CN104964960A

CN104964960A - 一种基于四面体嵌银结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法

Info

Publication number: CN104964960A
Application number: CN201510307822.9A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 赵森; 匡华; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 宋珊珊; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-06-08
Filing date: 2015-06-08
Publication date: 2015-10-07
Anticipated expiration: 2035-06-08
Also published as: CN104964960B

Abstract

一种基于嵌银四面体结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，属于分析化学领域。本发明通过10 nm粒径的金纳米颗粒的合成、6 nm 粒径的银纳米颗粒的合成、金纳米粒子的包裹、金纳米粒子上单链DNA的修饰、银纳米粒子上血管内皮生长因子适配体Apt-VEGF和信标分子4-NTP的修饰、嵌银四面体结构的组装和表面增强拉曼散射信号强度检测，建立拉曼信号强度与血管内皮生长因子浓度的标准曲线。本发明提供了一种基于嵌银四面体结构检测血管内皮生长因子的方法，与传统的检测方法相比成本低，灵敏度高，方便快捷，具有很好的实际应用前景。

Description

一种基于四面体嵌银结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法

技术领域

本发明涉及了一种基于四面体嵌银结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，属于分析化学领域。

背景技术

血管内皮生长因子（VEGF）是作用于血管内皮细胞的一类糖蛋白，以同源二聚体的形式存在，具有强烈的促内皮细胞增殖作用，促进新血管的形成。而肿瘤组织的生长，必须依靠新生血管生成来提供足够的氧气和营养物质来维持，因此，VEGF已被认为是肿瘤标志物。对肿瘤标志物的检测有助于早期发现癌症，实现早期治疗的目的。

传统的VEGF检测方法主要为酶联免疫法等，对单克隆抗体的要求较高，而且单克隆抗体的筛选是一项繁重且高耗的任务。本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，其基于纳米材料自组装技术构建了具有表面增强拉曼散射效应的纳米结构，并以此作为检测基底，通过单链DNA之间的互补杂交，将包裹有信标分子的银纳米粒子嵌入金纳米粒子四面体结构上，利用粒子之间的电场增强效应，获得强的拉曼散射信号。银纳米粒子上适配体因与目标物VEGF亲和力强从而从四面体骨架上解离下来，造成拉曼信号下降，据此得拉曼信号强度与目标物VEGF浓度的标准曲线，实现VEGF浓度的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于四面体嵌银结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法。

本发明的技术方案，一种基于嵌银四面体结构的超灵敏检测血管内皮生长因子（VEGF）的方法，是基于四面体嵌银结构拉曼信号强度改变对目标VEGF浓度进行检测的方法，包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子修饰单链DNA、嵌银四面体的组装以及 VEGF传感器的构建，具体如下：

一、嵌银四面体结构的构建：

（1）10 nm 粒径的金纳米粒子的合成：

10nm粒径的金纳米粒子采用鞣酸还原法合成，反应用的锥形瓶提前用新配置的王水浸泡24h，用超纯水冲洗至洁净，烘干待用。锥形瓶中加入79mL超纯水和 1mL质量浓度1%氯金酸作为A液；另取一洁净的小瓶子，加入4mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.1mL质量浓度1%单宁酸，0.1mL 25mM碳酸钾，15.8 mL超纯水作为B液；A、B液均加热到 60℃，然后在高速搅拌下把 B 液迅速加入A液中，混合液在 60℃下继续搅拌30min到形成深红色溶液。然后将溶液加热回流 2 min形成亮红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10nm。

（2）6 nm粒径的银纳米粒子的合成：

在聚乙烯吡咯烷酮的保护下采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为6 nm的银纳米粒子；锥形瓶的处理同上。锥形瓶中加入超纯水20mL、1% PVP 5mL、0.1M硼氢化钠（新配）0.6mL，冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL 1% 的聚乙烯吡咯烷酮PVP，5mL 1M的硝酸银溶液。反应后的溶液80℃水浴3h，以排除多余的硼氢化钠，冷却后放4℃冰箱待用。

（3）金纳米粒子修饰DNA：

所得金纳米粒子溶液中加入二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，使其终浓度为0.01mg/mL，室温震荡反应包裹12h后，13000rpm 离心浓缩十倍，以10 mM pH 7.4的Tris-HCl 缓冲液重悬，溶液四等分，编号依次为Au1，Au2， Au 3，Au 4。

分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1,2,3,4（DNA1，DNA2，DNA3， DNA4），使其终浓度均为5nM。室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液，至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为300 mM为止。溶液室温老化24h后离心除去未结合的单链DNA，10 mM Tris-HCl重悬待用。

DNA1:

5’-SH-TTTGCCTGGA GATACATGCA CATTACGGCT TTCCCTATTA GAAGGTCTCA GGTGCGCGTT TCGGTAAGTA GACG-3’；

DNA2:

5’-SH-TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTCAGTCCAC

CCCCACAAAC TAGAATGCCC TTTGGGCTGT TCCGGG-3’；

DNA 3:

5’-SH-TTTGGCCGAG GACTCCTGCT CCGCTGCGGT TTCAGTCCAC

CCCCACACGT CTACTTACCG TTTCAGTCCA CCCCCACACC CGGAACAGCC C-3’；

DNA 4:

5’-SH-TTTGCCGTAA TGTGCATGTA TCTCCAGGCT TTCCGCAGCG

GAGCAGGAGT CCTCGGCCTT TGGGCATTCT AGTT-3’；

四段单链DNA中含有与血管内皮生长因子（VEGF）的适配体部分互补的DNA序列，以用来与目标物VEGF产生竞争，为本发明标定VEGF浓度之用。

（4）银纳米粒子的修饰适配体Apt-VEGF和信标分子4-NTP

将所得银纳米粒子离心浓缩10倍后重悬于10mM Tris-HCl中，加入5’端修饰有巯基的VEGF适配体序列Apt-VEGF，使其终浓度为5nM，室温孵育过夜，离心除去未结合的适配体序列，以10mM Tris-HCl缓冲液重悬，加入信标分子4-NTP溶液，使信标分子4-NTP溶液终浓度为4μM。离心去除多余的信标分子，以10 mM Tris-HCl缓冲液重悬待用。

Apt-VEGF：5’-SH-TTTTTTTGTG GGGGTGGACT GGGTGGGTAC C-3’；

（5）嵌银四面体结构的构建

将步骤（3）所得四组Au_X-DNA_X溶液，以Au₁-DNA₁与Au₂-DNA₂，以Au₃-DNA₃与Au₄-DNA₄两两等体积混合，使其过夜杂交形成二聚组装体，将所得二聚体等体积组装混合，24h后得金纳米粒子四面体结构。以金纳米粒子四面体结构为单位，按四面体︰银纳米粒子为1︰3的摩尔比例加入修饰有VEGF适配体Apt-VEGF的银纳米粒子，室温24h杂交后得嵌银四面体结构。

二、表面增强拉曼信号检测，建立嵌银四面体结构的拉曼信号与目标物VEGF浓度的标准曲线：

向上述步骤（5）所制得的嵌银四面体结构中分别加入VEGF标准品，使得VEGF终浓度分别为0 fM，0.01 fM，0.05 fM，0.1 fM，0.5 fM，1 fM。室温孵育8h后，以1333cm^-1处建立拉曼信号强度变化与VEGF浓度的标准曲线。

本发明的有益效果：本发明提供了一种基于嵌银四面体结构超灵敏检测血管内皮生长因子VEGF的方法，与传统的检测手段相比，具有灵敏度高，检测限低，方便，快捷优点，有着非常好的实际应用前景。

附图说明

图1本发明通过核酸杂交形成的嵌银四面体组装体的透射电镜照片。

图2本发明中不同VEGF浓度下导致的SERS信号变化图。

图3本发明中SERS信号检测VEGF的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1

(一)检测传感器的构建

（1）10nm 粒径的金纳米粒子的合成

10nm粒径的金纳米粒子采用鞣酸还原法合成，反应用的锥形瓶提前用新配置的王水浸泡24小时，用超纯水冲洗至洁净，烘干待用。锥形瓶中加入79mL超纯水和 1mL 质量浓度 1% 氯金酸作为A液；另取一洁净的小瓶子，加入4 mL质量浓度 1% 柠檬酸三钠， 0.1mL 质量浓度1%单宁酸，0.1mL 25mM碳酸钾，15.8mL 超纯水作为B液。A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把 B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌30分钟到形成深红色溶液。然后将溶液加热回流 2 分钟形成亮红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10nm。所得溶液中加入二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，使其终浓度为0.01mg/mL，室温震荡反应12小时，13000rpm，离心去除上清，十倍浓缩于10mM pH 7.4的Tris-HCl 缓冲液中待用。

（2）6nm粒径的银纳米粒子的合成

锥形瓶的处理同上。锥形瓶中加入超纯水20mL、1% PVP 5mL、0.1 M硼氢化钠（新配）0.6mL，冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL 1% 的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，5mL 1M的硝酸银溶液。反应后的溶液80℃水浴3h，以排除多余的硼氢化钠，冷却后放4℃冰箱待用。

（3）金纳米粒子的修饰

金纳米粒子用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹12h后，13000rpm 离心浓缩十倍，以10mM pH 7.4的Tris-HCl 缓冲液重悬，溶液四等分，编号依次为Au1,Au2, Au 3, Au 4。分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1,2,3,4（DNA1，DNA2，DNA3，DNA4），使其终浓度均为5nM。室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液，至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为300mM为止。溶液室温老化24h后离心除去未结合的单链DNA，10 mM Tris-HCl重悬待用。

DNA1:

DNA2:

5’-SH-TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTCAGTCCAC CCCCACAAAC TAGAATGCCC TTTGGGCTGT TCCGGG-3’；

DNA 3:

5’-SH-TTTGGCCGAG GACTCCTGCT CCGCTGCGGT TTCAGTCCAC CCCCACACGT CTACTTACCG TTTCAGTCCA CCCCCACACC CGGAACAGCC C-3’；

DNA 4:

5’-SH-TTTGCCGTAA TGTGCATGTA TCTCCAGGCT TTCCGCAGCG

GAGCAGGAGT CCTCGGCCTT TGGGCATTCT AGTT-3’；

四段单链DNA中含有与血管内皮生长因子（VEGF）的适配体部分互补的DNA序列，以用来与目标物VEGF产生竞争，为该发明标定VEGF浓度之用。

（4）银纳米粒子的修饰

银纳米粒子离心浓缩10倍后重悬于10 mM Tris-HCl中，加入5’端修饰有巯基的VEGF适配体序列Apt-VEGF，使其终浓度为5 nM，室温孵育过夜，离心除去未结合的适配体序列，以10 mM Tris-HCl缓冲液重悬，加入信标分子4-NTP溶液，使信标分子4-NTP溶液终浓度为4μM。离心去除多余的信标分子，以10 mM Tris-HCl缓冲液重悬待用。

Apt-VEGF：5’-SH-TTTTTTTGTG GGGGTGGACT GGGTGGGTAC C-3’；

（5）嵌银四面体结构的构建

将步骤（3）所得四组Au_X-DNA_X溶液，以Au₁-DNA₁与Au₂-DNA₂，以Au₃-DNA₃与Au₄-DNA₄两两等体积混合，使其过夜杂交形成二聚组装体，将所得二聚体等体积组装混合，24 h后得金纳米粒子四面体结构。以金纳米粒子四面体结构为单位，按四面体︰银纳米粒子=1︰3的摩尔比例加入修饰有VEGF适配体Apt-VEGF的银纳米粒子，室温24 h杂交后得嵌银四面体结构。

（二）表面增强拉曼信号检测，建立嵌银四面体结构的拉曼信号与目标物VEGF浓度的标准曲线

向上述步骤（5）所制得的四面体嵌银体系中分别加入VEGF标准品，使得VEGF终浓度分别为0 fM，0.01 fM，0.05 fM，0.1 fM，0.5 fM，1 fM。室温孵育8h后，以1333cm^-1处建立拉曼信号强度变化与VEGF浓度的标准曲线。

Claims

1.一种基于嵌银四面体结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于步骤为：

（1）嵌银四面体结构的构建：

a、金纳米粒子修饰单链DNA：

10nm粒径的金纳米粒子采用鞣酸还原法合成；金纳米粒子溶液中加入二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，使其终浓度为0.01mg/mL，室温震荡反应包裹12h后，13000rpm 离心浓缩十倍，以10mM pH 7.4的Tris-HCl 缓冲液重悬，溶液四等分，编号依次为Au1，Au2，Au3，Au 4；

分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1,2,3,4，即DNA1，DNA2，DNA3，DNA4，使其终浓度均为5 nM；室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液,至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为300 mM为止；

溶液室温老化24 h后离心除去未结合的单链DNA，10mM Tris-HCl重悬待用；

DNA1，DNA2，DNA3，DNA4四段单链DNA中含有与血管内皮生长因子VEGF的适配体部分互补的DNA序列，以用来与目标物VEGF产生竞争，为该发明标定VEGF浓度之用；

DNA1:

DNA2:

5’-SH-TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTCAGTCCAC

CCCCACAAAC TAGAATGCCC TTTGGGCTGT TCCGGG-3’；

DNA 3:

5’-SH-TTTGGCCGAG GACTCCTGCT CCGCTGCGGT TTCAGTCCAC

CCCCACACGT CTACTTACCG TTTCAGTCCA CCCCCACACC CGGAACAGCC C-3’；

DNA 4:

5’-SH-TTTGCCGTAA TGTGCATGTA TCTCCAGGCT TTCCGCAGCG

GAGCAGGAGT CCTCGGCCTT TGGGCATTCT AGTT-3’；

b、银纳米粒子上血管内皮生长因子适配体Apt-VEGF和4-NTP的修饰：

在聚乙烯吡咯烷酮PVP的保护下采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为6 nm的银纳米粒子；将所得银纳米粒子离心浓缩10倍后重悬于10mM Tris-HCl中，加入5’端修饰有巯基的VEGF适配体序列Apt-VEGF，使其终浓度为5nM，室温孵育过夜，离心除去未结合的适配体序列，以10mM Tris-HCl缓冲液重悬，加入信标分子4-NTP溶液，使信标分子4-NTP溶液终浓度为4μM；离心去除多余的信标分子，以10mM Tris-HCl缓冲液重悬待用；

Apt-VEGF为：

5’-SH-TTTTTTTGTG GGGGTGGACT GGGTGGGTAC C-3’；

c、嵌银四面体结构的构建：

将步骤a所得四组Au_X-DNA_X溶液，以Au₁-DNA₁与Au₂-DNA₂，以Au₃-DNA₃与Au₄-DNA₄两两等体积混合，使其过夜杂交形成二聚组装体，将所得二聚体等体积组装混合，24h后得金纳米粒子四面体结构；以金纳米粒子四面体结构为单位，按四面体︰银纳米粒子为1︰3的摩尔比例加入修饰有VEGF适配体Apt-VEGF的银纳米粒子，室温24h 杂交后得嵌银四面体结构；

（2）表面增强拉曼信号检测，建立嵌银四面体结构的拉曼信号与VEGF浓度的标准曲线：向步骤c所制得的嵌银四面体结构中分别加入VEGF标准品，使得VEGF终浓度分别为0 fM，0.01fM，0.05fM，0.1fM，0.5fM，1fM；室温孵育8h后，以1333cm^-1处建立拉曼信号强度变化与VEGF浓度的标准曲线。