CN111198177B - 一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法及其应用 - Google Patents
一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法及其应用,属于癌症标志物的检测技术领域。本发明包括金纳米粒子的合成,金纳米粒子表面修饰拉曼信标分子和DNA,修饰后的金纳米粒子组装成金空间四面体结构。将组装好的金四面体结构与癌症标志物﹙端粒酶及上皮细胞黏附分子﹚混合,实现相应的金纳米粒子的脱落,通过观察相应信标分子与内参拉曼信号比值的变化来确定癌症标志物的浓度。本发明将DNA自组装技术与表面增强拉曼光谱相结合,以拉曼强度比值作为检测依据,解决了检测中假阳性和假阴性的问题,具有准确度高、特异性强、检测速度快等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法及其应用,属于癌症标志物的检测技术领域。
背景技术
癌症是目前导致人类死亡的重要原因之一,早期诊断及预防对于癌症的防治至关重要。癌症标志物是癌细胞产生的一类物质,当生物体受到严重破坏时,癌症标志物可能会显示异常信号。因此,癌症标志物含量的检测对于疾病的识别、早期诊断和预防具有重要意义。
利用DNA进行纳米粒子的组装具有独特的优势,首先,DNA之间良好的特异性识别作用,能够精确调控纳米颗粒之间的距离及位置,由此可获得较高产率的组装体;其次,由于其生物相容性较高,使得纳米组装体被广泛使用;最后,适配体作为能够特异性识别癌症标志物的一段DNA序列,将其用于组装体中能够进行癌症标志物的检测。
表面增强拉曼光谱(SERS)是在原有拉曼散射的基础上,利用距离相近的贵金属纳米材料(如金、银等)“热点”区域的电磁场增强效应,使得吸附在其表面的分子拉曼信号比非热点区域增强5-6个数量级,且这种效应会随着粒子间的距离发生变化,因此可用于癌症标志物的痕量检测。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处,提供一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法及其应用,利用该组装体拉曼信号强度的变化同时检测两种癌症标志物(端粒酶和上皮细胞黏附分子)的浓度。
本发明的技术方案,本发明包括金纳米粒子的合成,金纳米粒子表面修饰拉曼DNA和拉曼信标分子,金纳米粒子组装成金空间四面体结构,将组装好的金空间四面体结构与癌症标志物混合,实现相应的金纳米粒子的脱落,通过观察信标分子与内参拉曼信号比值的变化来确定癌症标志物的浓度。
(1)金纳米粒子的合成:采用柠檬酸三钠还原合成法,通过控制柠檬酸三钠的加入量得到不同粒径的金纳米粒子。在洁净锥形瓶中加入195mL超纯水和5mL 4g/L的氯金酸溶液,搅拌均匀并加热煮沸,7-8min后加入5mL(得到15nm金纳米粒子)或2.8mL(得到30nm金纳米粒子)1%的柠檬酸三钠溶液,待溶液变为亮红色后,停止加热并继续搅拌至溶液冷却至室温。为了提高金纳米粒子的稳定性,向溶液中加入200μL 2.5mg/mL的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐室温搅拌过夜。
(2)金纳米粒子表面修饰DNA:各取1 mL 30 nm的金纳米粒子于两个不同的PCR管中,4500 rpm离心10 min,后重悬于100 μL的超纯水中使用。金纳米粒子分别与DNA1及DNA3以摩尔比1:25的比例混合均匀,反应4h后向体系中加入2μL 5M的NaCl溶液,室温反应过夜后离心除去多余的DNA,形成Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物。
分别取1mL 15nm的金纳米粒子于三个不同的PCR管中,8500rpm离心10 min,后重悬于100μL的超纯水中使用,金纳米粒子分别与DNA5、DNA6及 DNA7以摩尔比为1:25的比例混合均匀,反应4h后向体系中加入2μL 5M的NaCl溶液,室温反应过夜后离心除去多余的DNA,形成Au15-DNA5、Au15-DNA6、Au15-DNA7复合物。
(3)金纳米粒子-DNA复合物修饰拉曼信标分子:4-氨基苯硫酚(4-ATP),4-硝基苯硫酚(NTP)和4-甲氧基苄硫醇(MATT)三种信标分子被用于该组装体中。其中Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物上分别修饰NTP及MATT,Au15-DNA7复合物上修饰4-ATP作为内参,另外两种15 nm的金纳米粒子上不做另外修饰。溶液中拉曼信标分子的终浓度均为5μM,信标分子加入到体系中反应过夜后离心,除去多余的信标分子,再向体系中加入超纯水恢复至原体积。
(4)金空间四面体结构的组装:将表面修饰有NTP、MATT的Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物等体积混合均匀,并以摩尔比1:25的比例加入DNA2和DNA4,均匀混合4h后加入2μL 5MNaCl溶液,室温反应过夜得到二聚体,离心去上清并用超纯水重悬恢复至原体积。将表面修饰有4-ATP的Au15-DNA7复合物与Au15-DNA5、Au15-DNA6复合物等体积混合均匀,室温反应过夜得到三聚体,离心去上清并用超纯水重悬恢复至原体积。最后将所得到的二聚体与三聚体全部混合均匀,反应过夜形成金空间四面体结构,并用透射电镜表征其结构。
检测用DNA的设计与合成,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成:
DNA1
5’-TTTTGTCCGG TTGGGGGGTA CTGTTGCACC CTGTCTGCGT TGGAGACATC AC-3’;
DNA2
5’-AGGCAGCTCG TCTCAAGAAT CCCAATCCCT TTTAATCGGT TCCACGGGTA ACACCGGATATCAATCCGTT TTTCCGATGG CAATCCGGGA TCAGTTAGCT TATCAG-3’;
DNA3:5’-TTTGGGATAT GGATA-3’;
DNA4
5’-TGAGACGAGC TGCCTAAGTG ATGTCTCCAA CCCCCAACCG GACTTTTAAG TTGTAGCTTATCAGCTGACT ACATTGTCAA GTAGCTTTTA AGTTGTAGCT TATCAGCTGA CTACATTGTC AAGT-3’;
DNA5
5’-TTTTTATCAG TTACAGCTCG CAGGATACGA TCCATGAAGC TTATGAGTTA CAGCTCGCTTTTGGCTACCG TTAGGCCCTA GTCAATCGAA TAGTCTTTTT TCAACATCGA ATAGTCGACT GATGTAACAGTTCATCG-3’;
DNA6
5’-TTTTACGGAT TGATATCCGG TGTTACCCGT GGAACCGATT TTTTACTTGA CAATGTAGTCAGCTGATAAG CTACAACTTT TTTATAGTCA ATGTCGAGCG TCCTATGCTA-3’;
DNA7:5’-TTTTCGAATA GTCAATGTCG AGCG-3’。
上述DNA均采用TE缓冲液配成溶液形态。
(5)癌症标志物的检测:比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的应用,用于癌症标志物端粒酶(TE)和上皮细胞黏附分子(EpCAM)的检测。将组装好的进空间四面体结构与癌症标志物混合,使相应适配体连接的30 nm的金纳米粒子的脱落,从而导致粒子上修饰的拉曼信标分子NTP或MATT拉曼强度的变化,通过计算NTP或MATT拉曼强度与内参4-ATP拉曼强度的比值变化来确定癌症标志物的浓度。
癌症标志物端粒酶和上皮细胞黏附分子的检测:
a、将一定浓度的端粒酶溶液与20nM金空间四面体结构混合,使端粒酶终浓度分别为0,0.1×10-12 IU,0.5×10-12 IU,1×10-12 IU,5×10-12 IU,10×10-12 IU,室温下反应2h,使端粒酶与对应适配体识别,导致修饰有NTP的30nm金纳米粒子脱落,测定拉曼信号变化,计算NTP与4-ATP拉曼信号的比值,做标准曲线。
b、将一定浓度的上皮细胞黏附分子溶液与20nM金空间四面体结构混合,使上皮细胞黏附分子终浓度分别为0,0.03 pg/mL,0.17 pg/mL,0.33 pg/mL,1.67 pg/mL,3.33 pg/mL,室温下反应2 h,使目标物与适配体相识别,导致修饰有MATT的30 nm金纳米粒子脱落,测定拉曼信号变化,计算MATT与4-ATP拉曼信号的比值,做标准曲线。
本发明的有益效果:本发明提供了一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构,利用DNA自组装和表面增强拉曼光谱实现了两种癌症标志物(端粒酶和上皮细胞黏附分子)的同时检测,以拉曼强度比值作为检测依据,解决了假阳性和假阴性的问题,具有准确度高、特异性强、检测速度快等优势。
附图说明
图1是本发明金空间四面体结构的透射电镜图。
图2是端粒酶(TE)和上皮细胞黏附分子(EpCAM)检测的拉曼图谱。
图3是端粒酶检测的标准曲线。
图4是上皮细胞黏附分子检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1 金空间四面体结构的组装
(1)金纳米粒子的合成:采用柠檬酸三钠还原合成法,通过控制柠檬酸三钠的加入量得到不同粒径的金纳米粒子。在洁净锥形瓶中加入195 mL超纯水和5 mL 4 g/L的氯金酸溶液,搅拌均匀并加热煮沸,7-8 min后加入5 mL(得到15 nm金纳米粒子)或2.8 mL(得到30nm金纳米粒子)1%的柠檬酸三钠溶液,待溶液变为亮红色后,停止加热并继续搅拌至溶液冷却至室温。为了提高金纳米粒子的稳定性,向溶液中加入200 μL 2.5 mg/mL的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐室温搅拌过夜。
(2)金纳米粒子表面修饰DNA:各取1 mL 30 nm的金纳米粒子于两个不同的PCR管中,4500 rpm离心10 min,后重悬于100 μL的超纯水中使用。金纳米粒子分别与DNA1及DNA3以摩尔比1:25的比例混合均匀,反应4 h后向体系中加入2 μL 5 M的NaCl溶液,室温反应过夜后离心除去多余的DNA,形成Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物。
分别取1mL 15nm的金纳米粒子于三个不同的PCR管中,8500rpm离心10 min,后重悬于100μL的超纯水中使用,金纳米粒子分别与DNA5、DNA6及 DNA7以摩尔比为1:25的比例混合均匀,反应4h后向体系中加入2μL 5M的NaCl溶液,室温反应过夜后离心除去多余的DNA,形成Au15-DNA5、Au15-DNA6、Au15-DNA7复合物。
(3)金纳米粒子-DNA复合物修饰拉曼信标分子:4-氨基苯硫酚(4-ATP),4-硝基苯硫酚(NTP)和4-甲氧基苄硫醇(MATT)三种信标分子被用于该组装体中。其中Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物上分别修饰NTP及MATT,Au15-DNA7复合物上修饰4-ATP作为内参,另外两种15 nm的金纳米粒子上不做另外修饰。溶液中拉曼信标分子的终浓度均为5 μM,信标分子加入到体系中反应过夜后离心,除去多余的信标分子,再向体系中加入超纯水恢复至原体积。
(4)金空间四面体结构的组装:将表面修饰有NTP、MATT的Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物等体积混合均匀,并以摩尔比1:25的比例加入DNA2和DNA4,均匀混合4 h后加入2 μL 5M NaCl溶液,室温反应过夜得到二聚体,离心去上清并用超纯水重悬恢复至原体积。将表面修饰有4-ATP的Au15-DNA7复合物与Au15-DNA5、Au15-DNA6复合物等体积混合均匀,室温反应过夜得到三聚体,离心去上清并用超纯水重悬恢复至原体积。最后将所得到的二聚体与三聚体全部混合均匀,反应过夜形成金空间四面体结构,并用透射电镜表征其结构,具体结构如图1所示。
(5)检测用DNA的设计与合成:
DNA1
5’-TTTTGTCCGG TTGGGGGGTA CTGTTGCACC CTGTCTGCGT TGGAGACATC AC-3’;
DNA2
5’-AGGCAGCTCG TCTCAAGAAT CCCAATCCCT TTTAATCGGT TCCACGGGTA ACACCGGATATCAATCCGTT TTTCCGATGG CAATCCGGGA TCAGTTAGCT TATCAG-3’;
DNA3:5’-TTTGGGATAT GGATA-3’;
DNA4
5’-TGAGACGAGC TGCCTAAGTG ATGTCTCCAA CCCCCAACCG GACTTTTAAG TTGTAGCTTATCAGCTGACT ACATTGTCAA GTAGCTTTTA AGTTGTAGCT TATCAGCTGA CTACATTGTC AAGT-3’;
DNA5
5’-TTTTTATCAG TTACAGCTCG CAGGATACGA TCCATGAAGC TTATGAGTTA CAGCTCGCTTTTGGCTACCG TTAGGCCCTA GTCAATCGAA TAGTCTTTTT TCAACATCGA ATAGTCGACT GATGTAACAGTTCATCG-3’;
DNA6
5’-TTTTACGGAT TGATATCCGG TGTTACCCGT GGAACCGATT TTTTACTTGA CAATGTAGTCAGCTGATAAG CTACAACTTT TTTATAGTCA ATGTCGAGCG TCCTATGCTA-3’;
DNA7:5’-TTTTCGAATA GTCAATGTCG AGCG-3’。
上述DNA均通过TE缓冲液复配成溶液形态。
实施例2 癌症标志物的检测
将组装好的金空间四面体结构与癌症标志物混合,使相应适配体连接的30 nm的金纳米粒子的脱落,从而导致粒子上修饰的拉曼信标分子NTP或MATT拉曼强度的变化,通过计算NTP或MATT拉曼强度与内参4-ATP拉曼强度的比值变化来确定癌症标志物的浓度。
具体检测方式如下:
a、将一定浓度的端粒酶溶液与20nM金空间四面体结构混合,使端粒酶终浓度分别为0,0.1×10-12 IU,0.5×10-12 IU,1×10-12 IU,5×10-12 IU,10×10-12 IU,室温下反应2h,使端粒酶与对应适配体识别,导致修饰有NTP的30 nm金空间纳米粒子脱落,测定拉曼信号变化,具体如图2所示,计算NTP与4-ATP拉曼信号强度的比值,做标准曲线,具体如图3所示。
b、将一定浓度的上皮细胞黏附分子溶液与20nM金四面体结构混合,使上皮细胞黏附分子终浓度分别为0,0.03 pg/mL,0.17 pg/mL,0.33 pg/mL,1.67 pg/mL,3.33 pg/mL,室温下反应2 h,使目标物与适配体相识别,导致修饰有MATT的30 nm金纳米粒子脱落,测定拉曼信号变化,具体如图2所示,计算MATT与4-ATP拉曼信号强度的比值,做标准曲线,具体如图4所示。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法及其应用
<141> 2019-12-18
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> DNA1(DNA1)
<400> 1
ttttgtccgg ttggggggta ctgttgcacc ctgtctgcgt tggagacatc ac 52
<210> 2
<211> 106
<212> DNA
<213> DNA2(DNA2)
<400> 2
aggcagctcg tctcaagaat cccaatccct tttaatcggt tccacgggta acaccggata 60
tcaatccgtt tttccgatgg caatccggga tcagttagct tatcag 106
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> DNA3(DNA3)
<400> 3
tttgggatat ggata 15
<210> 4
<211> 124
<212> DNA
<213> DNA4(DNA4)
<400> 4
tgagacgagc tgcctaagtg atgtctccaa cccccaaccg gacttttaag ttgtagctta 60
tcagctgact acattgtcaa gtagctttta agttgtagct tatcagctga ctacattgtc 120
aagt 124
<210> 5
<211> 137
<212> DNA
<213> DNA5(DNA5)
<400> 5
tttttatcag ttacagctcg caggatacga tccatgaagc ttatgagtta cagctcgctt 60
ttggctaccg ttaggcccta gtcaatcgaa tagtcttttt tcaacatcga atagtcgact 120
gatgtaacag ttcatcg 137
<210> 6
<211> 110
<212> DNA
<213> DNA6(DNA6)
<400> 6
ttttacggat tgatatccgg tgttacccgt ggaaccgatt ttttacttga caatgtagtc 60
agctgataag ctacaacttt tttatagtca atgtcgagcg tcctatgcta 110
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> DNA7(DNA7)
<400> 7
ttttcgaata gtcaatgtcg agcg 24
Claims (2)
1.一种比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法,其特征在于:其包括金纳米粒子的合成,金纳米粒子表面修饰拉曼DNA和拉曼信标分子,修饰后的金纳米粒子组装成空间四面体结构;步骤如下:
(1)金纳米粒子的合成:采用柠檬酸三钠还原合成法,通过控制柠檬酸三钠的加入量得到不同粒径的金纳米粒子;
在洁净锥形瓶中加入195mL超纯水和5mL 4g/L的氯金酸溶液,搅拌均匀并加热煮沸,7-8min后加入5mL或2.8mL、1%的柠檬酸三钠溶液,待溶液变为亮红色后,停止加热并继续搅拌至溶液冷却至室温;向溶液中加入200μL 2.5mg/mL的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐室温搅拌过夜;分别得到15nm或30nm的金纳米粒子;
(2)金纳米粒子表面修饰DNA:各取1mL 30nm的金纳米粒子于两个不同的PCR管中,4500rpm离心10min,后重悬于100μL的超纯水中使用;金纳米粒子分别与DNA1及 DNA3以最终摩尔比为1:25的比例混合均匀,反应4h后向体系中加入2μL 5M的NaCl溶液,室温反应过夜后离心除去多余的DNA,形成Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物;
分别取1mL 15nm的金纳米粒子于三个不同的PCR管中,8500rpm离心10 min,后重悬于100μL的超纯水中使用,金纳米粒子分别与DNA5、DNA6及 DNA7以摩尔比为1:25的比例混合均匀,反应4h后向体系中加入2μL 5M的NaCl溶液,室温反应过夜后离心除去多余的DNA,形成Au15-DNA5、Au15-DNA6、Au15-DNA7复合物;
(3)金纳米粒子-DNA复合物修饰拉曼信标分子:4-氨基苯硫酚4-ATP,4-硝基苯硫酚NTP和4-甲氧基苄硫醇MATT三种信标分子被用于金空间四面体结构的组装体中;其中Au30-DNA1、Au30-DNA3复合物上分别修饰NTP及 MATT,Au15-DNA7复合物上修饰4-ATP作为内参,另外两种15 nm的金纳米粒子上不做另外修饰;溶液中拉曼信标分子的终浓度均为5μM,信标分子加入到体系中反应过夜后离心,除去多余的信标分子,再向体系中加入超纯水恢复至原体积;
(4)金空间四面体结构的组装:将表面修饰有NTP、MATT的Au30-DNA1、 Au30-DNA3复合物等体积混合均匀,并以摩尔比为1:25的比例加入DNA2和DNA4,均匀混合4h后加入2μL 5 MNaCl溶液,室温反应过夜得到二聚体,离心去上清并用超纯水重悬恢复至原体积;将表面修饰有4-ATP的Au15-DNA7复合物与Au15-DNA5、Au15-DNA6复合物等体积混合均匀,室温反应过夜得到三聚体,离心去上清并用超纯水重悬恢复至原体积;最后将所得到的二聚体与三聚体全部混合均匀,反应过夜形成金四面体结构,用透射电镜表征其结构。
2.根据权利要求1所述比率型表面增强拉曼光谱的金空间四面体结构的制备方法,其特征在于所用DNA的设计如下:
DNA1:
5’-TTTTGTCCGG TTGGGGGGTA CTGTTGCACC CTGTCTGCGT TGGAGACATC AC-3’
DNA2:
5’-AGGCAGCTCG TCTCAAGAAT CCCAATCCCT TTTAATCGGT TCCACGGGTA ACACCGGATATCAATCCGTT TTTCCGATGG CAATCCGGGA TCAGTTAGCT TATCAG-3’
DNA3:5’-TTTGGGATAT GGATA-3’
DNA4:
5’-TGAGACGAGC TGCCTAAGTG ATGTCTCCAA CCCCCAACCG GACTTTTAAG TTGTAGCTTATCAGCTGACT ACATTGTCAA GTAGCTTTTA AGTTGTAGCT TATCAGCTGA CTACATTGTC AAGT-3’
DNA5:
5’-TTTTTATCAG TTACAGCTCG CAGGATACGA TCCATGAAGC TTATGAGTTA CAGCTCGCTTTTGGCTACCGT TAGGCCCTAG TCAATCGAAT AGTCTTTTTT CAACATCGAA TAGTCGACTG ATGTAACAGTTCATCG-3’
DNA6:
5’-TTTTACGGAT TGATATCCGG TGTTACCCGT GGAACCGATT TTTTACTTGA CAATGTAGTCAGCTGATAAG CTACAACTTT TTTATAGTCA ATGTCGAGCG TCCTATGCTA-3’
DNA7:5’-TTTTCGAATA GTCAATGTCG AGCG-3’。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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功能性纳米四面体的癌症标志物检测与DNA特异性剪切性质;郝恬甜;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20190115(第01期);正文第1-44页 * |
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