nm，测发射波长为665nm处的荧光强度，若纳米传感器在665nm波长处有荧光，则可判断样品中含有四环素，同时根据该波长处的荧光强度在步骤3-3所获得的标准曲线上的位置可以计算出样品中链霉素的浓度。
上述实施例1-4分别给出了可以标示不同抗生素种类和浓度的纳米传感器的制备方法，同时给出了不同抗生素浓度下的标准曲线的准备方法。由于实施例不可能穷举，上述实施例还可以根据本领域技术人员的需要修饰更多种的能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体。根据需要可以在不同的核酸适配体上标记不同的荧光染料，荧光染料的选择方式可以灵活多样，以利于仪器能够测试和分辨的不同的荧光强度为准。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于抗生素检测的纳米传感器，所述的纳米传感器包括金纳米颗粒，其特征在于，所述的金纳米颗粒的表面通过Au-S键修饰有至少一种能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，所述的核酸适配体上标记有荧光染料。
2.根据权利要求1所述的用于抗生素检测的纳米传感器，其特征在于，所述的金纳米颗粒的粒径为5～30nm。
3.根据权利要求1所述的用于抗生素检测的纳米传感器，其特征在于，当所述的金纳米颗粒的表面修饰有两种或以上的核酸适配体时，不同种类的核酸适配体所标记的荧光染料的激发波长和发射波长不同。
4.根据权利要求1所述的用于抗生素检测的纳米传感器，其特征在于，所述的特定的抗生素为卡那霉素或氯霉素或链霉素或氨苄青霉素或新霉素或四环素。
5.根据权利要求1所述的用于抗生素检测的纳米传感器，其特征在于，所述的荧光染料为Cy系列荧光染料或FAM荧光染料或Rox荧光染料或Alexa系列染料。
6.一种如权利要求1～5任一所述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为：将含有至少一种能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体的溶液加入到含有金纳米颗粒的溶液中，混合孵育10～20小时；然后加入NaCl溶液进行陈化，最后用缓冲溶液洗涤后保存在缓冲溶液中，其中，所述的核酸适配体的一端具有巯基且另一端标记有荧光染料。
7.根据权利要求6所述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法，其特征在于，所述的陈化的时间为20～30小时，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求6所述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法，其特征在于，所述的金纳米颗粒的粒径为5～30nm。
9.根据权利要求6所述的用于抗生素检测的纳米传感器的制备方法，其特征在于，所述的特定的抗生素为卡那霉素或氯霉素或链霉素或氨苄青霉素或新霉素或四环素，所述的荧光染料为Cy系列荧光染料或FAM荧光染料或Rox荧光染料或Alexa系列染料。
10.根据权利要求1～5任一所述的用于抗生素检测的纳米传感器的应用，其特征在于，所述的纳米传感器的应用方法为：向含有所述用于抗生素检测的纳米传感器的溶液加入待测物，混合均匀后加入到荧光比色皿中，分别在所述荧光染料对应的激发波长条件下，测试所述荧光染料对应的发射波长处的荧光强度，根据所测得的荧光强度与预先测定好的荧光强标准曲线进行比对，获得抗生素的种类和抗生素的浓度。
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