CN104155445A - 无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无标记电化学发光免疫传感器的制备方法及在肿瘤标志物的检测中的应用,属于新型纳米功能材料和生物传感器领域。本发明利用新型微纳米材料NH4CoPO4作为基底,使得鲁米诺–过氧化氢发光体系的发光稳定性大大增强,同时利用棒状的金银核壳纳米粒子作为生物模拟酶催化发光体系,从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肿瘤标志物的无标记电化学发光免疫传感器。
Description
技术领域
本发明涉及一种无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用。具体是采用无标记的电化学发光方法,基于磷酸钴铵片状材料(NH4CoPO4)和金银核壳纳米棒 – 鲁米诺 – 壳聚糖复合材料(AuAgNRs–Lum–Chi)构建的快速、灵敏检测肿瘤标志物的免疫传感器,属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。
背景技术
肿瘤的早期诊断、早期治疗是提高癌症患者生存率的关键。肿瘤标志物的检测可反映肿瘤的生物学特性,对治疗、辅助诊断、判断预后均有重要意义。目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多,如酶免疫法、放射免疫法等,但这些检测方法存在诸多不足,如酶免疫法中酶容易失活、放射免疫法中放射性污染严重等。因此,发明一种灵敏度高、特异性强、工作条件要求不高的环境友好型肿瘤标志物传感器迫在眉睫。
电化学发光免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临床诊断、药物分析等领域,如肿瘤标志物传感器等。制备性能优越的电化学发光免疫传感器,其最关键技术就是发光强度及稳定性和免疫分子的有效固定及重现性等性能的提高。
鲁米诺–过氧化氢(Lum-H2O2)发光体系由于成本低廉、发光强度高,已被广泛应用到电致化学发光的分析方法中,但由于Lum-H2O2发光体系的发光需要借助一定的催化剂,才能有快速、灵敏、高强度的光信号响应,因此一般常加入辣根过氧化物酶(HRP)来进行催化反应。而HRP的使用对反应条件要求苛刻,不利于Lum-H2O2发光体系的普及使用。棒状的金银核壳纳米棒(AuAgNRs)由于具有催化Lum-H2O2发光体系的作用,因此可以作为模拟酶被用来代替HRP,同时由于其为无机纳米材料,相比于HRP具有较宽泛的使用条件。另外,AuAgNRs具有比表面积大、易于与多种生物分子(核酸、蛋白质和生物分子等)结合、对人体无害等特点,可被应用于电致化学发光免疫传感器的制备中。
NH4CoPO4是一种片状的微纳米材料,已被应用于超级传感器的研究中,由于其片状结构,具有很好的充放电特性,应用到本发明中,可以达到稳定Lum-H2O2发光体系,并增大电极比表面积的作用。
本发明先后使用NH4CoPO4和AuAgNRs-Lum-Chi对电极进行修饰,然后利用肿瘤标志物抗体以及与其特异性结合的抗原的相继加入,使得发光强度降低,从而实现了采用无标记的电化学发光方法检测肿瘤标志物的免疫传感器的构建。本发明利用NH4CoPO4对Lum-H2O2发光体系的稳定作用和AuAgNRs对lum-H2O2发光体系的催化作用,设计了一种简单、快速、特异性好和灵敏度高的无标记的电化学发光免疫传感器,并应用于肿瘤标志物的检测。
发明内容
本发明的目的之一在于避免现有检测方法中存在的仪器设备复杂、操作过程繁琐及对检验人员的技能要求高等缺点,提供一种无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法,所制备的传感器具有灵敏度高、特异性强的特点,且制备简单、操作方便,可用于肿瘤标志物的快速、灵敏检测;
本发明的目的之二在于将所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器使用新型功能材料作为模拟酶,替代了生物酶,避免了实际样品检测时生物酶失活及检测环境的影响。
本发明采用的技术方案如下:
1. 本发明所述的一种无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法,其特征在于,制备步骤为:
(1)金 银核壳纳米棒 – 鲁米诺 – 壳聚糖复合材料(AuAgNRs-Lum-Chi)的制备
将20mL金纳米棒溶胶(AuNRs)和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合,在30~45℃下搅拌,并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸(AA)溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银(AgNO3)溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液,停止搅拌,静置1~3h,离心分离,将产品重新分散到20mL 水中,得到金 银核壳纳米棒溶胶(AuAgNRs)。
将3~5 mL的AuAgNRs和 3~5 mL 1×10-3 mol/L的鲁米诺(Lum)溶液混合,搅拌1~3h,离心分离,将产品重新分散到5mL质量分数为0.3 ~ 0.7 %的壳聚糖(CHi)溶液中,得到AuAgNRs-Lum-Chi溶液。
所述的AuNRs是20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。
所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
(2)磷酸钴铵片状材料(NH4CoPO4)的制备
在40mL水中加入2.0~4.0 g铵盐和0.15~0.25 g磷酸盐,完全溶解后,加入0.15~0.25 g氯化钴,在30~45℃下搅拌10~14h,离心分离,将产品置于50℃下干燥,即得到NH4CoPO4。
所述的铵盐选自下列之一:氯化铵、溴化铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵。
所述的磷酸盐选自下列之一:磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵。
(3)无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法
1)对工作电极进行预处理:将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、3.0和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理,依次用乙醇和超纯水进行超声清洗;
2)在1)中得到的电极表面滴加5~10 μL 1~5 mg/mL的NH4CoPO4水溶液,室温下自然晾干;
3)在2)中得到的电极表面滴加5~10 μL的AuAgNRs-Lum-Chi溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存;
4)在3)中得到的电极表面滴加5~8 μL 10 μg/mL的肿瘤标志物抗体溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干;
5)在4)中得到的电极表面滴加4~6 μL 100 μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存,制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。
2. 本发明所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器,用于肿瘤标志物的检测,步骤如下:
1)将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中,制得抗原混合溶液,取5~10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上,在4 ℃ 冰箱中保存晾干,pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后,晾干,4 ℃保存;
2)以饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极,与1)中组装的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光设备上;在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和1mL 3~6 mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液;用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压;根据所得的电致化学发光的光信号强度与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
3)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原的标准溶液,按照所述肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
3. 本发明所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用,其特征在于所述肿瘤标志物选自下列之一:癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、CA-199、CA-242、CA-724、甲胎蛋白(AFP)、鳞状细胞癌抗原(SCC)。
本发明的有益成果
(1)本发明所述的肿瘤标志物免疫传感器制备简单,操作方便,实现了对样品的快速、灵敏、高选择性检测,具有市场发展前景。
(2)本发明首次采用NH4CoPO4应用于电化学发光免疫传感器的制备,利用其对Lum-H2O2发光体系的稳定作用和对电极比表面积增大的作用,显著提高了电化学发光免疫传感器的稳定性,具有重要的科学意义和应用价值。
(3)本发明首次采用AuAgNRs–Lum–Chi应用于电化学发光免疫传感器的制备,并通过纳米材料的增效、增敏和催化作用,显著提高了电化学发光免疫传感器的灵敏度和准确性,实现了对肿瘤标志物的无标记检测,具有重要的科学意义和应用价值。
具体实施方式
实施例1 AuAgNRs-Lum-Chi的制备。
将20mL AuNRs和20mL 0.05 mol/L的CTAB溶液混合,在30℃下搅拌,并顺序加入3 mL 0.1 mol/L的AA溶液、0.5 mL 0.05 mol/L的AgNO3溶液和 3mL 0.1 mol/L的NaOH溶液,停止搅拌,静置1h,离心分离,将产品重新分散到20mL 水中,得到AuAgNRs。
将3 mL的AuAgNRs和 3 mL 1×10-3 mol/L的Lum溶液混合,搅拌1h,离心分离,将产品重新分散到5mL质量分数为0.3 %的壳聚糖溶液中,得到AuAgNRs-Lum-Chi溶液。
所述的AuNRs是20nm长的棒状AuNRs的水溶液。
所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
实施例2 AuAgNRs-Lum-Chi的制备。
将20mL AuNRs和20mL 0.1 mol/L的CTAB溶液混合,在38℃下搅拌,并顺序加入5 mL 0.1 mol/L的AA溶液、0.8 mL 0.05 mol/L的AgNO3溶液和 5mL 0.1 mol/L的NaOH溶液,停止搅拌,静置2h,离心分离,将产品重新分散到20mL 水中,得到AuAgNRs水溶液。
将4 mL的AuAgNRs和 4 mL 1×10-3 mol/L的Lum溶液混合,搅拌2h,离心分离,将产品重新分散到5mL质量分数为0.5 %的壳聚糖溶液中,得到AuAgNRs-Lum-Chi溶液。
所述的AuNRs是30nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。
所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
实施例3 AuAgNRs-Lum-Chi的制备。
将20mL AuNRs和20mL 0.2 mol/L的CTAB溶液混合,在45℃下搅拌,并顺序加入6 mL 0.1 mol/L的AA溶液、1 mL 0.05 mol/L的AgNO3溶液和 6mL 0.1 mol/L的NaOH溶液,停止搅拌,静置3h,离心分离,将产品重新分散到20mL 水中,得到AuAgNRs。
将5 mL的AuAgNRs和 5 mL 1×10-3 mol/L的Lum溶液混合,搅拌3h,离心分离,将产品重新分散到5mL质量分数为0.7 %的壳聚糖溶液中,得到AuAgNRs-Lum-Chi溶液。
所述的AuNRs是40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。
所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
实施例4 磷酸钴铵片状材料(NH4CoPO4)的制备
在40mL水中加入2.0 g氯化铵和0.15 g磷酸铵,完全溶解后,加入0.15 g氯化钴,在30℃下搅拌10h,离心分离,将产品置于50℃下干燥,即得到NH4CoPO4。
实施例5 磷酸钴铵片状材料(NH4CoPO4)的制备
在40mL水中加入3.0 g磷酸铵和0.2 g磷酸二氢铵,完全溶解后,加入0.2 g氯化钴,在35℃下搅拌12h,离心分离,将产品置于50℃下干燥,即得到NH4CoPO4。
实施例6 磷酸钴铵片状材料(NH4CoPO4)的制备
在40mL水中加入4.0 g磷酸二氢铵和0.25 g磷酸氢二铵,完全溶解后,加入0.25 g氯化钴,在45℃下搅拌14h,离心分离,将产品置于50℃下干燥,即得到NH4CoPO4。
实施例7 无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法。
(1)对工作电极进行预处理:将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、3.0和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理,依次用乙醇和超纯水进行超声清洗;
(2)在(1)中得到的电极表面滴加5 μL 1 mg/mL的NH4CoPO4溶液,室温下自然晾干;
(3)在(2)中得到的电极表面滴加5 μL的AuAgNRs-Lum-Chi溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存;
(4)在(3)中得到的电极表面滴加5 μL 10 μg/mL的肿瘤标志物抗体溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干;
(5)在(4)中得到的电极表面滴加4 μL 100 μg/mL的BSA溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存,制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。
所述的AuAgNRs-Lum-Chi由实施例1制备得到。
所述的NH4CoPO4由实施例4制备得到。
实施例8 无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法。
(1)同实施例7;
(2)在(1)中得到的电极表面滴加8 μL 3 mg/mL的NH4CoPO4溶液,室温下自然晾干;
(3)在(2)中得到的电极表面滴加8 μL的AuAgNRs-Lum-Chi溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存;
(4)在(3)中得到的电极表面滴加6 μL 10 μg/mL的肿瘤标志物抗体溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干;
(5)在(4)中得到的电极表面滴加5 μL 100 μg/mL的BSA溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存,制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。
所述的AuAgNRs-Lum-Chi由实施例2制备得到。
所述的NH4CoPO4由实施例5制备得到。
实施例9 无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法。
(1)同实施例7;
(2)在(1)中得到的电极表面滴加10 μL 5 mg/mL的NH4CoPO4溶液,室温下自然晾干;
(3)在(2)中得到的电极表面滴加10 μL的AuAgNRs-Lum-Chi溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存;
(4)在(3)中得到的电极表面滴加8 μL 10 μg/mL的肿瘤标志物抗体溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干;
(5)在(4)中得到的电极表面滴加6 μL 100 μg/mL的BSA溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存,制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。
所述的AuAgNRs-Lum-Chi由实施例3制备得到。
所述的NH4CoPO4由实施例6制备得到。
实施例10 实施例1~9制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器,用于肿瘤标志物的检测,步骤如下。
(1)将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40 μL、pH=7.0的PBS缓冲溶液中,制得抗原混合溶液,取5 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上,在4 ℃ 冰箱中保存晾干,pH=7.0的PBS缓冲溶液清洗后,晾干,4 ℃保存;
(2)以饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极,与(1)中组装的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光设备上;在电解槽中先后加入10mL pH=7.0的PBS缓冲溶液和1mL 3 mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液;用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压;根据所得的电致化学发光的光信号强度与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原的标准溶液,按照所述肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例11 实施例1~9制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器,用于肿瘤标志物的检测,步骤如下。
(1)将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到50 μL、pH=7.4的PBS缓冲溶液中,制得抗原混合溶液,取7 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上,在4 ℃ 冰箱中保存晾干,pH=7.4的PBS缓冲溶液清洗后,晾干,4 ℃保存;
(2)以饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极,与(1)中组装的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光设备上;在电解槽中先后加入20mL pH=7.4的PBS缓冲溶液和1mL 5 mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液;用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压;根据所得的电致化学发光的光信号强度与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原的标准溶液,按照所述肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例12 实施例1~9制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器,用于肿瘤标志物的检测,步骤如下。
(1)将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到60 μL、pH=8.0的PBS缓冲溶液中,制得抗原混合溶液,取10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上,在4 ℃ 冰箱中保存晾干,pH=8.0的PBS缓冲溶液清洗后,晾干,4 ℃保存;
(2)以饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极,与(1)中组装的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光设备上;在电解槽中先后加入25mL pH=8.0的PBS缓冲溶液和1mL 6 mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液;用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压;根据所得的电致化学发光的光信号强度与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原的标准溶液,按照所述肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例13 胃癌肿瘤标志物:CA-199、CA-242或CA-724。
一种无标记电化学发光胃癌肿瘤标志物免疫传感器的制备及应用,包括以下步骤:
(1)选择胃癌肿瘤标志物,按照实施例1~9所述的步骤构建无标记电化学发光免疫传感器;
(2)按照实施例10~12所述的步骤进行检测,胃癌肿瘤标志物的检测技术指标见表1。
表1 胃癌肿瘤标志物的检测技术指标
实施例14 乳腺癌肿瘤标志物:CA-125或CEA。
一种无标记电化学发光乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备及应用,包括以下步骤:
(1)选择乳腺癌肿瘤标志物,按照实施例1~6所述的步骤构建无标记电化学发光免疫传感器;
(2)按照实施例7~9所述的步骤进行检测,乳腺癌肿瘤标志物的检测技术指标见表2。
表2 乳腺癌肿瘤标志物的检测技术指标
实施例15 肝癌肿瘤标志物:AFP。
一种无标记电化学发光肝癌肿瘤标志物免疫传感器的制备及应用,包括以下步骤:
(1)以AFP为肝癌肿瘤标志物,按照实施例1~9所述的步骤构建无标记电化学发光免疫传感器;
(2)按照实施例10~12所述的步骤进行检测,AFP的线性检测范围为:0.008~28 ng/mL,检出限为:1.4 pg/mL。
实施例16 肺癌肿瘤标志物:SCC。
一种无标记电化学发光肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备及应用,包括以下步骤:
(1)以SCC为肺癌肿瘤标志物,按照实施例1~9所述的步骤构建无标记电化学发光免疫传感器;
(2)按照实施例10~12所述的步骤进行检测,SCC的线性检测范围为:0.008~27 ng/mL,检出限为:1.4 pg/mL。
实施例17 前列腺癌肿瘤标志物:PSA。
一种无标记电化学发光前列腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备及应用,包括以下步骤:
(1)以PSA为前列腺癌肿瘤标志物,按照实施例1~9所述的步骤构建无标记电化学发光免疫传感器;
(2)按照实施例10~12所述的步骤进行检测,PSA的线性检测范围为:0.007~27 ng/mL,检出限为:1.4 pg/mL。
实施例18 人血清中肿瘤标志物的检测。
准确移取人血清样品,加入一定质量浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液,以未加入肿瘤标志物抗原的人血清为空白,进行加标回收实验,按照实施例10~12的步骤进行检测,测定样品中肿瘤标志物的回收率,检测结果见表3。
表3 人血清中多种肿瘤标志物的检测结果
表3检测结果可知,结果的相对标准偏差(RSD)小于3.0 %,平均回收率为96.0 ~ 102%,表明本发明可用于人血清中多种肿瘤标志物的检测,方法的灵敏度高、特异性强,结果准确可靠。
Claims (3)
1.无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法,其特征在于,制备步骤为:
(1)金 银核壳纳米棒 – 鲁米诺 – 壳聚糖复合材料(AuAgNRs-Lum-Chi)的制备
将20mL金纳米棒溶胶(AuNRs)和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合,在30~45℃下搅拌,并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸(AA)溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银(AgNO3)溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液,停止搅拌,静置1~3h,离心分离,将产品重新分散到20mL 水中,得到金 银核壳纳米棒溶胶(AuAgNRs);
将3~5 mL的AuAgNRs和 3~5 mL 1×10-3 mol/L的鲁米诺(Lum)溶液混合,搅拌1~3h,离心分离,将产品重新分散到5mL质量分数为0.3 ~ 0.7 %的壳聚糖(CHi)溶液中,得到AuAgNRs-Lum-Chi溶液;
所述的AuNRs是20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液;
所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成;
(2)磷酸钴铵片状材料(NH4CoPO4)的制备
在40mL水中加入2.0~4.0 g铵盐和0.15~0.25 g磷酸盐,完全溶解后,加入0.15~0.25 g氯化钴,在30~45℃下搅拌10~14h,离心分离,将产品置于50℃下干燥,即得到NH4CoPO4;
所述的铵盐选自下列之一:氯化铵、溴化铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵;
所述的磷酸盐选自下列之一:磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵;
(3)无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法
1)对工作电极进行预处理:将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、3.0和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理,依次用乙醇和超纯水进行超声清洗;
2)在1)中得到的电极表面滴加5~10 μL 1~5 mg/mL的NH4CoPO4水溶液,室温下自然晾干;
3)在2)中得到的电极表面滴加5~10 μL的AuAgNRs-Lum-Chi溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存;
4)在3)中得到的电极表面滴加5~8 μL 10 μg/mL的肿瘤标志物抗体溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干;
5)在4)中得到的电极表面滴加4~6 μL 100 μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液,4 ℃ 冰箱中保存晾干,超纯水清洗,晾干成膜,4 ℃保存,制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。
2.如权利要求1所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器,用于肿瘤标志物的检测,步骤如下:
1)将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中,制得抗原混合溶液,取5~10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上,在4 ℃ 冰箱中保存晾干,pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后,晾干,4 ℃保存;
2)以饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极,与1)中组装的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光设备上;在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和1mL 3~6 mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液;用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压;根据所得的电致化学发光的光信号强度与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
3)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原的标准溶液,按照所述肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
3.如权利要求1和2所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用,其特征在于所述肿瘤标志物选自下列之一:癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、CA-199、CA-242、CA-724、甲胎蛋白(AFP)、鳞状细胞癌抗原(SCC)。
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