CN108982421A - 硫酸新霉素的分析检测方法 - Google Patents

Abstract

硫酸新霉素的分析检测方法，涉及硫酸新霉素。合成金纳米粒子；制备Au@PVP核壳纳米粒子溶胶；取Au@PVP核壳纳米粒子溶胶，测定Au@PVP核壳纳米粒子溶胶的表面等离子体共振吸收谱；硫酸新霉素的定量分析检测。利用硫酸新霉素的氨基能够和Au@PVP核壳纳米粒子上的PVP的吡咯烷酮的氧形成氢键，诱导Au@PVP核壳纳米粒子发生团聚，导致其在542nm处的表面等离子体共振吸收降低，从而实现对硫酸新霉素的定量分析检测。该方法，样品前处理过程简单，不需要昂贵的仪器设备和较高的操作技术要求，可满足快速分析检测的要求。利用纳米粒子对一些物质超敏感而随即发生团聚的现象，简单、快速、可视、高灵敏。

Description

硫酸新霉素的分析检测方法

技术领域

本发明涉及硫酸新霉素，尤其是涉及通过水热合成法制备Au@PVP核壳纳米粒子，利用 硫酸新霉素诱导核壳纳米粒子发生聚集反应，降低Au@PVP核壳纳米粒子的表面等离子体 共振吸收，根据降低的程度对硫酸新霉素进行分析检测。

背景技术

硫酸新霉素(NEO)是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的氨基糖苷类抗生素。 此类抗生素常用作兽药，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放，从而导致细 菌死亡。常被作用于革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌、产气杆菌，以及治疗水产动物由气单细胞菌、爱德华氏菌等引起的肠道疾病等(高玲.水产品中氨基糖苷类药物残留的高效液相色谱-串联质谱检测方法研究[J].中国兽药杂志,2012,46(11):27-30；刘 永涛.固相萃取-高效液相色谱/串联质谱法测定水产品中硫酸新霉素残留量[J].分析科学学 报,2017,33(1):6-10；柳富荣.渔用抗生素类药物[J].湖南农业，2016,(1)：27.)。但是，一些 养殖户过度追逐利益，非法将此类抗生素添加在饲料里面，超量或长期不合理用药造成药 物残留问题。人类在食用了这类抗生素超标的动物源性食物时会受到较大的危害(张 静.HPLC-MS/MS法测定饲料中硫酸新霉素的含量[J].饲料研究,2017,(11):27-32.)，例如常常 导致耳聋，引起各种肾病及心血管疾病(赵壮.氨基糖苷类药物耳毒性的斑马鱼模型的研究 [J].药学学报,2011,46(8):928-935；舒卫宁.硫酸新霉素对新生大鼠离体培养耳蜗毛细胞的毒 性作用研究[J].中国儿科学杂质，2010,8(1):105-109.)等。目前，欧盟规定有鳍鱼类中硫酸 新霉素的残留限量为500μg/kg(CommissionImplementing RegμLation(EU)No.1056(2013) Amending the Annex to RegμLation EU)No 37/2010on pharmacologically active substances and their classificationregarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin,as regardsthe substance neomycin.)，日本规定鱼类、去壳软体动物、甲壳纲动物等中新霉素最高残留 量值为500ug/Kg(Japanese Ministry of Health,Labor,Positive List of the2003Amendment to the Food Hygiene Law(肯定列表《食品卫生法2003修订案》))。我国仅规定了畜禽中硫酸新 霉素的最高残留量为500ug/Kg(Announcement No.235of theMinistry of AgricμLture of the People's Republic of China.Maximum ResidueLimits of Veterinary Drugs in Animals Foods(中 国人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中最高残留限量》))。因此，发展水产品中 新霉素的快检方法，严格控制其在水产品中的残留量具有重要意义。

目前，该类抗生素的检测方法主要有微生物测定法、色谱法和分光光度法。微生物法 不适合定量分析。对于常用色谱法，由于新霉素结构中缺少发色团或荧光团，很难用常规 的液相色谱法进行检测，一般需要对其进行柱前衍生化，或通过免疫层析亲和柱纯化后再 衍生化。衍生化过程复杂繁琐，不易操作，稳定性不高。另一种是通过在液相色谱柱后串联一些检测技术，如蒸发光检测、电泳、脉冲安培检测、电化学检测、质谱或二级质谱质 谱等，通过转变为光或电信号进行检测。这些检测技术往往要求液相色谱采用挥发性离子 对试剂作为流动相，分析时对仪器和色谱柱的损伤大，需要对离子源和色谱定期清洗以防 污染和灵敏度下降，而且检测成本高，耗费时间长，样品前处理复杂，因而不适用于大批 量样品的检测。

分光光度法，因其操作简单、稳定性好、检测速度快、成本低，而被用于抗生素的检测。Zonghui Qin等人(秦宗会.曲利本红分光光度法测定氨基糖苷类抗生素[J].理化检验(化学 分册),2005,(7):486-489.)利用曲本利红与氨基糖苷类抗生素发生显色反应对氨基糖苷类抗 生素进行检测，检测范围是0～1.8×10^-2mol/L。( I.Kinetic-spectrophotometric determination of neomycin[J].Journal of AnalyticalChemistry,2015， 70(2)：234-239.)利用动力学比色分光光度法测定眼药水中的硫酸新霉素，检测范围约为 1.7×10^-4～8.5x 10^-5mol/L。这些方法主要是通过溶液的显色反应进行分析检测，一般检测 限高，无法满足痕量检测要求。

尽管文献报道了通过加入少量一些特定物质，纳米粒子会发生团聚的现象，但是迄今 为止，并无利用这种现象对抗生素进行分析检测的报道。`

发明内容

本发明的目的在于提供能够利用纳米粒子对一些物质超敏感而随即发生团聚的现象， 实现硫酸新霉素的高灵敏、快速检测，方法简单、快速、可信度高的硫酸新霉素的分析检 测方法。

本发明首先在溶液中合成Au@PVP纳米粒子，然后分别探究pH值、Au@PVP与硫酸 新霉素结合的量比，对Au@PVP核壳纳米粒子在542nm处表面等离子体共振吸收的影响， 通过Au@PVP核壳纳米粒子表面等离子体共振吸收的降低幅度间接检测硫酸新霉素，实现 硫酸新霉素的低浓度、高灵敏的快速定量分析检测。

本发明包括以下步骤：

1)合成金纳米粒子；

在步骤1)中，所述合成金纳米粒子的具体方法可为：用柠檬酸钠还原氯金酸制备金纳 米粒子溶胶(AuNPs溶胶)，通过控制反应物的浓度、反应时间、反应温度、搅拌速度、反应条件，在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸三钠，继续加热回流30～50min，使其完全反应后自然冷却至室温，制得粒径均一的金纳米粒子；所述金纳米粒子可为球形或椭圆形金纳米粒子，粒径可为50±10nm，氯金酸的质量浓度分数可0.01％～0.05％，柠檬酸钠质量浓度分数可为0.8％～1.5％，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为120～150，反 应温度可为95～105℃，反应时间可为30～50min，搅拌速度可为1500～2000r/min。

2)制备Au@PVP核壳纳米粒子溶胶；

在步骤2)中，所述制备Au@PVP核壳纳米粒子的具体方法可为：取AuNPs溶胶，搅 拌下加入PVP溶液反应，制得Au@PVP核壳纳米粒子溶胶；所述搅拌的转速可为1000r/min， 反应的时间20～30min，制得Au@PVP核壳纳米粒子可为球形或椭圆形，粒径可为50～ 80nm，所述AuNPs溶胶的体积可为20～30ml，所述PVP溶液的质量浓度分数可为0.7％～ 1.2％，Au纳米粒子与PVP体积比可为(130～200)︰1，合成的Au@PVP核壳纳米粒子的 PVP壳层的厚度可为2.5～3.7nm；

所述Au@PVP核壳纳米粒子溶胶的表面等离子体共振吸收是Au@PVP核壳纳米粒子溶胶本身在542nm波长处具有的表面等离子体共振吸收，当加入硫酸新霉素后，Au@PVP 核壳纳米粒子发生团聚，在该处的表面等离子体共振吸收峰强度降低。

3)取Au@PVP核壳纳米粒子溶胶，测定Au@PVP核壳纳米粒子溶胶的表面等离子体共振吸收谱；

4)硫酸新霉素的定量分析检测。

在步骤4)中，所述硫酸新霉素的定量分析检测的具体方法可为：取Au@PVP核壳纳米粒子溶胶，在一定的pH条件下，加入不同体积的硫酸新霉素，随着加入硫酸新霉素量的增加，Au@PVP核壳纳米粒子溶胶会发生凝聚，其表面等离子体吸收强度减弱，利用 Au@PVP核壳纳米粒子溶胶表面等离子体共振吸收峰的降低程度与硫酸新酶素的量成反 比，对硫酸新霉素进行定量分析。

在步骤4)中，所述一定的pH条件是调节硫酸新霉素与Au@PVP混合溶液的pH值在4.0～5.0；

所述Au@PVP与硫酸新霉素溶液的不同体积比是指Au@PVP︰硫酸新霉素＝1︰(0～0.5)；

所述Au@PVP溶胶的表面等离子体吸收强度是指Au@PVP核壳纳米粒子在542nm 处的等离子共振吸收值。

所述定量分析检测，是指以浓度的负对数值为横坐标，即以硫酸新霉素浓度的负对数 为横坐标，以Au@PVP表面等离体共振吸收强度减小程度，即空白核壳纳米粒子在542nm 处吸光度与其在硫酸新霉素加入后的吸光度的差值为纵坐标，建立标准曲线；定量分析的 线性范围可为10～10000nmol/L，线性相关系数(R²)可为0.99以上，回收率在77％～ 106％之间，检测限可以低至10nmol/L。

本发明提出一种利用Au@PVP团聚效应检测硫酸新霉素的方法，利用硫酸新霉素的氨基能够和Au@PVP核壳纳米粒子上的PVP的吡咯烷酮的氧形成氢键，诱导Au@PVP核 壳纳米粒子发生团聚，导致其在542nm处的表面等离子体共振吸收降低，从而实现对硫酸 新霉素的定量分析检测。该方法，样品前处理过程简单，不需要昂贵的仪器设备和较高的 操作技术要求，可以满足快速分析检测的要求。

本发明能够利用纳米粒子对一些物质超敏感而随即发生团聚的现象，建立简单、快速、 可视、高灵敏分析检测的新方法。本发明通过水热合成法制备Au@PVP核壳纳米粒子，利 用硫酸新霉素的氨基与Au@PVP的PVP壳层上吡咯烷酮上的氧之间形成氢键，诱导纳米粒子发生聚集，使Au@PVP核壳纳米粒子在542nm处的表面等离子体共振吸收强度降低，通 过降低幅度间接检测硫酸新霉素，实现硫酸新霉素的高灵敏、快速检测。通过优化pH、 Au@PVP与硫酸新霉素量比、以及前处理，将此方法用于罗非鱼样品中硫酸新霉素的检测， 方法简单、快速、可信度高。

附图说明

图1为本发明步骤1)中制备的Au@PVP核壳纳米粒子的扫描电子显微镜图。

图2为本发明步骤1)中制备的Au@PVP与不同浓度的硫酸新霉素作用后扫描电子显微 镜图。

图3为本发明步骤1)中制备的Au@PVP核壳纳米粒子在加入硫酸新霉素后的表面等离 子共振吸收谱图。

图4为本发明步骤3)中硫酸新霉素与Au@PVP核壳纳米粒子在不同体积比条件下的Au@PVP核壳纳米粒表面等离子共振吸收谱。

图5为本发明步骤4)中Au@PVP核壳纳米粒子在加入不同浓度硫酸新霉素后的表面等 离子共振吸收谱。

插图5-1为本发明步骤4)中Au@PVP核壳纳米粒子在加入不同浓度硫酸新霉素后，Au@PVP核壳纳米粒子团聚后溶胶颜色变化图。

图6为本发明步骤4)中空白Au@PVP核壳纳米吸光度与其在硫酸新霉素加入后的吸光 度的差值与硫酸新霉素浓度负对数的线性关系图。

图7为本发明步骤1)中制备的不同纳米粒子在加入硫酸新霉素结合后，纳米粒子溶胶 颜色变化对比图。

图8为本发明步骤1)中制备的Au@PVP核壳纳米粒子在加入不同物质后的表面等离子 体共振吸收谱。

图9为不同浓度的硫酸新霉素水溶液的UV-Vis谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1)合成Au@PVP纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后， 持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

化学还原法制备Au@PVP核壳纳米粒子。取20ml AuNPs溶胶于洁净的烧瓶中，加入100μL 1％的PVP溶液。室温下1000r/min搅拌25min，可制得PVP壳层厚度约为3.5nm 的Au@PVP核壳纳米粒子。核壳纳米粒子的粒径大小、形状及壳层厚度经透射电子显微镜 进行表征。(参见图1和图2)。

2)将1)中合成Au@PVP纳米粒子与不同浓度的硫酸新霉素结合后，透射电子显微镜进行表征及紫外检测(参见图2和图3)。

图1为第一步中制备的Au@PVP核壳纳米粒子的扫描电子显微镜图。在图1中，标尺为200nm(图A和图B)和20nm(图C和图D)。从图1中可以看出Au纳米粒子周围包裹有 PVP壳层，壳层厚度约为3.5nm(图C)，经多次水洗后PVP壳层并没有消失(图D),说明 Au@PVP核壳纳米粒子性质稳定。

图2为实施例1中制备的Au@PVP与硫酸新霉素结合后的测试结果。图中A为合成的Au@PVP纳米粒子，B为Au@PVP与10^-5mol/L硫酸新霉素结合后的TEM图。由图可知， 当加入一定浓度的硫酸新霉素后，Au@PVP核壳纳米粒子发生聚集(见图B)，硫酸新霉素 与核壳纳米粒子壳层上的吡咯烷酮之间存在相互作用，可以诱导该核壳纳米粒子发生聚集 反应。

图3为实施例1中制备的Au@PVP与不同浓度的硫酸新霉素结合后的紫外测试结果。图a-d加入硫酸新霉素的浓度分别为0mol/L、10^-7mol/L、10^-6mo/L、10^-5mol/L。从图中可 以看出Au@PVP溶胶在542nm处有一等离子体共振吸收峰。当加入硫酸新霉素(10^-6mol/L， 见图c)后，Au@PVP溶胶在542nm处的等离子体共振吸收峰强度下降，同时在长波长处 出现一个新吸收峰(～660nm)。随着加入硫酸新霉素量的增加(10^-5mol/L，见图d)，Au@PVP 的等离子体共振吸收峰的强度下降越明显，且出现的新吸收峰会发生红移(～780nm)。这 种现象表明硫酸新霉素与Au@PVP核壳纳米粒子之间存在相互作用，即由硫酸新霉素上的 氨基与PVP上的吡咯烷酮上的氧之间形成氢键。这种氢键作用会诱导核壳纳米粒子发生团 聚，使Au@PVP核壳纳米粒子的尺寸及表面性质发生变化，导致核壳纳米粒子的表面等离 子体共振峰强度下降，并在长波长处又出现了一个新的吸收峰，且聚集越明显，尺寸变得 越大，新峰发生红移就会越明显。

实施例2

1)合成Au@PVP纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后， 持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

化学还原法制备Au@PVP核壳纳米粒子。取20ml的AuNPs溶胶于洁净的烧瓶中，加入100μL 1％的PVP溶液，室温下1000r/min搅拌25min，可制得PVP壳层厚度约为3.5nm 的Au@PVP核壳纳米粒子。核壳纳米粒子的粒径大小、形状及壳层厚度经透射电子显微镜 进行表征(参见图1)。

2)Au@PVP核壳纳米粒子与硫酸新霉素结合最佳比：

Au@PVP与10^-5mol/L硫酸新霉素水溶液按照不同的体积比混合后，测定Au@PVP核壳纳米粒子的表面等离子体共振吸收谱，确定Au@PVP与硫酸新霉素的最佳比例。

图4为实施例2的实验结果,即固定Au@PVP及硫酸新霉素的浓度，控制它们的体积比不同表面等离子体共振吸收谱图。图a～f中，Au@PVP与硫酸新霉素体积比分别为1︰0、 1︰0.5、1︰0.4、1︰0.2、1︰0.1、1︰0.07。可以看出，加入不同体积的硫酸新霉素后，Au@PVP 溶胶表面等离子体共振吸收发生大幅度降低，当加入其体积比为1︰0.1时，Au@PVP溶胶 的紫外吸收降到最大幅度，下降约80％。因此后续检测中加入Au@PVP与硫酸新霉素体积 比固定为1︰0.1。

实施例3

1)合成Au@PVP纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后， 持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

化学还原法制备Au@PVP核壳纳米粒子。取20ml的AuNPs溶胶于洁净的烧瓶中，加入100μL 1％的PVP溶液，室温25℃下1000r/min搅拌20min，可制得PVP壳层厚度约 为3.5nm的Au@PVP核壳纳米粒子。核壳纳米粒子的粒径大小、形状及壳层厚度经透射 电子显微镜进行表征(参见图1)。

2)硫酸新霉素的定量分析检测：

配制不同浓度的硫酸新霉素水溶液(10^-4mol/L、10^-5mol/L、5.3x10^-5mol/L、10^{- 6}mol/L、 10^-7mol/L、10^-8mol/L)分别与Au@PVP按照0.1︰1的体积比混合，利用紫外分光光度计测 定Au@PVP核壳纳米粒子的表面等离子体共振吸收谱，根据吸光度绘制标准曲线。

图5为实施例3的实验结果谱图，插图5-1为实施例3不同浓度的硫酸新霉素加入后Au@PVP溶胶颜色变化图，图6为实施例3实验结果的拟合标准曲线图。在图5中，图a-f 硫酸新霉素的浓度分别为0M，10^-8M，10^-7M，10^-6M，10^-5M，10^-4M。从图中可以看到， 可以看出，随着硫酸新霉素量的增加，Au@PVP核壳纳米粒子表面等离子共振吸收峰强度 发生不同程度的降低。并且随着硫酸新霉素溶液浓度的增加，酒红色的Au@PVP溶胶在 1min内会变成紫黑色(见图5-1(a～e))，且随药物浓度的增加，颜色依次加深。但当加入 的硫酸新霉素溶液的浓度超过10^-5mol/L，溶液颜色色差不明显(见图5-1(a～b))。这可能 是因为溶液的浓度超过10^-5mol/L时，Au@PVP吸附硫酸新霉素接近饱和，即使硫酸新霉素 浓度增加，Au@PVP溶胶聚集程度不再发生变化，Au@PVP溶胶颜色也不再发生变化。因 此根据Au@PVP核壳纳米粒子溶胶颜色的变化，通过肉眼识别初步判断硫酸新霉素的大致 浓度范围，对硫酸新霉素进行快速的初筛及定性分析。在图6中，以硫酸新霉素浓度(mol/L) 的负对数为横坐标，以Au@PVP处表面等离体强度减小程度，即空白核壳纳米在542nm处 吸光度与其在硫酸新霉素加入后的吸光度的差值为纵坐标，误差棒表示标准偏差。在图6 中，线性范围为10～10000nmol/L，拟合标准曲线方程为y＝-0.21lg[C/mol L^-1]+1.666，线性 相关系数为R²＝0.9811，计算得到硫酸新霉素的检测限为10^-8mol/L，这一结果表明，在该方 法可以实现对硫酸新霉素的定量检测。

实施例4

1)合成Au@PVP纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后， 持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

化学还原法制备Au@PVP核壳纳米粒子。取20ml的AuNPs溶胶于洁净的烧瓶中，加入100μL 1％的PVP溶液，室温下1000r/min搅拌25min，可制得PVP壳层厚度约为3.5nm 的Au@PVP核壳纳米粒子。核壳纳米粒子的粒径大小、形状及壳层厚度经透射电子显微镜 进行表征(参见图1)。

2)Au@PVP与硫酸新霉素结合特异性：

Au@PVP、AuNPs分别与10^-5M硫酸新霉素按照1︰0.1的体积比混合后，观察各混合 液颜色的变化。

Au@PVP、AuNPs分别与10^-5M硫酸新霉素、10^-5M氯四环素盐酸盐、10^-5M黄曲霉毒 素B1、1mol/L NaCl、1mol/L KI按照1︰0.1的体积比混合后，进行紫外测定。

图7为实施例4的实验结果，图a为空白Au@PVP溶液，图b为AuNPs与10^-5mol/L硫 酸新霉素结合后的颜色变化图，图c为Au@PVP与10^-5mol/L硫酸新霉素结合后的颜色变 化图，由图可知，AuNPs与硫酸新霉素作用后溶液颜色保持不变(图b)，而Au@PVP与硫 酸新霉素结合后溶胶颜色发生明显变化(图c)，说明硫酸新霉素分子与Au@PVP的PVP壳 层结合具有特异性。

图8为实施例4的实验结果，图a～f分别为Au@PVP与10^-5M硫酸新霉素、10^-5M氯 四环素盐酸盐、10^-5M黄曲霉毒素B1、1mol/L NaCl、1mol/L KI按照1︰0.1的体积比结合 后，Au@PVP的表面等离子体共振吸收谱图。由图知，氯化钠几乎不影响Au@PVP的表面 等离子吸收(图a)，碘化钾、氯四环素盐酸盐、黄曲霉毒素B1使Au@PVP核壳纳米粒子 的表面等离子体共振吸收下降不明显(图b～e)，而硫酸新霉素与Au@PVP作用后，Au@PVP 的表面等离子体吸收的吸光度下降显著(图f)。这说明硫酸新霉素诱导Au@PVP纳米粒子 的团聚具有特异性，可以利用这种特异性来检测硫酸新霉素。

实施例5

1)合成Au@PVP纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后， 持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

化学还原法制备Au@PVP核壳纳米粒子。取20ml的AuNPs溶胶于洁净的烧瓶中，加入100μL 1％的PVP溶液，室温25℃下1000r/min搅拌20min，可制得PVP壳层厚度约 为3.5nm的Au@PVP核壳纳米粒子。核壳纳米粒子的粒径大小、形状及壳层厚度经透射 电子显微镜进行表征(参见图1)。

2)硫酸新霉素水溶液的测定

准确称取适量硫酸新霉素标准品，溶解配制10^-3mol/L的标准储备液，将标准贮备液 稀释为浓度为0.100mol/L、0.075mol/L、0.050mol/L、0.025mol/L、0.010mol/L、0.001mol/L， 使用紫外-可见分光光度计，测定各浓度的紫外吸收谱，确定利用紫外吸收谱能够检测出 的硫酸新霉素溶液最低浓度。

图9为实施例5的实验结果谱图，图a～f，硫酸新霉素水溶液的浓度分别为0.100、0.075、 0.050、0.025、0.010、0.001mol/L，由图可以看出随着硫酸新霉素水溶液浓度的降低，其在 285nm、313nm处的吸收峰不断降低，当硫酸新霉素水溶液的浓度降低到0.001mol/L，硫酸 新霉素在这两处的吸收峰几乎消失由此可知，通过常规的紫外检测法检测硫酸新霉素，其 最低检测限为0.001mol/L，无法满足痕量检测的要求。而通过利用Au@PVP核壳纳米粒子 的团聚效应间接检测硫酸新霉素的检测限10^-8mol/L。

实施例6

1)合成Au@PVP纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后， 持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

化学还原法制备Au@PVP核壳纳米粒子。取20ml的AuNPs溶胶于洁净的烧瓶中，加入100μL 1％的PVP溶液，室温25℃下1 000r/min搅拌20min，可制得PVP壳层厚度约 为3.5nm的Au@PVP核壳纳米粒子。核壳纳米粒子的粒径大小、形状及壳层厚度经透射 电子显微镜进行表征(参见图1)。

2)利用Au@PVP核壳纳米粒子的团聚效应检测罗非鱼样品中的硫酸新霉素：

准确称取2.0g(精确至0.01g)罗非鱼鱼肉样品于15mL离心管中，加入6mL 5％三氯乙酸水溶液，剧烈震荡10min，超声5min，12000r/min离心5min，将提取液转移至另一 支15mL离心管中，再向残渣中加入6mL 5％三氯乙酸溶液重复提取一次，合并提取液于 50ml离心管中，加入2ml乙醚振荡，静置分层后，取下层溶液于烧杯中，加入5ml热氯仿， 振荡，静置分层后，取上层溶液，加入2g活性炭振荡，澄清后，过微孔滤膜，得提取液。 往提取液中加入硫酸新霉素，配制成浓度分别为10nmol/ml、100nmol/ml、1000nmol/ml、 10000nmol/ml的加标液，按照Au@PVP与硫酸新霉素体积比为1︰0.1混合，根据上述测得 的标准曲线，计算硫酸新霉素的加标回收率。每个浓度做三个平行，取平均值。

以图6中标准曲线为工作曲线，测得不同浓度硫酸新霉素在罗非鱼鱼肉中的加标回收 如表1所示。由表1知，样品的加标回收率在79.05％～105.54％，相对标准偏差RSD为1.10％～6.17％。这表明罗非鱼鱼肉中硫酸新霉素的测定回收率较高，精密度好，结果可靠。 该方法用于实际水产品硫酸新霉素的检测时，检测限低至10^-8mol/L。

表1给出利用Au@PVP核壳纳米粒子的团聚效应检测罗非鱼样品中的硫酸新霉素的加 标回收率。

表1

本发明首先合成聚乙烯吡咯烷酮包金的纳米粒子(Au@PVP)，利用硫酸新霉素的氨基 与核壳纳米粒子壳层上的吡咯烷酮的氧之间形成氢键，诱导核壳纳米粒子发生聚集反应， 降低Au@PVP核壳纳米粒子表面等离子体共振吸收，通过降低幅度间接检测硫酸新霉素， 实现硫酸新霉素的低浓度、高灵敏的快速检测。本发明检测硫酸新霉素线性范围 10^-5-10^-8mol/L，相关系数0.989，检测限10^-8mol/L。本发明具有灵敏度高、检测限低、选 择性好、操作简单、快速、成本低，不需要复杂的前处理等优点。

Claims (10)

1.硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)合成金纳米粒子；

2)制备Au@PVP核壳纳米粒子溶胶；

3)取Au@PVP核壳纳米粒子溶胶，测定Au@PVP核壳纳米粒子溶胶的表面等离子体共振吸收谱；

4)硫酸新霉素的定量分析检测。

2.如权利要求1所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述合成金纳米粒子的具体方法为：用柠檬酸钠还原氯金酸制备金纳米粒子溶胶，通过控制反应物的浓度、反应时间、反应温度、搅拌速度、反应条件，在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸三钠，继续加热回流30～50min，使其完全反应后自然冷却至室温，制得粒径均一的金纳米粒子。

3.如权利要求2所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于所述金纳米粒子为球形或椭圆形金纳米粒子，粒径为50±10nm。

4.如权利要求2所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于所述氯金酸的质量浓度分数0.01％～0.05％，柠檬酸钠质量浓度分数为0.8％～1.5％，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为120～150。

5.如权利要求2所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于所述反应温度为95～105℃，反应时间为30～50min，搅拌速度为1500～2000r/min。

6.如权利要求1所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述制备Au@PVP核壳纳米粒子的具体方法为：取AuNPs溶胶，搅拌下加入PVP溶液反应，制得Au@PVP核壳纳米粒子溶胶。

7.如权利要求6所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于所述搅拌的转速为1000r/min，反应的时间20～30min，制得Au@PVP核壳纳米粒子为球形或椭圆形，粒径为50～80nm，所述AuNPs溶胶的体积为20～30ml，所述PVP溶液的质量浓度分数为0.7％～1.2％，Au纳米粒子与PVP体积比为(130～200)︰1，合成的Au@PVP核壳纳米粒子的PVP壳层的厚度为2.5～3.7nm。

8.如权利要求6所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于所述Au@PVP核壳纳米粒子溶胶的表面等离子体共振吸收是Au@PVP核壳纳米粒子溶胶本身在542nm波长处具有的表面等离子体共振吸收，当加入硫酸新霉素后，Au@PVP核壳纳米粒子发生团聚，在该处的表面等离子体共振吸收峰强度降低。

9.如权利要求1所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述硫酸新霉素的定量分析检测的具体方法为：取Au@PVP核壳纳米粒子溶胶，在一定的pH条件下，加入不同体积的硫酸新霉素，随着加入硫酸新霉素量的增加，Au@PVP核壳纳米粒子溶胶会发生凝聚，其表面等离子体吸收强度减弱，利用Au@PVP核壳纳米粒子溶胶表面等离子体共振吸收峰的降低程度与硫酸新酶素的量成反比，对硫酸新霉素进行定量分析。

10.如权利要求9所述硫酸新霉素的分析检测方法，其特征在于所述一定的pH条件是调节硫酸新霉素与Au@PVP混合溶液的pH值在4.0～5.0；

所述Au@PVP与硫酸新霉素溶液的不同体积比是指Au@PVP︰硫酸新霉素＝1︰(0～0.5)；

所述Au@PVP溶胶的表面等离子体吸收强度是指Au@PVP核壳纳米粒子在542nm处的等离子共振吸收值。