CN110044868B - 一种赭曲霉毒素a的sers检测方法 - Google Patents

Abstract

一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，涉及真菌毒素的检测。用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶；制备TGA修饰的金纳米粒子；OTA的定量检测。用巯基乙酸修饰的金纳米粒子作为SERS基底，一方面降低了金纳米粒子的表面能，提高金纳米粒子的稳定性，防止纳米粒子团聚；另一方面借助于TGA分子中游离的羧基与OTA分子中的羰基氧形成氢键，将OTA拉进金纳米粒子的局域电磁场增强区，即SERS热点区，增强拉曼检测信号。利用OTA在1265cm^‑1处的特征拉曼峰的信号强度与浓度具有线性关系，建立了简单、快速、低成本，无需复杂的特异性修饰，直接利用OTA的SERS特征峰对其进行定量的分析方法。

Description

一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法

技术领域

本发明涉及真菌毒素的检测，尤其是涉及一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法。

背景技术

赭曲霉毒素(Ochratoxin，OT)是由赫曲霉属和青霉属真菌产生的一种霉菌毒素，主要有A、B、C、D四种类型，其中赭曲霉毒素A(OTA)在赭曲霉毒素中的毒性最强，仅次于黄曲霉毒素，与人类的健康最为相关。OTA普遍存在于谷物、小麦、大麦、玉米、咖啡和葡萄酒等多种粮食商品中，对玉米及花生的污染尤为严重和普遍。OTA具有肾毒性、肝毒性，免疫毒性以及对人类和动物具有诱变作用(J Gil-Serna.Revision of ochratoxin a productioncapacity by the main species of Aspergillus section Circumdati Aspergillussteynii revealed as the main risk of OTA contamination[J].Food Control,2011,22(2):343-345；S Ozden.Occurrence of ochratoxin A in cereal-derived foodproducts commonly consumed in Turkey[J].Food Control,2012,25(1):69-74.)。国际癌症研究机构将其列为2B类致癌物质。欧盟规定，原粮谷物OTA的最高限量5μg/kg，谷物产品3μg/kg，咖啡产品5μg/kg，葡萄汁2μg/kg(J T De Magalhaes.Occurrence ofOchratoxin A in Brazilian cocoa beans[J].Food Control,2011,22(5):744-748.)。我国规定谷物及其制品中OTA最高限量为5μg/kg(GB 2761-2017食品中真菌毒素限量[S].北京:中国标准出版社,2017.)。谷物及其制品中OTA污染的及时发现，有利于快速采取有效地措施加以应对，降低人类暴露于OTA的风险。

目前，OTA的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、荧光光谱法、电化学分析法、基于抗原抗体反应的免疫分析法。薄层色谱法是最早用于真菌毒素污染检测的色谱分析方法，操作简单、价格低廉，但检测精确度低，所用溶剂毒性大，且重现差。高效液相色谱法常与荧光检测器、紫外检测器等结合使用，具有检测速度快、高效、稳定的优势，但需要结合固相萃取技术对样品进行复杂的前处理。液相色谱-串联质谱法灵敏度高、可靠性好，但需要有效的样品提取和萃取方法。荧光光谱法和电化学分析法虽然易于操作，但需要用荧光或酶进行一定的修饰，且荧光强度容易受到氧气、湿度和外来物质的干扰，给检测带来不便。免疫分析法是目前最常用的检测方法，特异性高，选择性好，但存在交叉反应，容易出现假阳性。因此寻找成本低廉、操作简单、快捷、特异性强和选择性好的真菌毒素的检测方法，满足食品安全检测的需求，是近来真菌毒素分析检测领域研究的热点。

表面增强拉曼散射(SERS)因具有独特的非侵入性和高灵敏度，可以实现单分子水平上的检测而被应用到真菌毒素的痕量分析检测中。目前针对OTA的SERS检测的报道，主要是基于适配体的一些较新的检测方法，如Galarreta等(B Galarreta.Microfluidicchannel with embedded SERS 2D platform for the aptamer detection ofochratoxin A[J].Analytic al and Bioanalytical Chemistry,2013,405(5):1613-1621)报道了基于适配体的SERS传感器检测OTA，检测为50nM(约24μg/kg)，但不能满足食品质量安全控制的需求。Gillib ert等(R Gillibert.Surface enhanced Raman scatteringsensor for highly sensitive and sele ctive detection of ochratoxin A[J].Analyst,2018,143(1):339-345)将适配体与生物信号报告分子相连，开发了基于适配体的SERS传感器对OTA的检测达到了皮摩尔浓度的高精度，但基底功能化耗时长，需要用6-巯基己醇进行封端，满足不了快检的要求。Zhao等(Y Zh ao.Double Detection ofMycotoxins Based on SERS Labels Embedded Ag@Au Core-Shel l Nanoparticles[J].Acs Applied Materials & Interfaces,2015,7(39):21780-21786)制备了含有内嵌拉曼信号报告分子的金包银核壳纳米颗粒，并在颗粒表面修饰OTA和AFB1的适配体，以此为基底实现了玉米粉中OTA和AFB1的双重检测，OTA的检测限为0.006ng/mL，但基底的制备流程繁琐，耗时长。基于适配体的真菌毒素的SERS检测，虽然具有良好的特异性和选择性，但需要对适配体进行复杂合理的设计过程，需要耦连荧光或信号报告分子进行拉曼分析，且基底制备繁琐，耗时长。

发明内容

本发明的目的在于提供简单、快速、加标回收率高、结果可靠的一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法。

本发明包括以下步骤：

1)用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶；

在步骤1)中，所述用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶可通过控制反应物的浓度、反应温度、反应时间、搅拌速度，制得粒径均一的Au纳米粒子溶胶，所述Au纳米粒子溶胶为AuNPs溶胶；所述柠檬酸钠的质量百分浓度可为0.8％～1.5％，柠檬酸钠与氯金酸的体积比可为120～150；所述氯金酸的质量百分浓度可为0.01％～0.05％，所述反应温度可为90～100℃，反应时间可为30～50min，搅拌速度可为2000～3000r/min；所述Au纳米粒子可为球形Au纳米粒子或椭圆形Au纳米粒子，所述球形Au纳米粒子的粒径可为50±10nm；所述用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶的反应条件可为：在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸三钠，继续加热回流30～50min，反应后自然冷却至室温。

2)制备TGA修饰的金纳米粒子；

在步骤2)中，所述制备TGA修饰的金纳米粒子的具体方法可为：通过控制金纳米粒子溶液的体积、TGA的用量、反应时间、磁力搅拌速度，获得TGA修饰的金纳米粒子，对TGA修饰的金纳米粒子进行红外光谱、EDS(X-射线能谱分析)、SEM(扫描电子显微镜)表征，测量共振吸收谱探究TGA的用量对Au纳米粒子修饰的影响；所述金纳米粒子溶液的体积可为30～50mL；所述TGA的用量可为200～800μL；反应时间可为15～30min；磁力搅拌速度可为800～1500r/min；所述TGA修饰的金纳米粒子可为球形或椭圆形，所述球形TGA修饰的金纳米粒子的粒径可为60±5nm；所述TGA修饰金纳米粒子溶胶的制备条件可为：在常温下，取金纳米粒子溶胶于容器中，在磁力搅拌下加入TGA溶液，持续反应，得到TGA修饰金纳米粒子溶液；所述TGA修饰的金纳米粒子的红外光谱表征是指将TGA修饰的金纳米粒子溶液浓缩后，与溴化钾一起置于100～150℃温度的干燥箱中烘烤后，将TGA修饰的金纳米粒子样品与溴化钾加入玛瑙研钵中充分研磨，压片后，进行红外光谱测试；TGA修饰的金纳米粒子样品与溴化钾的质量比1︰(95～99)；所述EDS、SEM表征是指取0.8～1.5mL TGA修饰的金纳米粒子，7000～9000r/mim，5min离心，弃去上清液，加入200～500μL超纯水，7000～9000r/mim离心清洗，去掉上清液，将TGA修饰金纳米粒子溶液浓缩至10～20μL，取3～5μL浓缩TGA修饰金纳米粒子溶液滴加于镀金玻片上，自然干燥后，制备SERS基底，进行EDS、SEM表征；所述探究TGA的用量对金纳米粒子修饰的影响是指取合成的金纳米粒子溶液40～50mL于容器中，在1000～2000r/min的磁力搅拌下，加入不同体积同浓度的TGA溶液，持续反应15～30min，得到TGA修饰金纳米粒子溶液，采集TGA修饰金纳米粒子的表面等离子体共振吸收谱，进行表征。

3)OTA的定量检测。

在步骤3)中，所述OTA的定量检测的具体方法可为：在最佳激发波长下，将不同浓度的OTA溶液滴加在SERS基底上，基底置于加热板上，进行表面增强拉曼检测，随着OTA浓度的增加，OTA在特定波长处的拉曼峰逐渐增强，利用OTA拉曼特征峰的强度与OTA的量成正比，对OTA进行定量分析检测；所述最佳激发波长是指532～785nm激发波长；控制加热板的温度可为40～60℃；所述OTA在特定波长处的拉曼峰是指OTA在1265cm^-1处的特征拉曼峰；所述定量分析检测，是指以浓度的负对数值为横坐标，即以OTA浓度的负对数为横坐标，以OTA在最强特征峰1265cm^-1处的峰强为纵坐标，建立标准曲线，对OTA定量检测，检测范围2.48×10^-5～10^-10mol/L，线性范围10^-5～10^-9mol/L，线性相关系数0.9846，检测限10^-10mol/L。

本发明用巯基乙酸(TGA)修饰的金纳米粒子作为SERS基底，一方面降低了金纳米粒子的表面能，提高金纳米粒子的稳定性，防止纳米粒子团聚；另一方面借助于TGA分子中游离的羧基与OTA分子中的羰基氧形成氢键，将OTA拉进金纳米粒子的局域电磁场增强区，即SERS热点区，增强拉曼检测信号。利用OTA在1265cm^-1处的特征拉曼峰的信号强度与浓度具有线性关系，建立了简单、快速、低成本，无需复杂的特异性修饰，直接利用OTA的SERS特征峰对其进行定量的分析方法。本发明的检测范围2.48×10^-5～10^-10mol/L，线性范围10^-5～10^-9mol/L，线性相关系数0.9846，检测限10^-10mol/L。将本发明应用于玉米粉中OTA的加标检测，加标回收率79.48％～106.14％，相对标准偏差2.65％～12.72％。说明本发明应用到实际样品中加标回收率高、结果可靠。

附图说明

图1为本发明实施例AuNPs和TGA修饰的金纳米粒子的红外光谱图和EDS图。在图1中，A为红外光谱图，B为Au@TGA的EDS图，C为AuNPs的EDS图。

图2为本发明实施例不同体积TGA(0、200、400、800μL)修饰的金纳米粒子溶胶的SPR吸收光谱、溶胶颜色变化图和SEM图。在图2中，A为SPR吸收光谱，B为溶胶颜色变化图，C为SEM图。

图3为OTA溶液常规拉曼谱。

图4为10^-5mol/L OTA在不同激发波长下的拉曼谱。

图5为10^-6mol/L的OTA在不同基底上的SERS谱图。

图6为10^-5mol/L的OTA在SERS基底上的SEM图。在图6中，a的标尺为1μm，b的标尺为1μm。

图7为本发明随机采10个不同位置点得到的SERS谱图。

图8为10^-5mol/L OTA在SERS基底上随机采集10个不同位点的SERS峰强的柱状图。

图9为不同浓度OTA的SERS谱图。

图10为OTA在最强拉曼峰1265cm^-1处的SERS强度与浓度负对数的关系图。

图11为不同物质在SERS基底上的拉曼谱。

图12玉米粉中不同浓度OTA加标提取液的SERS谱。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)溶液。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶液。

2)TGA修饰金纳米粒子的制备与表征：

取上述金纳米溶胶40mL于干净的圆底烧瓶中，在1000r/min的磁力搅拌下逐滴加入TGA溶液，持续反应20min，得到TGA修饰的金纳米粒子，对合成的TGA修饰的金纳米粒子进行红外光谱、EDS、SEM表征。

取步骤2)中TGA修饰的金纳米粒子，浓缩后与溴化钾一起置于120℃的干燥箱中烘烤数小时后，将TGA修饰的金纳米粒子样品与溴化钾(1︰(95～99))加入玛瑙研钵中充分研磨，压片后，进行红外光谱测试。

取步骤2)中制备的TGA修饰的金纳米粒子溶液1mL于低聚离心管中，7000r/mim,5min离心，弃去上清液。加入200μL超纯水，7000r/mim，5min离心清洗一次，去掉上清液。将TGA修饰的金纳米粒子溶液浓缩至15μL，取5μL浓缩液滴加在镀金玻片，自然干燥后，EDS、SEM表征。

图1实施例2中制备的TGA修饰的金纳米粒子的红外光谱和EDS图。对比单纯的Au纳米粒子，TGA修饰的金纳米粒子在635cm^-1处出现微弱的振动峰，该峰归因于C-S键的对称振动，且TGA修饰的金纳米粒子在1625cm^-1、1396cm^-1出现了新的振动峰，对应于修饰在Au纳米粒子外围巯基乙酸的-COO^-的伸缩振动，而Au纳米粒子在635、1625、1396cm^-1处没有振动峰的出现(图1A)，这说明巯基乙酸与Au纳米粒子通过-SH实现共价结合，成功的修饰于Au纳米粒子表面，其反应如下：Aun+HSCH₂COOH→Aun^-1Au+S^-CH₂COOH+H₂。AuNPs和TGA修饰的金纳米粒子清洗后的EDS结果显示(如图1B和C)，单纯的Au纳米粒子主要含有C、O、Au三种元素，几乎不含S元素。微量S元素的存在，可能来源于基底杂质的干扰。而经TGA修饰的Au纳米粒子除了C、O、Au三种元素外，S元素的含量较高，这说明TGA通过Au-S化学键成功的包覆到了AuNPs上。

图2为实施例2不同体积TGA(0、200、400、800μL)修饰的金纳米粒子的SPR吸收光谱、溶胶颜色变化图、SEM图。用不同体积的TGA修饰等体积的金纳米粒子，取其溶液40mL，测其表面等离子体共振吸收(SPR)谱。结果表明，当TGA的用量为200μL时，Au纳米粒子溶胶的SPR吸收峰的位置及溶液颜色不发生变化，说明金纳米粒此时没有发生聚集。同时SEM的结果显示，加入200μL TGA修饰的金纳米粒子在镀金玻片上，会形成大面积、均一性、分散性、致密性较好的单层结构，未经修饰的金纳米粒子在镀金玻片上，分散性和均一的差，且发生一定程度的团聚。当TGA的用量为400μL时，金纳米粒子溶胶的SPR吸收峰发生红移，峰变宽，这说明TGA已经过量，金纳米粒子发生团聚。随着TGA加入量的增加，Au纳米粒子溶液的SPR吸收峰强度明显下降，且在长波长处出现新的吸收峰，肉眼可见溶胶颜色由酒红色至蓝紫色，说明金纳米粒子发生严重团聚，导致SPR吸收峰严重降低。因此修饰Au纳米粒子溶液的TGA的最佳用量为200μL。

实施例2

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶液。

2)TGA修饰的金纳米粒子的合成及SERS基底制备：

取上述金纳米溶液40mL于干净的圆底烧瓶中，在1000r/min的磁力搅拌下逐滴加入200μL TGA溶液，持续反应20min，得到TGA修饰的金纳米粒子溶液。取合成的TGA修饰的金纳米粒子溶液1.0mL，7000r/min，5min离心，弃去上清后，加入200μL超纯水清洗一次，浓缩至10μL；再取5μL浓缩TGA修饰的金纳米粒子溶液滴加镀金玻片上，自然干燥，制备SERS基底。

3)最佳激发波长的选择

取浓度为2.48×10^-5mol/L的赭曲霉毒素A标准储备液，滴加于硅片上，采集OTA的常规拉曼谱。

在制备好的SERS基底上，逐滴滴加20μL 10^-5mol/L的OTA溶液，待溶液干燥后，分别用532、638、785nm的激发波长采集拉曼谱，确定检测OTA的最适激发波长。

图3为实施例2中OTA溶液的常规拉曼谱图，图4为实施例2不同激发波长下的拉曼谱。由图3OTA溶液的常规拉曼谱图可知，OTA主要拉曼特征峰在1007cm^-1、1085cm^-1、1265cm^-1波数处，其中1007cm^-1处的峰归属于OTA分子中单取代芳香环的形变，1265cm^-1归属于仲胺，1085cm^-1归属于C-H和O-H伸缩振动，这些特征峰与文献报道的OTA特征拉曼峰的位置一致。在图4中，曲线a～f分别为OTA溶液常规谱、785nm激发波长、638nm激发波长、532nm激发波长、AuNPs空白基底、TGA修饰的金纳米粒子的空白基底。从图中可以看出，用785nm的激发波长在1007cm^-1、1086cm^-1、1265cm^-1处，得到的拉曼峰强度最强，峰形最好(图4中的b图)。638nm的激发波长虽然可以测得1007cm^-1、1085cm^-1、1265cm^-1处的特征拉曼峰，但得到的拉曼峰强度较785nm弱且存在较强的荧光干扰(图4中的c图)。532nm的激发波长检测不到拉曼信号(图4中的d图)，这说明785nm的激发波长是检测OTA的最佳波长，因此接下来的实验选择785nm的激发波长采集拉曼光谱。

实施例3

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子。

2)TGA修饰的金纳米粒子的合成及SERS基底制备:

取上述金纳米溶胶40mL于干净的圆底烧瓶中，在1000r/min的磁力搅拌下逐滴加入200μL TGA溶液，持续反应20min，获得TGA修饰的金纳米粒子溶液。取合成的TGA修饰的金纳米粒子溶胶1.0mL，7000r/min，5min离心，弃去上清后，加200μL超纯水清洗一次，浓缩至10μL；再取5μL浓缩TGA修饰的金纳米粒子溶液滴加镀金玻片上，自然干燥，制备SERS基底。

3)OTA在SERS基底上均一性及OTA的定量SERS检测：

在制备好的SERS基底上，逐滴滴加20μL 10^-5mol/L的OTA溶液，待溶液干燥后，利用SEM对基底表面进行表征。并以785nm的激发波长在基底上随机采点，得到不同点对应的OTA表面增强拉曼谱。对比不同点采集的OTA拉曼峰强度，结合SEM的测试结果，来确定基底的均一性。

在制备好的SERS基底上，滴加20μL不同浓度的OTA溶液(2.48×10^-5mol/L、10^{- 5}mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、10^-8mol/L、10^-9mol/L、10^-10mol/L)，待溶液干燥后，采集拉曼谱，对OTA定量检测。

在制备好的SERS基底上，分别滴加20μL 10^-3mol/L和10^-5mol/L的黄曲霉毒素B1(AFB1)、1.38×10^-4mol/L伏马菌素B1(FB1)、10^-5mol/L OTA，采集SERS谱。探究TGA修饰的金纳米粒子SERS基底对OTA的选择性。

图5～10为实施例3的实验结果。图5为10^-6mol/L的OTA在AuNPs基底和Au@TGA基底上的SERS谱图，其中曲线a～e分别为OTA溶液常规谱、在TGA修饰的金纳米粒子基底滴加10^{- 6}mol/L OTA的SERS谱、在AuNPs基底上滴加10^-6mol/L OTA的SERS谱、TGA修饰的金纳米粒子空白基底、AuNPs空白基底。由图5b和c可以看出，在1007cm^-1、1086cm^-1、1265cm^-1波长处，OTA在TGA修饰的金纳米粒子基底上得到的拉曼信号明显强于在Au纳米粒子基底上的信号，这说明与单纯的Au纳米粒子相比，在Au纳米粒子上修饰TGA可显著增强OTA拉曼信号。

图6为10^-5mol/L的OTA在SERS基底上的SEM图。

图7为随机采10个不同位置点得到的SERS谱图。在图6中，a和b分别为TGA修饰的金纳米粒子基底的SEM图、滴加10^-5mol/L OTA的TGA修饰的金纳米粒子基底的SEM图、10个不同位置点的SERS谱图。图6a和b的SEM结果显示，10^-5mol/L OTA滴加在SERS基底后，基底依旧为均匀，排列紧密一致的单层结构。但需要注意的是需要控制OTA的滴加量，量太多，逐滴滴加时，会将SERS基底的纳米粒子向四周冲刷，破坏基底的均一性。在滴加了10^-5mol/L OTA的均匀SERS基底取十个不同的位置，测OTA的拉曼峰强度，绘制出不同位置点各特征拉曼峰的强度(图7)。由拉曼峰的强度计算出10个不同位置点拉曼峰强度的相对标准偏差(RSD)，其值在11.94％～15.23％，均小于20％(见图8)，这说明OTA在SERS基底上均一性较好。利用上述基底，测定2.48×10^-5-10^-10mol/L OTA，结果如图9，选定1285cm^-1最强拉曼峰，以浓度的负对数为横坐标，峰强度为纵坐标绘制标准曲线(见图10)，可以看出浓度的负对数与拉曼峰强度具有一定的线性关系，线性范围10^-5-10^-10mol/L，线性相关系数0.9846，检测限10^{- 10}mol/L。该检测限比国标规定的限量标准(约1.2×10^-8mol/L)，低约两个数量级。与液相色谱-串联质谱法检测OTA的检出限(约1.4×10^-9mol/L)相比，降低了约1个数量级。该方法的检测范围在2.48×10^-5～10^-10mol/L，完全可以满足国标的要求，而且操作简单，检测成本低，检测速度快。

图11为不同物质在SERS基底上的拉曼谱，曲线a～g分别为AFB1常规谱、FB1常规谱、OTA常规谱、10^-5mol/L OTA、10^-3mol/L AFB1、10^-5mol/L AFB1、1.38×10^-4mol/L FB1、SERS基底。从图可以看出10^-5mol/L OTA在1007、1086、1265cm^-1波数处有明显的拉曼特征峰(图11中的d)，而10^-5mol/L AFB1、1.38×10^-4mol/L FB1在1007、1086、1265cm^-1波数处没有拉曼峰的出现(图11中的f～g)。当将AFB1的浓度提高100倍时，仅检测到在1007和1265cm^-1处的微弱信号峰(图11中的e)，这说明SERS基底对OTA具有良好的选择性吸附。

实施例4

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子。

2)TGA修饰的金纳米粒子的合成及SERS基底制备：

取上述金纳米溶胶40mL于干净的圆底烧瓶中，在1000r/min的磁力搅拌下逐滴加入200μL TGA溶液，持续反应20min，获得TGA修饰的金纳米粒子。取合成的TGA修饰的金纳米粒子溶液1.0mL，7000r/min，5min离心，弃去上清后，加200μL超纯水清洗一次，浓缩至10μL；再取5μL浓缩TGA修饰的金纳米粒子溶液滴加镀金玻片上，自然干燥，制备SERS基底。

3)玉米粉中OTA的加标检测：

(1)样品提取：

参照国标的方法对玉米粉中的OTA进行提取。称取2.000g玉米粉，加入10mL不同浓度(10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、10^-8mol/L)的OTA甲醇溶液，加入10ml氯仿，震荡5min，滤纸过滤。取10ml滤液于100mL平底烧瓶中，60℃水浴中旋转蒸发至近干。加入10ml石油醚溶解残渣，加入5mL提取液(含20％0.1mol/L氢氧化钾溶液，60％甲醇水溶液)，震荡，分层后，滤纸过滤，取下层提取液进行净化。

(2)净化：

5ml甲醇，3mL提取液活化

PAX固相萃取柱后，加入5mL上述加标提取液，以1滴/s～2滴/s的速度通过固相萃取柱，10mL淋洗液(含30％0.1mol/L氢氧化钾溶液50％乙腈溶液)以同样的速度淋洗，吹干。最后用5mL洗脱液(甲醇︰乙腈︰甲酸︰蒸馏水＝4︰5︰0.5︰0.5)洗脱OTA，收集洗脱液于60℃水浴中蒸至近干，用1mL甲醇溶解残留物，滤膜过滤。取20μL加标过滤液，滴加于SERS基底上，采集拉曼谱。

图12为玉米粉中不同浓度OTA加标提取液的SERS谱，曲线a～g分别为OTA常规谱、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、10^-8mol/L、空白提取液、SERS基底。由于样品提取液中其它成分(如色素)的干扰，使测得的拉曼峰强度比等浓度标准溶液拉曼峰弱，检测灵敏度下降。以图10中标准曲线为工作曲线，测得不同浓度OTA在玉米粉中的加标回收结果如表1所示。

表1

由表1可知，玉米粉样品的加标回收率在79.48％～106.14％，相对标准偏差2.65％～12.72％。结果表明，玉米粉中OTA的加标回收率高，检测精密度好，结果可靠。

Claims (5)

1.一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子；所述柠檬酸钠的质量百分浓度为0.8%～1.5%，柠檬酸钠与氯金酸的体积比为120～150；所述氯金酸的质量百分浓度为0.01%～0.05%；

2）制备TGA修饰的金纳米粒子：通过控制金纳米粒子溶液的体积、TGA的用量、反应时间、磁力搅拌速度，获得TGA修饰的金纳米粒子，对TGA修饰的金纳米粒子进行红外光谱、EDS、SEM表征，测量共振吸收谱探究TGA的用量对Au纳米粒子修饰的影响；所述金纳米粒子溶液的体积为30～50 mL；所述TGA的用量为200～800µL；反应时间为15～30min；磁力搅拌速度为800～1500 r/min；所述TGA修饰的金纳米粒子为球形或椭圆形，所述球形TGA修饰的金纳米粒子的粒径为60±5 nm；

所述TGA修饰金纳米粒子的制备条件为：在常温下，取金纳米粒子溶胶于容器中，在磁力搅拌下加入TGA溶液，持续反应，得到TGA修饰的金纳米粒子；所述TGA修饰的金纳米粒子的红外光谱表征是指将TGA修饰的金纳米粒子溶液浓缩后，与溴化钾一起置于100～150 ℃温度的干燥箱中烘烤后，将TGA修饰金纳米粒子样品与溴化钾加入玛瑙研钵中充分研磨，压片后，进行红外光谱测试；TGA修饰金纳米粒子样品与溴化钾的质量比1︰（95～99）；所述EDS、SEM表征是指取0.8~1.5mL TGA修饰的金纳米粒子溶液，7000～9000 r/mim，5 min离心，弃去上清液，加入200～500µL超纯水，7000～9000 r/mim离心清洗，去掉上清液，将TGA修饰的金纳米粒子溶液浓缩至10～20 µL，取3～5 µL浓缩TGA修饰的金纳米粒子溶液滴加于镀金玻片上，自然干燥后，制备SERS基底，进行EDS、SEM表征；所述探究TGA的用量对金纳米粒子修饰的影响是指取合成的金纳米粒子溶液原液40～50mL于容器中，在1000～2000r/min的磁力搅拌下，加入不同体积同浓度的TGA溶液，持续反应15～30min，得到TGA修饰的金纳米粒子，采集TGA修饰的金纳米粒子溶液的表面等离子体共振吸收谱，进行表征；

3）OTA的定量检测：在最佳激发波长下，将不同浓度的OTA溶液滴加在SERS基底上，基底置于加热板上，进行表面增强拉曼检测，随着OTA浓度的增加，OTA在特定波长处的拉曼峰逐渐增强，利用OTA拉曼特征峰的强度与OTA的量成正比，对OTA进行定量分析检测。

2.如权利要求1所述一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶，是通过控制反应物的浓度、反应温度、反应时间、搅拌速度，制得粒径均一的Au纳米粒子溶胶，所述Au纳米粒子溶胶为AuNPs溶胶。

3.如权利要求2所述一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述反应温度为90～100 ℃，反应时间为30～50 min，搅拌速度为2000～3000 r/min；所述Au纳米粒子为球形Au纳米粒子或椭圆形Au纳米粒子，所述球形Au纳米粒子的粒径为50±10nm。

4.如权利要求1所述一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶的反应条件为：在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸三钠，继续加热回流30～50min，反应后自然冷却至室温。

5.如权利要求1所述一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，其特征在于在步骤3）中，所述最佳激发波长是指532～785 nm激发波长；控制加热板的温度为40～60 ℃；所述OTA在特定波长处的拉曼峰是指OTA在1265cm^-1处的特征拉曼峰；所述定量分析检测，是指以浓度的负对数值为横坐标，即以OTA浓度的负对数为横坐标，以OTA在最强特征峰1265cm^-1处的峰强为纵坐标，建立标准曲线，对OTA定量检测，检测范围2.48×10^-5～10^-10 mol/L，线性范围10^-5～10^-9 mol/L，线性相关系数0.9846，检测限10^-10 mol/L。

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