CN106984827A - 一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料的制备方法，包括将二硫苏糖醇、氯金酸按照3:1的体积比例混合均匀，并溶于超纯水中，得到原料混合物溶液；将所述原料混合物溶液置于室温中搅拌10‑30min，得到纳米粒子分散液；将步骤2的纳米粒子分散液用透析袋透析24h，将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料。该金纳米材料合成方便，荧光性能优越并且稳定，同时具有优良的生物兼容性，运用该金簇，我们能够将外源基因进行包裹，并导入靶细胞中，完成基因治疗的目的。

Description

一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料、制备方法及应用

技术领域

本发明属于金纳米材料制备技术领域，具体涉及一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料、制备方法及应用。

背景技术

近年来，荧光标记在生物科学和临床医学等领域，已经成为一种非常重要的研究工具。目前来说，荧光标记材料通常包括贵金属纳米簇、量子点、复合荧光纳米粒子和有机染料。由于量子点和有机小分子染料对于生物体的毒性一般较大，贵金属纳米簇的合成成本也不低，所以复合荧光纳米的材料的优势才体现出来。

一般来说，复合荧光纳米材料具有合成方法简单、制备成本低廉、良好的生物相容性和荧光性能稳定的特点，越来越受到国内外研究者的广泛关注，尤其是其具有良好的生物相容性，使其在生物科学和临床医学的荧光标记的有着非常广阔的前景。

基因治疗已被证明是一种有效的治疗癌症的方法并且几乎没有副作用。非病毒基因载体包括阳离子脂质，聚合物，树枝状聚合物和肽在安全性，低免疫原性，生物相容性，以及大规模生产方面都有着很大的潜力。然而，相比于病毒载体，相比于病毒载体接近100％的转染效率，非病毒载体10％-60％的转染效率仍然是其不能广泛应用的最大瓶颈。因此，有必要通过组合化学筛选分子结构并且设计新型仿病毒纳米结构。

发明内容

本发明提供的一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料、制备方法及应用，首次制备出高生物兼容性的DTT纳米金簇，解决了现有非病毒载体转染效率低的问题。

本发明提供了一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将二硫苏糖醇、氯金酸按照3:1的体积比例混合均匀，并溶于超纯水中，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液置于室温中搅拌10～30min，得到纳米粒子分散液；

步骤3，将步骤2的纳米粒子分散液用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料。

优选的，上述利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料的制备方法中，步骤3中，所述真空冷冻干燥的温度为-20～-50℃、真空度为5～10Pa。

本发明还提供了一种根据上述利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料的制备方法制备而成的金纳米材料。

本发明还提供了一种上述金纳米材料作为非病毒载体用于基因治疗。

本发明还提供了一种上述金纳米材料在基因治疗中的应用，包括以下步骤：

S1，将所述金纳米材料制备成金纳米粒子分散液，并制备外源基因溶液；

S2，将所述金纳米粒子分散液与外源基因溶液混合均匀，其中，金纳米粒子分散液中金纳米粒子与外源基因溶液中外源基因的摩尔比例为15:1，搅拌10～20min，得到基因包裹金簇；

S3，将基因包裹金簇导入靶细胞中，并诱导外源基因在靶细胞中表达，达到基因治疗的目的。

与现有技术相比，本发明的利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料具有以下有益效果：

该金纳米材料合成方便，荧光性能优越并且稳定，同时具有优良的生物兼容性。运用该金纳米材料，我们能够将外源基因进行包裹，并导入靶细胞中，完成基因治疗的目的，该金纳米材料作为非病毒载体的转染效率大于85％，相比于现有技术大幅度提高。

附图说明

图1为本发明金纳米材料的TEM图；

图2为本发明金纳米材料的粒径统计分析；

图3为本发明金纳米材料的荧光性能表征；

图4为本发明金纳米材料与质粒结合后的TEM图；

图5为本发明金纳米材料转运质粒进入酵母细胞的荧光共聚焦检测图。

其中，图5a为对照组405nm激发波长、600-700nm发射波长下细胞，图5b为对照组488nm激发波长、500-550nm发射波长下细胞，图5c为图a的明场通道观察结果，图5d为图a和图b的重叠图，图5e为实验组405nm激发波长、600-700nm发射波长下细胞，图5f为实验组488nm激发波长、500-550nm发射波长下细胞，图5g为图e的明场通道观察结果，图5h为图e和图f的重叠图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明提供的一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，包括以下实施例：

实施例1

一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，包括以下步骤：

步骤1，将30mL二硫苏糖醇和10mL氯金酸混合均匀，并溶于100mL超纯水中，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液置于室温中搅拌20min，得到纳米粒子分散液；

步骤3，将步骤2的纳米粒子分散液用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，该金纳米材料是粉末状态；所述真空冷冻干燥的温度为-20～-50℃、真空度为5～10Pa。

实施例2

一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，包括以下步骤：

步骤1，将300mL二硫苏糖醇和100mL氯金酸混合均匀，并溶于1000mL超纯水中，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液置于室温中搅拌10min，得到纳米粒子分散液；

步骤3，将步骤2的纳米粒子分散液用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，该金纳米材料是粉末状态；所述真空冷冻干燥的温度为-20～-50℃、真空度为5～10Pa。

实施例3

一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，包括以下步骤：

步骤1，将30mL二硫苏糖醇和10mL氯金酸混合均匀，并溶于200mL超纯水中，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液置于室温中搅拌30min，得到纳米粒子分散液；

步骤3，将步骤2的纳米粒子分散液用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料，该金纳米材料是粉末状态；所述真空冷冻干燥的温度为-20～-50℃、真空度为5～10Pa。

为了观察本发明的利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料在水中的分散性，我们将实施例1的步骤3中得到的透析袋内的溶液置于透射电镜下观察，图1为透析袋内的金纳米材料的TEM图，由图1可以看出视野中的纳米粒子均匀分布，说明纳米粒子在水中具有良好的分散性，图2为本发明金纳米材料的粒径统计分析，多数纳米粒子的粒径在1.5-3之间，均匀分布。

图3为本发明金纳米材料的荧光性能表征，纳米粒子在603nm出现强度为150的特征峰，表明纳米粒子具有良好的荧光性能。

此外，我们将包裹有外源基因的金簇置于透射电镜下观察其形貌特征，结果如图4所示，由图4可以看出，外源基因在金簇的包裹下，可以形成500nm左右的球形结构，包裹程度良好，可以被用于导入靶细胞。

为了验证本发明的金纳米材料可以用于基因治疗，我们以酵母细胞为例，参照实施例1的方法，将外源基因导入酵母细胞中，

S1，将所述利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料粉末制备成1.5mmol/L金纳米粒子分散液，制备1mmol/L外源基因溶液；

S2，将所述纳米粒子分散液与外源GFP基因溶液以15:1的体积比例室温混合均匀，得到的混合液中金纳米粒子与外源基因的摩尔比例为15:1，搅拌10～20min，得到基因包裹金簇；

S3，将基因包裹金簇导入靶细胞中，并诱导外源基因在靶细胞中表达，达到基因治疗的目的，具体为：

S(1)，将100μL基因包裹金簇与100μL重悬于PBS溶液的酵母细胞(OD₆₀₀＝10)混合，室温下孵育6h，得到孵育后的细胞；

S(2)，将孵育后的细胞于12000rpm，4℃离心30s，收集沉淀，PBS清洗沉淀两次，最后将沉淀重悬在200μL半乳糖YPD培养基中，诱导表达3h，表达后的外源基因可以用于基因治疗；

其中，半乳糖YPD培养基的配方为：4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g半乳糖，溶于200ml超纯水。

最后，我们以外源GFP基因导入的酵母细胞作为实验组，以单纯的酵母细胞为对照组，通过荧光共聚焦观察外源基因的导入情况，结果如图5所示。

图5a为对照组405nm激发波长、600-700nm发射波长下细胞，图5b为对照组488nm激发波长、500-550nm发射波长下细胞，图5c为图a的明场通道观察结果，图5d为图a和图b的重叠图，图5e为实验组405nm激发波长、600-700nm发射波长下细胞，图5f为实验组488nm激发波长、500-550nm发射波长下细胞，图5g为图e的明场通道观察结果，图5h为图e和图f的重叠图。

图5e、图5f、图5g、图5h可以看出，金簇能够很好地进入细胞，并进行荧光标记；图5b、图5f表明细胞能够表达绿色荧光蛋白，也证明我们的质粒成功进入细胞并表达；图5c、图5g、图5d、图5h表明，红色的金簇信号能够很好地跟GFP信号重叠，进行细胞标记。

由此，我们判断本发明的金纳米材料能够携带外源基因进入宿主细胞中，并使外源基因在宿主细胞中成功表达，该金纳米材料作为非病毒载体的转染效率大于85％，相比于现有技术大幅度提高，在基因治疗方面具有良好的应用前景。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将二硫苏糖醇、氯金酸按照3:1的体积比例混合均匀，并溶于超纯水中，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液置于室温中搅拌10～30min，得到纳米粒子分散液；

步骤3，将步骤2的纳米粒子分散液用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料。

2.根据权利要求1所述的运送DNA的非病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述真空冷冻干燥的温度为-20～-50℃、真空度为5～10Pa。

3.根据权利要求1或2所述的利用二硫苏糖醇合成的金纳米材料的制备方法制备而成的金纳米材料。

4.根据权利要求3所述的金纳米材料作为非病毒载体用于基因治疗。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将所述金纳米材料制备成金纳米粒子分散液，并制备外源基因溶液；

S2，将所述金纳米粒子分散液与外源基因溶液混合均匀，其中，金纳米粒子分散液中金纳米粒子与外源基因溶液中外源基因的摩尔比例为15:1，搅拌10～20min，得到基因包裹金簇；

S3，将基因包裹金簇导入靶细胞中，并诱导外源基因在靶细胞中表达，达到基因治疗的目的。