CN107290519A

CN107290519A - 基于纳米组装结构的sers适体传感器的构建方法及应用

Info

Publication number: CN107290519A
Application number: CN201710433533.2A
Authority: CN
Inventors: 徐霞; 徐程楠; 应义斌
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN107290519B

Abstract

本发明公开了一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法及应用。将与赭曲霉毒素A适体片段部分互补的两种DNA分别修饰到金纳米棒和金纳米粒子的表面形成两种纳米探针，然后将两种纳米探针在与DNA适体的互补配对连接下组装形成纳米组装结构，纳米组装结构标记有拉曼信标分子，再加入待检测物的溶液，利用待检测物影响纳米组装结构的SERS信号强度来检测其中的浓度。本发明的方法在液体环境中反应均匀，检测的灵敏度、特异性高、只需一步反应、操作简单。

Description

基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法及应用，尤其针对赭曲霉毒素A检测方面的应用。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)可经由污染的农产品和食品对人类健康产生严重危害，可导致癌症甚至丧命。世界范围内，欧盟的真菌毒素限量要求最为严格，其农产品及食品中OTA的限量标准范围一般在0.3-50μg/kg之间(包含婴幼儿食品)。考虑到样品提取过程中一般进行稀释处理，这就要求所发展的新型检测方法必须具有极高的灵敏度。同时食品基质成分复杂，易对测定物质产生干扰，所以方法的选择性或特异性显得尤为重要。此外检测方法须简便实用，便于市场推广和应用。

表面增强拉曼散射光谱(SERS)技术因检测快速、灵敏，且作为指纹图谱能提供分子的振动信息，近年来已成为分析检测领域的研究热门，发展迅速。目前一般认为SERS起源于金属表面局域电磁场的增强，也就是局域表面等离子体共振，当激光照射到具有一定粗糙度的金属表面时，金属颗粒表面会产生一个放大的局域电磁场，当分子恰好落在这个局域电磁场时，其散射界面将极大地放大，从而得到分子的表面增强拉曼光谱。以金属纳米粒子组装体为SERS基底时，由于其相邻粒子的间隙具有巨大的电磁场增强，拉曼强度可产生10⁶-10¹²倍的信号增强，具有明显优势。基于拉曼信标分子标记的纳米粒子组装体，通过SERS活性热点数量变化的检测方法已成为当前研究的热门。

然而食品基质成分复杂，易对测定物质产生干扰，单纯依赖SERS技术无法保障检测所需的特异性和选择性，一般需要二次利用化学计量学方法或建立模型进行判别和鉴定，特别是针对OTA分子，SERS技术与核酸适配体的结合刚好可弥补这一不足。

目前报道已经筛选出来的抗OTA适体具有很好的选择性，识别OTA的亲和力是赭曲霉毒素B的100倍，可直接检测ng/mL浓度水平的OTA。以OTA适体与DNA杂交诱导的纳米组装结构为基底的SERS传感器将SERS技术的快速、灵敏优势与核酸适体高亲和力、选择性的特点紧密结合，兼具传感器操作简单、便携式的特色，是一种具有广阔前景的OTA检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法及应用，灵敏度、特异性高，操作简单，用于赭曲霉毒素A的检测。

本发明具体的技术解决方案：

本发明是将与赭曲霉毒素A适体片段部分互补的两种DNA分别通过末端巯基修饰到金纳米棒和金纳米粒子的表面形成两种纳米探针，然后将两种纳米探针在与DNA适体的互补配对连接下组装形成纳米组装结构，纳米组装结构标记有拉曼信标分子，纳米组装结构的SERS信号强度与其组装数量、组装大小正相关；再加入待检测物的溶液，利用待检测物影响纳米组装结构的SERS信号强度来检测其中的浓度。

所述的待检测物为赭曲霉毒素A。

在不同浓度赭曲霉毒素A溶液添加后，赭曲霉毒素A分子与DNA适体特异性结合，使得DNA适体的空间结构发生变化，抑制纳米组装结构的生成，使得溶液的SERS信号强度减弱，实现对赭曲霉毒素A的检测。

不同浓度赭曲霉毒素A溶液会不同程度地抑制组装结构的生成，使得其SERS信号强度规律性减弱，利用所构建的适体传感器完成对赭曲霉毒素A浓度的检测。

方法具体包括以下步骤：

1)金纳米棒DNA探针的制备

1.1)羧基修饰的第一种DNA与TCEP溶液混合并在常温下静置；

1.2)利用1M浓度的HCl溶液调整TBE缓冲液的pH，然后将金纳米棒和步骤1.1)处理得到的活化后DNA溶液添加到pH调整后的TBE缓冲液中混匀并震动，再经离心并重悬于Tris缓冲液中，从而得到通过羧基修饰DNA到金纳米棒上的金纳米棒DNA探针；

2)金纳米粒子DNA探针的制备

2.1)羧基修饰的第二种DNA与TCEP溶液加入在醋酸-HCl缓冲液中混合，放置在常温下；

2.2)将金纳米粒子加入到步骤2.1)获得的活化后DNA溶液中混合，用醋酸-HCl溶液调整溶液的pH；

2.3)静置后，添加NaCl溶液；

2.4)将溶液离心并重悬后与含有4-巯基苯甲酸的乙醇溶液混合，常温反应，离心并重悬于Tris缓冲液中。

3)赭曲霉毒素A标准溶液的SERS传感器检测

将金纳米棒DNA探针探针和金纳米粒子DNA探针混合，添加含OTA适体序列的Linker DNA溶液和赭曲霉毒素A溶液，振荡混合均匀后置于反应，再采用光谱仪检测。

所述步骤1.2)中的1×TBE缓冲液内含质量分数0.02％的SDS和500mM的NaCl。

所述步骤1.2)中的Tris缓冲液内含120mM的NaCl、20mM的MgCl₂和质量分数0.3％的SDS，pH 8.5。

所述步骤2.4)中含有4-巯基苯甲酸的乙醇溶液取5μL，4-巯基苯甲酸浓度为1mM。

优选地，本发明方法采用包含以下工艺条件的方法过程：

1)金纳米棒DNA探针的制备

1.1)羧基修饰的第一种DNA与TCEP溶液混合并在常温下静置1h，TCEP和DNA的摩尔比为TCEP:DNA＝10:1；

1.2)利用1M浓度的HCl溶液将1×TBE缓冲液的pH调整至3.0，然后将金纳米棒和步骤1.1)处理得到的活化后DNA溶液添加到pH调整后的TBE缓冲液中混匀并震动10min，DNA和金纳米棒的摩尔比是DNA:AuNRs＝1000:1，再经离心并重悬于10mM的Tris缓冲液中，从而得到通过羧基修饰DNA到金纳米棒上的金纳米棒DNA探针；

2)金纳米粒子DNA探针的制备

2.1)羧基修饰的第二种DNA与TCEP溶液加入在pH 5.0的醋酸-HCl缓冲液中混合，其中醋酸浓度为50mM，放置在常温下1h；

2.2)将金纳米粒子加入到步骤2.1)获得的3μM浓度的活化后DNA溶液中混合1min，用500mM的醋酸-HCl溶液将溶液的pH调整为3.0；

2.3)静置3min后，添加1M的NaCl溶液调整使得添加后溶液中的NaCl浓度为0.3M；

2.4)将溶液离心并重悬后取1mL与含有4-巯基苯甲酸的乙醇溶液混合，常温反应3h，离心并重悬于10mM的Tris缓冲液中。

3)赭曲霉毒素A标准溶液的SERS传感器检测

将金纳米棒DNA探针探针和金纳米粒子DNA探针各50μL按照1:8浓度比例等体积混合，添加1μL、10μM的含OTA适体序列的Linker DNA溶液和50μL的赭曲霉毒素A溶液，振荡混合均匀后置于40℃反应2h，再采用光谱仪检测。

所述用光谱仪检测是检测光谱1591cm^-1处SERS信号强度。

所述步骤1.1)中的羧基修饰的第一种DNA序列为5’-AGTCACAGTGAGACTTTTTTT-CH(6)-SH-3’，所述步骤2.1)中的羧基修饰的第二种DNA序列为5’-SH-CH(6)-TTTTTTTCACCCGATCGAG-3’；所述步骤3)中的含OTA适体序列的Linker DNA序列为5’-GTCTCACTGTGACTCTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’。

Linker DNA中与第一种DNA互补配对的碱基序列是：GTCTCACTGTGACT，Linker DNA中与第二种DNA互补配对的碱基序列是：CTCGATCGGGTG。

本发明方法构建得到的SERS适体传感器能够用于赭曲霉毒素A浓度的检测。

本方法的有益效果具体体现在以下几个方面：

1.本发明构建了基于赭曲霉毒素A适体连接的金纳米棒、金纳米粒子组装结构的SERS传感器，提高了光学传感器检测的灵敏度、特异性，最低可检测0.01ng/mL浓度的赭曲霉毒素A。

2.本发明方法操作简单，在探针准备好的情况下仅需一步可实现目标毒素的测定。

3.本发明方法为下一步研究结合便携式拉曼检测探头的小型传感器，用于现场真菌毒素检测提供了基础。

附图说明

图1是本发明实施例制备的赭曲霉毒素A传感器检测后建立的线性标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例如下：

1)金纳米棒DNA探针(AuNRs-DNA)的制备

1.1)羧基修饰的第一种DNA(序列为5’-AGTCACAGTGAGACTTTTTTT-CH(6)-SH-3’，其中的碱基序列如SEQ ID No.1)与新鲜配置的TCEP溶液混合并在常温下静置1h，TCEP和DNA的摩尔比为TCEP:DNA＝10:1；

1.2)利用1M浓度的HCl溶液将1×TBE缓冲液(内含质量分数0.02％的SDS和500mM的NaCl)的pH调整至3.0，然后将新鲜制备纯化的金纳米棒(平均长度为65.8nm，平均宽度为23.5nm，径向比为2.8)和步骤1.1)处理得到的活化后DNA溶液添加到pH调整后的TBE缓冲液中混匀并震动10min，DNA和金纳米棒的摩尔比是DNA:AuNRs＝1000:1，再经离心并重悬于10mM的Tris缓冲液中(pH 8.5，内含120mM的NaCl、20mM的MgCl₂和质量分数0.3％的SDS)，从而得到通过羧基修饰DNA到金纳米棒上的金纳米棒DNA探针。

2)金纳米粒子DNA探针(AuNPs-DNA)的制备

2.1)羧基修饰的第二种DNA(序列为5’-SH-CH(6)-TTTTTTTCACCCGATCGAG-3’，其中的碱基序列如SEQ ID No.2)与新鲜配置的TCEP溶液加入在pH 5.0的醋酸-HCl缓冲液(溶液取9μL，其中醋酸浓度为50mM)中混合，放置在常温下1h；

2.2)将金纳米粒子(平均直径为13nm)加入到步骤2.1)获得的3μM浓度的活化后DNA溶液中混合1min，用500mM的醋酸-HCl溶液将溶液的pH调整为3.0；

2.4)将溶液离心并重悬后取1mL与含有4-巯基苯甲酸(本实施例以4-巯基苯甲酸作为拉曼信标分子)的乙醇溶液(溶液取5μL，4-巯基苯甲酸浓度为1mM)混合，常温反应3h，离心并重悬于10mM的Tris缓冲液中。

3)赭曲霉毒素A标准溶液的SERS传感器检测

将AuNRs-DNA探针和AuNPs-DNA探针各50μL按照1:8浓度比例等体积混合，添加1μL、10μM的含OTA适体序列的Linker DNA溶液(序列为5’-GTCTCACTGTGACTCTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’，其中的碱基序列为SEQID No.3)和50μL的OTA标准溶液，振荡混合均匀后置于40℃反应2h。

OTA标准溶液的浓度由7种，分别为0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0和5.0ng/mL。采用7种不同浓度的OTA标准溶液进行实验反应，然后滴加10μL反应后溶液于玻璃片上进行SERS检测，利用光谱1591cm^-1处SERS信号强度与OTA浓度对数(Log C)绘制关系图，并拟合建立线性标准曲线，如图1所示。

线性标准曲线公式是Y＝-281.1LogC+188.5

通过空白样本三倍信噪比方法计算检测限(LOD)，计算公示如下所示，

其中，Y₀为空白样本反应液SERS光谱1591cm^-1处信号强度，σ为空白样本信号标准偏差，通过计算得到方法检测限为0.02ng/mL。

本实施例中采用LabRam-HR800显微激光共聚焦拉曼光谱仪(HORIBA Jobin Yvon，法国)和LabSpec 6.0软件进行表面增强拉曼光谱信号的采集和处理。光谱采集使用633nm的氦氖激光作为激光源，其激光强度设置为最大强度(14mW)，10×目镜，积分时间为1s，积分10次，狭缝宽度为100μm，配置光栅为600g/mm，分辨率为1cm^-1。

4)含赭曲霉毒素A的实际样品溶液检测

将AuNRs-DNA探针和AuNPs-DNA探针各50μL按照1:8浓度比例等体积混合，添加1μL、10μM的含OTA适体序列的Linker DNA溶液，然后添加50μL预处理后的含OTA的待测红酒样品溶液(实际含OTA浓度为2ng/mL)，振荡混合均匀后置于40℃反应2h，滴加10μL反应后溶液于玻璃片上进行SERS检测，根据检测得到的光谱1591cm^-1处SERS信号强度对照线性标准曲线，代入曲线公式后计算，求出红酒样品中赭曲霉毒素A的浓度为2.176ng/mL，回收率为108.8％。由此可见，本发明检测精度高。

本发明涉及的核苷酸和氨基酸序列如下：

SEQ ID No.1：

名称：修饰到金纳米棒上的第一种DNA的碱基序列

来源：人工合成

序列：AGTCACAGTGAGACTTTTTTT

SEQ ID No.2：

名称：修饰到金纳米粒子上的第二种DNA的碱基序列

来源：人工合成

序列：TTTTTTTCACCCGATCGAG

SEQ ID No.3：

名称：含OTA适体序列的Linker DNA的碱基序列

来源：人工合成

序列：GTCTCACTGTGACTCTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法及应用

<130> 123456

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agtcacagtg agactttttt t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttttttcac ccgatcgag 19

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtctcactgt gactctcgat cgggtgtggg tggcgtaaag ggagcatcgg aca 53

Claims

1.一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：方法是将与赭曲霉毒素A适体片段部分互补的两种DNA分别修饰到金纳米棒和金纳米粒子的表面形成两种纳米探针，然后将两种纳米探针在与DNA适体的互补配对连接下组装形成纳米组装结构，纳米组装结构标记有拉曼信标分子，再加入待检测物的溶液，利用待检测物影响纳米组装结构的SERS信号强度来检测其中的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：所述的待检测物为赭曲霉毒素A。

3.根据权利要求2所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：在不同浓度赭曲霉毒素A溶液添加后，赭曲霉毒素A分子与DNA适体特异性结合，使得DNA适体的空间结构发生变化，抑制纳米组装结构的生成，使得溶液的SERS信号强度减弱，实现对赭曲霉毒素A的检测。

4.根据权利要求2所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：不同浓度赭曲霉毒素A溶液会不同程度地抑制组装结构的生成，使得其SERS信号强度规律性减弱，利用所构建的适体传感器完成对赭曲霉毒素A浓度的检测。

5.根据权利要求2所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)金纳米棒DNA探针的制备

1.1)羧基修饰的第一种DNA与TCEP溶液混合并在常温下静置；

2)金纳米粒子DNA探针的制备

2.3)静置后，添加NaCl溶液；

3)赭曲霉毒素A标准溶液的SERS传感器检测

将金纳米棒DNA探针探针和金纳米粒子DNA探针混合，添加含OTA适体序列的LinkerDNA溶液和赭曲霉毒素A溶液，振荡混合均匀后置于反应，再采用光谱仪检测。

6.根据权利要求2或5所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：

1)金纳米棒DNA探针的制备

2)金纳米粒子DNA探针的制备

3)赭曲霉毒素A标准溶液的SERS传感器检测

7.根据权利要求5或6所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：所述用光谱仪检测是检测光谱1591cm^-1处SERS信号强度。

8.根据权利要求5或6所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法，其特征在于：

9.一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器，其特征在于：采用权利要求1-5任一所述方法构建得到。

10.根据权利要求9所述的一种基于纳米组装结构的SERS适体传感器的应用，其特征在于：在于赭曲霉毒素A中的检测应用。