CN103926176A

CN103926176A - 一种测定纳米金表面上巯基修饰线性dna或核酸适配体构象的方法

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Publication number: CN103926176A
Application number: CN201410171224.9A
Authority: CN
Inventors: 娄新徽; 王文杰; 丁小凡
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: CN103926176B

Abstract

本发明涉及一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，是利用动态光散射测定组装过程中线性DNA或核酸适配体与纳米金复合物的水合粒径，结合吸附动力学，分别测定线性DNA或核酸适配体在不同表面包被量时在纳米金表面上的构象。利用本发明的方法发现在中等表面探针容量时，线性DNA在纳米金表面上的构象为连接巯基的一端缠绕在纳米金表面，另一端与表面垂直向外伸展，随着表面探针容量的增加，每条DNA探针缠绕在纳米金表面上的长度不断减小，而同时向外延伸的尾部越来越长，但纳米金表面保持被DNA碱基吸附包裹的低表面自由能状态上述构象可以描述为DILOT模型，对于核酸传感器探针设计和基于DNA杂交的纳米组装等应用具有重要的指导意义。

Description

一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法

技术领域

本发明涉及一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，属于生物技术领域。

背景技术

由巯基线性DNA或核酸适配体修饰的纳米金复合物(DNA/AuNP)，从自组装材料制备、生物传感技术，到药物传输等领域，都拥有十分重要的应用。但是最近的研究表明DNA碱基会与纳米金表面发生非特异性相互作用，部分吸附在纳米金的表面，使得线性DNA杂交效率下降，使得核酸适配体与其靶标的识别能力下降。因此深入了解线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面的构象，对于优化探针设计具有十分重要的价值。现阶段对线性DNA在平面金表面上的构象研究较多，有多种表征技术，例如X射线光谱，表面等离子体共振等都被用于线性DNA在平面金表面上的构象研究。但是对于线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面上构象的研究却很少。目前仅有琼脂糖凝胶电泳技术被用于线性DNA在纳米金表面上构象的系统研究(Parak，W.J.；Pellegrino，T.；Micheel，C.M.；Gerion，D.；Williams，S.C.；Alivisatos，A.P.NanoLett.2003，3，(1)，33-36.)。该方法通过测定DNA/AuNP在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率计算其有效粒径，然后通过其有效粒径测定线性DNA的构象。琼脂糖凝胶电泳技术虽然可以用于研究线性DNA的构象变化，但是这种方法却存在许多缺陷：1.琼脂糖凝胶电泳技术需要的样品量较大，样品不能重复使用，费时费力，不适合动力学研究；2.短链DNA(小于40个核苷酸)修饰的纳米金在实际应用中很常见，但是琼脂糖凝胶电泳无法获得单条短链DNA的分辨率；3.凝胶方法计算所得的DNA/AuNP粒径实验误差较大，受凝胶比例影响，需要多次测量，费时费力；4.纳米金在琼脂糖凝胶电泳之前需要修饰提高纳米金稳定性的小分子，防止电泳时发生聚集，但在实际应用中这些小分子的存在却会干扰DNA在纳米金表面的实际构象情况，从而无法得到正确的构象信息；5.具有二级构象的适配体DNA会折叠成为紧密的二级结构，影响电泳的迁移率，从而影响对构象的研究。因此非常需要寻找一种可以高效、精确和灵敏的表征方法来探测线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面上的构象。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，该方法包括如下步骤：步骤一：利用动态光散射(DLS)测定线性DNA或核酸适配体的纳米金复合物在其组装过程中的水合粒径，步骤二：结合吸附动力学模型拟合，并通过对线性DNA或核酸适配体纳米金复合物水合粒径的直接比较，测定在不同表面容量时线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。

本发明的具体实验步骤：

(1)利用动态光散射测定组装过程中不同长度巯基修饰线性DNA或核酸适配体纳米金复合物的水合粒径的动态变化过程；

具有巯基修饰的线性DNA或核酸适配体与二硫苏糖醇(DTT)在2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液下还原后利用NAP-5柱进行两次纯化。纯化后的线性DNA或核酸适配体与纳米金(AuNP)按照一定物质的量比例混合于磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH7.4)中，室温(25℃)下孵育并利用动态光散射测定DNA/AuNP粒径变化过程。包被过程包括三个阶段：老化，加盐，温育。老化过程即包被后的17个小时内，使线性DNA或核酸适配体通过自组装过程包被于纳米金表面，该过程不另外添加盐，选取多个时间点测定粒径值；加盐过程即老化过程完成后，逐渐向纳米金与线性DNA或核酸适配体混合溶液中滴加浓度为1M氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲溶液使得盐浓度缓慢增至0.3M，选取多个盐浓度点测定DNA/AuNP的粒径；温育过程即加盐过程完成之后等待一段时间使线性DNA或核酸适配体更加完全地包被于纳米金表面，选取数个时间点测定粒径。

(2)荧光测定老化过程中DNA在纳米金表面DNA链数；

利用荧光标记和巯基修饰的线性DNA或核酸适配体在(1)相同的条件下还原并与纳米金包被。在老化过程中(0-17h)选取数个时间点对样品进行离心纯化，将包被上DNA链的纳米金沉淀复溶于二硫苏糖醇(DTT)磷酸盐缓冲溶液并过夜并离心取上清，根据标准曲线测定其上清液探针浓度并计算每个纳米金上DNA的包被量。相对应公式为：

(3)老化过程DNA在纳米金表面吸附动力学拟合；

根据准二级吸附动力学公式(公式1)(其中qe表示平衡吸附量，qt表示时间为t时的吸附量，Ks表示二级吸附速率常数)和粒径与包被量线性关系(由(2)可得)公式q_e＝kd_eq_t＝kd_t(公式2)(其中de表示平衡时纳米金粒径增加量，dt表示时间为t时的纳米金粒径增加量，k为纳米金粒径增加量与DNA吸附量之间的比例常数)得到(公式3)(其中Ks′为kKs)。将(1)获得的粒径增长量带入公式3中，若t/dt与t符合线性关系，即符合准二级吸附动力学模型。

(4)利用动态光散射测定非巯基修饰DNA链包被纳米金的过程；

没有巯基修饰的线性DNA单链与纳米金(AuNP)投入物质的量比例为500∶1，在室温条件(25℃)包被并利用动态光散射测定DNA/AuNP粒径在老化过程中的变化过程。

(5)根据(1)-(4)，建立线性DNA在纳米金表面上的构象DILOT(Dynamic Inner-Layer and Outer-Tail)模型，测定在不同表面容量时线性DNA在纳米金表面上的构象；

(6)利用动态光散射测定盐浓度对线性DNA或核酸适配体在纳米金表面构象的影响；

(7)紫外定量加盐和温育过程线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的数量；

完成包被过程的DNA/AuNP经过离心，取上清，利用紫外测定其浓度，根据包被时投入的DNA、纳米金和离心后上清的浓度和体积计算包被量。相对应公式为：

(8)根据(1)、(6)和(7)测定在加盐和温育过程不同表面容量时线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。

该方法具有如下优势：

1)DLS技术基于悬浮液中球形粒子的布朗运动会引起的不同强度的激光散射，通过强度波动得到平动系数，从而再通过斯托克斯爱因斯坦方程(Stokes-Einstein)得到粒子的水合粒径。这种技术不需要对测量样品进行额外的化学修饰，无损伤，特别是可以实时监测；

2)DLS技术的灵敏度高，所需样品量相比琼脂糖凝胶电泳技术大幅减少，且无需浓缩；

3)DLS技术的分辨率高，可以准确分辨小于40个碱基的单条短链DNA的吸附；

4)利用DNA与蛋白相比，化学基团少，结构简单，通过直接比较相同长度的线性DNA或核酸适配体的水合粒径，可以测定具有二级结构的核酸适配体在纳米金表面的构象；

5)基于本发明的方法测定在中等表面容量时，巯基修饰线性DNA在纳米金表面上的构象为连接巯基的一端缠绕在纳米金表面，另一端与表面垂直向外伸展，随着表面探针容量的增加，每条DNA探针缠绕在纳米金上的长度不断减小，而同时向外延伸的尾部越来越长，但纳米金表面保持被DNA碱基吸附包裹的低表面自由能状态，上述构象可以描述为DILOT(Dynamic Inner-Layer and Outer-Tail)模型。这个模型不仅适用于线性的DNA在纳米金表面上的构象，而且也适用于没有形成二级结构时的核酸适配体探针在纳米金表面上的构象。根据该模型可以计算不同长度线性DNA在包被过程中缠绕在纳米金表面的不能有效杂交的碱基的长度：

D_h是DNA/AuNP的水合粒径，D_Au is纳米金的直径，I_n是DNA/AuNP外层非专一性吸附DNA的厚度(～1nm)。因此该模型对于核酸传感器探针设计和基于DNA杂交的纳米组装等应用具有十分重要的指导意义。

附图说明

图1是本发明中，不同长度的巯基修饰的线性DNA：polyA₁₅，polyA₃₀，polyA₄₄，polyA₅₁在包被纳米金过程中，随着时间和盐浓度变化，polyA/AuNP的粒径变化过程。

图2是本发明中，非巯基修饰的polyA₁₅，polyA₃₀，polyA₄₄，polyA₅₁在纳米金表面老化过程中，粒径随时间变化曲线。

图3是本发明中，polyA₃₀老化过程中纳米金表面DNA链数与粒径之间的线性关系曲线。

图4A是本发明中，不同长度的polyA在纳米金表面老化过程中的准二级吸附动力学曲线。图4B二级吸附速率常数与不同长度polyA之间指数关系曲线。

图5是本发明中表示巯基修饰的线性DNA在纳米金表面的动态内部环绕外部伸展的DILOT构象模型。图5A表示具有不同长度的带有和不带有巯基修饰线性DNA在纳米金表面老化过程完成时的构象状态。图5B表示线性DNA在纳米表面的包被过程构象变化，其在包被过程中一致符合DILOT模型。图5C表示核酸适配体在纳米金表面的包被过程的构象变化，当浓度低于临界盐浓度时，其构象符合DILOT模型，当盐浓度高于临界盐浓度时，适配体开始在表面形成二级结构，不再符合DILOT模型。

图6A-6C是本发明中，巯基修饰的线性polyA/AuNP和核酸适配体(TBA₃₀，TBA₄₄，CBA₄₅，CRA₅₁)/AuNP在包被过程中粒径变化过程。

图7A-7C是本发明中，包被完全的线性DNA polyA/AuNP和核酸适配体(TBA₃₀，TBA₄₄，CBA₄₅，CRA₅₁)/AuNP在不同盐浓度下的粒径变化。

图8是本发明中，包被完全的巯基修饰的polyA/AuNP和核酸适配体(TBA₃₀，TBA₄₄，CBA₄₅，CRA₅₁)/AuNP在2％琼脂糖凝胶中的电泳照片和包被量。

具体实施方式

表1：本发明中所用的线性DNA或核酸适配体探针序列。

表2：本发明中准二级吸附动力学模型参数。

实施例1.DLS实时监测老化过程中没有巯基修饰和巯基修饰线性DNA和核酸适配体与13nm纳米金复合物的水合粒径。

将具有5’端巯基修饰的，不同长度的线性DNA：polyAl5，polyA30，polyA44，polyA51，以及具有不同长度的适配体DNA：TBA30，TBA44(牛凝血酶蛋白的适配体，Thrombin binding aptamer)，CBA45，CBA51(可卡因的适配体Cocaine binding aptamer)40μM，分别与40mM二硫苏糖醇(DTT)在2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液下还原30分钟后利用NAP-5柱进行两次纯化。纯化后的DNA与纳米金投入物质的量比例为500∶1。同时将没有巯基修饰的线性DNA单链polyA15，polyA30，polyA44，polyA51与纳米金(AuNP)投入物质的量比例为500∶1。这12条链在在磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH7.4)条件下，室温(25℃)包被并利用动态光散射测定DNA/AuNP粒径在老化过程中的变化过程(图1，2，6)。

结果说明，不具有巯基修饰的polyA在纳米金表面粒径增加约为1nm，与两个核苷酸大小(0.43nm×2)相近，说明在纳米金表面形成环绕型构象(图5A)，其中非特异性吸附是主要作用力，且不同长度的DNA具有相同的动力学过程。而具有巯基修饰的polyA在老化过程结束时，不同长度线性DNA链(polyA15，polyA30，polyA44，polyA51)修饰的AuNP的粒径增加量分别为1.5，2.8，5.2，和5.9nm，大于非特异性吸附粒径增长量(～1nm)，小于线性DNA在纳米金表面完全伸展时粒径增长量(12.9，25.8，37.8，43.9nm)说明DNA在纳米金表面构象介于环绕型和伸展型之间，属于部分环绕部分伸展的DILOT构象状态(图5A)，这种构象与无规则卷曲型构象相比其使纳米金表面自由能处于更低的状态。而且相同长度的巯基修饰的线性DNA与适配体DNA在老化过程中粒径大小和变化趋势相同，说明探针序列并不影响构象形成，粒径增加主要源于DNA特异性包被于纳米金表面数量的增加。

实施例2.测定老化过程中线性DNA在纳米金上包被量与线性DNA/AuNP水合粒径的关系。

具有5’端巯基修饰，3’端荧光FAM基团修饰的f-polyA30还原并与纳米金包被。在老化过程中选取0.2，0.5，1，2，6，10，17h的点对样品进行15000rpm离心，将沉淀复溶于1()()uL，1M二硫苏糖醇(DTT)磷酸盐缓冲溶液并过夜并离心取上清，根据标准曲线测定其上清液探针浓度并计算包被量。并观察其包被量与粒径变化之间的关系。

结果说明，粒径(y)与包被条数(x)之间符合线性关系y＝0.1779x+16.6038(R²＝0.996)(图3)。也就是说纳米金上的包被量与DNA/AuNP粒径的增长量成正比该结果与下面实施例3的结果都支持了线性DNA在纳米金表面上的DILOT模型。

实施例3.拟合线性DNA在13nm纳米金表面上的吸附动力学模型。

根据老化过程中粒径与包被量之间的线性关系q_e＝kd_eq_t＝kd_t公式2)，通过准二级动力学方程(公式1)得到(公式3)(其中Ks′为kKs)。选取不同长度巯基修饰polyA15，polyA30，polyA44，polyA51在纳米金表老化包被时0.2，0.5，1，2，6，10，17小时(h)的时间点和相应时间下的粒径增长量带入公式3中。

结果表明，t/dt与t符合线性关系(图4A)，且计算所得qe与实验所得qe高度一致(表2)，即巯基修饰的DNA在纳米金表面的吸附过程符合准二级吸附动力学模型；同时表明巯基在纳米金表面的化学吸附过程是控制动力学包被的限速步，所以粒径的增加是DNA特异性包被于纳米金表面的数量的增加而引起的。而且DNA链越长，吸附速率K’s越小(图4B)，表明越长的DNA链在纳米金表面环绕的部分越长，亲和力越大。因此越难被其它的DNA链取代和表面重排，所以包被过程越缓慢；体现在粒径变化上为：DNA链越长，达到粒径平衡的时间越长，例如polyA15，在2h粒径即达到平衡，而polyA51在老化时间完成时(17h)仍未达到平衡(图1)。该动力学数据有力支持了DILOT模型。

实施例4.DLS检测在加盐和温育过程中巯基修饰线性DNA和核酸适配体与13nm纳米金复合物的水合粒径。

利用DLS检测具有巯基修饰的不同长度的线性DNA(polyA15，polyA30，polyA44，polyA51)和适配体DNA(TBA30，TBA44，CBA45，CBA51)的纳米金在加盐和温育过程中粒径变化，选取浓度为0，0.02，0.06，0.12，0.2，0.3M时的盐浓度时的粒径进行测量。

结果表明，加盐过程中，随着盐浓度不断提高，钠离子的引入减小了带负电性DNA和纳米金之间的斥力，使纳米金表面的DNA链数量不断增加，DNA/AuNP的粒径不断地提高；在达到临界盐浓度之前，线性DNA与适配体DNA的粒径变化趋势相同，说明它们在纳米金表面的构象变化相同，都是动态的内部环绕与外部伸展的DILOT构象；但是盐浓度超过临界盐浓度时，核酸适配体开始形成二级构象，粒径变化开始小于线性DNA的粒径变化(图6)。

实施例5.包被完全的线性DNA polyA/AuNP和适配体DNA(TBA30，TBA44，CBA45，CBA51)/AuNP在不同盐浓度下的粒径变化。

按照实施例4的方法包被完成DNA/AuNP，然后将DNA/AuNP复溶至不同浓度的NaCl磷酸盐缓冲溶液(10mM PB，pH7.4)中，并利用紫外法测量八种探针的包被量，并用琼脂糖凝胶电泳证明。

结果表明随着盐浓度的升高，核酸适配体纳米金复合物比线性DNA纳米金复合物在相同的盐浓度下具有更小的水合粒径，是由于核酸适配体折叠为更为紧凑的二级结构；同时核酸适配体环绕在纳米金表面的部分，因为参与构象的折叠使得纳米表面更多的裸露，折叠构象也减小了空间位阻，使得更多的适配体通过巯基的作用包被于纳米金表面，表现为比同等长度的线性DNA更高的包被量。这也通过紫外可见光谱定量和凝胶电泳迁移率的降低得到证实(图7)。这些结果说明核酸适配体在超过临界盐浓度时不再符合DILOT模型(图5C)。

Claims

1.一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一：利用动态光散射(DLS)测定线性DNA或核酸适配体的纳米金复合物在其组装过程中的水合粒径，步骤二：结合吸附动力学模型拟合，并通过对线性DNA或核酸适配体纳米金复合物水合粒径的直接比较，测定在不同表面容量时线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一是利用动态光散射测定组装过程中不同长度巯基修饰线性DNA或核酸适配体纳米金复合物的水合粒径的动态变化过程。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一如下：具有巯基修饰的线性DNA或核酸适配体与二硫苏糖醇(DTT)在2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液下还原后利用NAP-5柱进行两次纯化；纯化后的线性DNA或核酸适配体与纳米金(AuNP)按照一定物质的量比例混合于磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH7.4)中，室温(25℃)下孵育并利用动态光散射测定DNA/AuNP粒径变化过程；包被过程包括三个阶段：老化，加盐，温育；老化过程即包被后的17个小时内，使线性DNA或核酸适配体通过自组装过程包被于纳米金表面，该过程不另外添加盐，选取多个时间点测定粒径值；加盐过程即老化过程完成后，逐渐向纳米金与线性DNA或核酸适配体混合溶液中滴加浓度为1M氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲溶液使得盐浓度缓慢增至0.3M，选取多个盐浓度点测定DNA/AuNP的粒径；温育过程即加盐过程完成之后等待一段时间使线性DNA或核酸适配体更加完全地包被于纳米金表面，选取数个时间点测定粒径。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤二还包括如下步骤：荧光测定老化过程中DNA在纳米金表面DNA链数和老化过程DNA 在纳米金表面吸附动力学拟合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1还包括利用动态光散射测定非巯基修饰DNA链包被纳米金的过程。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，荧光测定老化过程中DNA在纳米金表面DNA链数是如下步骤：

利用荧光标记和巯基修饰的线性DNA或核酸适配体在(1)相同的条件下还原并与纳米金包被；在老化过程中(0-17h)选取数个时间点对样品进行离心纯化，将包被上DNA链的纳米金沉淀复溶于二硫苏糖醇(DTT)磷酸盐缓冲溶液并过夜并离心取上清，根据标准曲线测定其上清液探针浓度并计算每个纳米金上DNA的包被量，相对应公式为：

老化过程DNA在纳米金表面吸附动力学拟合是如下步骤：

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，建立线性DNA 在纳米金表面上的构象DILOT(Dynamic Inner-Layer and Outer-Tail)模型，测定在不同表面容量时线性DNA在纳米金表面上的构象。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤一还包括如下步骤：利用动态光散射测定盐浓度对线性DNA或核酸适配体在纳米金表面构象的影响。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：紫外定量加盐和温育过程线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的数量：

完成包被过程的DNA/AuNP经过离心，取上清，利用紫外测定其浓度，根据包被时投入的DNA、纳米金和离心后上清的浓度和体积计算包被量，相对应公式为：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：测定在加盐和温育过程不同表面容量时线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。