CN104407140B - 一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法，该制备方法包括大分子胶束的制备，大分子胶束修饰电极的制备，免疫传感器的制备三大步骤。本发明制备的大分子胶束具有很好的生物相容性，大分子胶束在免疫传感器的应用，可以有效提高抗体的固定量并很好的保持生物大分子的活性，所构建的免疫传感器具有高特异性、稳定性好、检测范围宽等优点；大分子自组装技术与电化学传感器的结合，可广泛应用于免疫分析并拓展应用于食品安全、生物医药及环保监测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感器领域，尤其是涉及一种采用大分子胶束—γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束修饰的电极，并将其制备成电化学免疫传感器的方法。
背景技术
2014年2月4日是“世界癌症日”，世界卫生组织(WHO)发表了《全球癌症报告2014》，研究称2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位；报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。
临床上对于癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原(CA125、CA19-9)等肿瘤标志物的检测，对结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性恶性肿瘤等的疗效判断、病情发展、监测和预后估计具有重要参考价值。目前检测血清中肿瘤标志物的免疫分析方法有多种，如放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫分析法和脂质体免疫分析法等，然而，这些方法具有辐射危害、背景噪音信号大、繁琐复杂的清洗过程、分析时间长、仪器贵重和需要专业操作人员等缺点。
电化学免疫传感器是将高灵敏的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以监测抗原-抗体(Antigen-Antibody)反应的一种新型生物传感器，它既具有电化学传感器的高灵敏度和简便经济等特点，又具有免疫分析的高特异性、强专一性和低检出限等优点。
大分子自组装是指大分子间通过非共价键作用而自发形成热力学稳定且具有明确有序结构的聚集体的过程。自组装的驱动力包括具有可逆性和选择性的氢键、静电作用、亲疏水作用、范德华力、金属配位作用以及能够可逆形成和破坏的共价键等作用力。通过自组装技术可制备形态丰富、功能迥异的大分子胶束，这种自组装胶束在许多高新技术领域如药物缓释、细胞显影、生物催化、纳米反应器、污水处理、化学传感器等具有很好的应用前景。
构建免疫传感器的关键在于抗体的固定技术(固定量)，因此免疫传感器修饰材料应具有比表面积大、活性位点多、非特异性吸附能力小、能很好的保持生物大分子活性等性质，传统修饰材料有壳聚糖等天然大分子、纳米碳基材料、纳米介孔无机纳米粒子、量子点等。然而，将大分子自组装胶束与生物分析技术结合构建新型、多样化电化学传感器，有望广泛应用于食品安全、生物医药及环保监测等领域。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法。本发明传感器采用的大分子胶束具有良好的稳定性和生物相容性，本发明传感器对于肿瘤标志物的检测具有灵敏度高、检测限低、检测范围宽、稳定性好等优点。
本发明的技术方案如下：
一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法，大分子胶束的制备、大分子胶束修饰电极的制备、免疫传感器的构建的具体步骤如下：
(1)大分子胶束的制备
将壳聚糖(CS)溶液逐滴加入到40～50倍其体积的γ-聚谷氨酸接枝多巴胺(γ-PGA-g-DA)溶液中，以500～1000rpm的转速搅拌，使壳聚糖与γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液通过静电作用自组装形成大分子胶束，继续以500～1000rpm的转速速搅拌5h～12h，使胶束聚合物组装完全；将所得大分子胶束溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布的大分子胶束溶液即γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束(γ-PGA-g-DACS)溶液；
(2)大分子胶束修饰电极的制备
将所述大分子胶束溶液通过滴涂、电泳沉积的方法修饰在传感电极表面，形成粒子膜，室温晾干，制得大分子胶束修饰电极；
所述电极为金电极、铂电极、玻碳电极或ITO玻璃电极；
(3)免疫传感器的构建
将制得的大分子胶束修饰电极浸入氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸在电极表面修饰纳米金粒子；再将纳米金修饰的电极浸入含抗体的磷酸盐缓冲溶液中与抗体结合；最后将结合抗体的电极浸入牛血清蛋白溶液中以封闭非特异性结合位点，即制得免疫传感器。
所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度0.5mg/mL～1.0mg/mL，溶剂为质量分数为1％～5％的醋酸水溶液或盐酸水溶液；γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液的浓度0.05mg/mL～0.5mg/mL，溶剂为去离子水或超纯水。
所述步骤(2)中电极在使用前需经预处理，预处理的方法为：
①抛光处理：电极依次用1.0μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极；
②将吹干的电极置于5mol/L的铁氰化钾溶液中，在-200mV～600mV范围内进行循环伏安测试，使扫描峰电位差小于100mV，否则将电极重新进行抛光处理。
所述步骤(2)中电泳沉积方法为将电极浸入大分子复合胶束溶液中，施加与复合胶束荷电相反的恒电位，使大分子复合胶束沉积在电极表面形成胶束粒子膜；修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极；电沉积工艺条件为：恒电位0.1V～10V，电沉积时间10s～600s。
所述步骤(2)中滴涂方法为用微量进样器吸取5～10μL复合胶束溶液滴涂于电极表面，室温下自然干燥，形成粒子膜，制得大分子胶束修饰电极。
所述步骤(3)中构建免疫传感器的具体步骤为：
①将大分子胶束修饰的电极浸入0.02mg/mL～0.2mg/mL的氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸，在大分子胶束修饰电极表面生成均匀分散的纳米金粒子；恒电位-0.1V～-2.0V，还原时间10s～300s；
②将步骤①所得的电极浸入含抗体的pH6.0～pH7.5的磷酸盐缓冲液中，在4℃条件下浸泡12～24h后取出，制得表面吸附有抗体的修饰电极；
③再将步骤②所得表面吸附有抗体的修饰电极浸入5mg/mL～10mg/mL的牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵育0.5h～2h以封闭非特异性吸附位点，制得所述免疫传感器；
④将所制备的免疫传感器浸入pH6.0～pH7.5的磷酸盐缓冲液中，4℃以下保存备用。
所述步骤②中的抗体为癌胚抗体、甲胎蛋白抗体、卵巢癌相关抗体、乳腺癌相关抗原、胃肠癌相关抗体、血管内皮生长因子、人体绒毛膜促性腺激素、前列腺癌抗体或微囊海藻素抗体。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明采用大分子自组装技术制备具有良好生物相容性的大分子胶束溶液，通过电泳沉积技术使大分子胶束在电极表面形成均匀的胶束粒子膜，不仅实现了电极修饰材料比表面积大的要求，且易于固定大分子蛋白质(如抗体)，有效提高抗体的固定量，而且可以很好地保持抗体的活性。
2、本发明传感器具有高特异性、灵敏度高、检测范围宽、检测限低等优点。
3、本发明将大分子自组装技术、电化学传感技术与生物分析技术结合可构建新型、多样化电化学传感器，有望广泛应用于食品安全、生物医药及环保监测等领域。
4、本发明传感器可避免传统检测方法的辐射危害、背景噪音信号大、繁琐复杂、分析时间长、仪器贵重和需要专业操作人员等缺点。
5、本发明免疫传感器可以用于对肿瘤标志物的检测，具有高特异性，使用时，将此免疫传感器与计算机连接，其电极接触相应探针分子溶液，根据检测信号的强弱来测定抗原的含量。
附图说明
图1：本发明的电化学免疫传感器的制备方法示意图；
图2：本发明实施例1中大分子胶束修饰电极表面的扫描电镜图；
图3：本发明实施例1中免疫传感器电极表面的扫描电镜图；
图4：本发明实施例1制得免疫传感器检测癌胚抗原的交流阻抗谱图；
图5：本发明实施例1制得免疫传感器检测癌胚抗原的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
如图1所示，本发明的电化学免疫传感器的制备方法示意图，由图中可以看出，首先在预处理好的裸电极上制备一层大分子胶束粒子膜，再将金纳米粒子修饰在胶束粒子膜上，再将癌胚等抗体吸附在胶束粒子膜表面并采用牛血清蛋白封闭非特异性吸附位点，制得所述免疫传感器，并用于检测癌胚等抗原。通过测试电化学信号的变化计算检测效果。
实施例1
一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)大分子胶束的制备
将500μL1.0mg/mL的壳聚糖醋酸溶液(质量分数为1％的醋酸水溶液为溶剂)逐滴加入到20mL0.2mg/mL的γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液中，以500rpm的转速搅拌，使壳聚糖与γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液通过静电作用自组装形成大分子胶束，继续以500rpm的转速速搅拌12h，使胶束聚合物组装完全；将所得大分子胶束溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布的大分子胶束溶液即γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖(γ-PGA-g-DACS)复合胶束溶液；
(2)大分子胶束修饰电极的制备
①抛光处理：玻碳电极(直径为3mm)依次用1.0μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极；
②将吹干的电极置于5mol/L的铁氰化钾溶液中，在-200mV～600mV范围内进行循环伏安测试，使扫描峰电位差小于100mV，否则将电极重新进行抛光处理；
③将抛光处理好的电极浸入步骤(1)制备的大分子复合胶束溶液中，施加与复合胶束荷电相反的恒电位，使大分子复合胶束沉积在电极表面形成胶束粒子膜；电沉积在上海辰华CHI660A电化学工作站进行，采用三电极系统，玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极；电沉积工艺条件为：恒电位1.0V，电沉积时间120s；电极表面的扫描电镜如图2所示，可以看出，大分子胶束在电极表面形成了均匀、致密的粒子膜；
(3)免疫传感器的构建
①将步骤(2)制备的大分子胶束修饰的电极浸入0.1mg/mL的氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸，在大分子胶束修饰电极表面生成均匀分散的纳米金粒子；恒电位-1.0V，还原时间30s；
②将步骤①所得的电极浸入0.5mL浓度为10.8μg/mL的癌胚抗体(CEA-Ab)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，在4℃条件下浸泡12h后取出，制得表面吸附有抗体的修饰电极；
③再将步骤②所得表面吸附有抗体的修饰电极浸入5mg/mL的牛血清蛋白溶液中，在37℃条件下孵育2h以封闭非特异性吸附位点，制得所述免疫传感器；
④将所制备的免疫传感器浸入pH7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃以下保存备用。免疫传感器电极表面的扫描电镜如图3所示，可以看出在电极表面固定了大量的抗体。
实施例2
一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)大分子胶束的制备
将1mL0.5mg/mL的壳聚糖盐酸溶液(质量分数1％的盐酸水溶液为溶剂)逐滴加入到40mL0.1mg/mL的γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液中，以1000rpm的转速搅拌，使壳聚糖与γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液通过静电作用自组装形成大分子胶束，继续以1000rpm的转速搅拌5h，使胶束聚合物组装完全；将所得大分子胶束溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布的大分子胶束溶液即γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖(γ-PGA-g-DACS)复合胶束溶液；
(2)大分子胶束修饰电极的制备
①抛光处理：铂电极(直径为3mm)依次用1.0μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极；
②将吹干的电极置于5mol/L的铁氰化钾溶液中，在-200mV～600mV范围内进行循环伏安测试，使扫描峰电位差小于100mV，否则将电极重新进行抛光处理；
③将抛光处理好的电极浸入步骤(1)制备的大分子复合胶束溶液中，施加与复合胶束荷电相反的恒电位，使大分子复合胶束沉积在电极表面形成胶束粒子膜；电沉积在上海辰华CHI660A电化学工作站进行，采用三电极系统，铂电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极；电沉积工艺条件为：恒电位10V，电沉积时间15s；
(3)免疫传感器的构建
①将步骤(2)制备的大分子胶束修饰的电极浸入0.2mg/mL的氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸，在大分子胶束修饰电极表面生成均匀分散的纳米金粒子；恒电位-2.0V，还原时间20s；
②将步骤①所得的电极浸入0.5mL浓度为10.8μg/mL的甲胎蛋白抗体(AFP-Ab)的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在4℃条件下浸泡18h后取出，制得表面吸附有抗体的修饰电极；
③再将步骤②所得表面吸附有抗体的修饰电极浸入10mg/mL的牛血清蛋白溶液中，在37℃条件下孵育1h以封闭非特异性吸附位点，制得所述免疫传感器；
④将所制备的免疫传感器浸入pH7.5的磷酸盐缓冲液中，4℃以下保存备用。
实施例3
一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)大分子胶束的制备
将1mL0.8mg/mL的壳聚糖盐酸溶液(质量分数1％的盐酸水溶液为溶剂)逐滴加入到50mL0.05mg/mL的γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液中，以700rpm的转速搅拌，使壳聚糖与γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液通过静电作用自组装形成大分子胶束，继续以700rpm的转速速搅拌8h，使胶束聚合物组装完全；将所得大分子胶束溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布的大分子胶束溶液即γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖(γ-PGA-g-DACS)复合胶束溶液；
(2)大分子胶束修饰电极的制备
①抛光处理：金电极(直径为3mm)依次用1.0μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极；
②将吹干的电极置于5mol/L的铁氰化钾溶液中，在-200mV～600mV范围内进行循环伏安测试，使扫描峰电位差小于100mV，否则将电极重新进行抛光处理；
③用微量进样器吸取10μL复合胶束溶液滴涂于电极表面，室温下自然干燥，形成粒子膜，制得大分子胶束修饰电极；
(3)免疫传感器的构建
①将步骤(2)制备的大分子胶束修饰的电极浸入0.02mg/mL的氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸，在大分子胶束修饰电极表面生成均匀分散的纳米金粒子；恒电位-1.0V，还原时间30s；
②将步骤①所得的电极浸入0.5mL浓度为10μg/mL的前列腺癌抗体的磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，在4℃条件下浸泡24h后取出，制得表面吸附有抗体的修饰电极；
③再将步骤②所得表面吸附有抗体的修饰电极浸入8mg/mL的牛血清蛋白溶液中，在37℃条件下孵育0.5h以封闭非特异性吸附位点，制得所述免疫传感器；
④将所制备的免疫传感器浸入pH6.0的磷酸盐缓冲液中，4℃以下保存备用。
测试例：
免疫传感器对癌胚抗原(CEA)的电化学检测
将实施例1制备好的免疫传感器分别浸入浓度依次为(a)0g·mL-1，(b)1.8×10- 14g·mL-1，(c)2.0×10-13g·mL-1，(d)2.0×10-12g·mL-1，(e)2.0×10-11g·mL-1，(f)2.0×10-10g·mL-1，(g)2.0×10-9g·mL-1，(h)2.0×10-8g·mL-1，(i)2.0×10-7g·mL-1，(j)2.0×10- 6g·mL-1的癌胚抗原磷酸盐缓溶液(pH7.4)中，37℃条件下孵育2h；将吸附癌胚抗原(CEA)的免疫传感器取出取出，用磷酸盐缓冲液淋洗后，以该免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在上海辰华CHI660A电化学工作站上，采用电化学交流阻抗法进行测定。
通过测试未结合抗原的免疫传感器与结合不同浓度癌胚抗原的免疫传感器的阻抗，并计算前后阻抗的变化率(ΔRct(％))即可得到相应的线性关系曲线，从而实现对癌胚抗原的检测。检测结果如图4、5所示。测试阻抗的结果如表1所示。
表1
| 分组 | 阻抗值(Ω) | ΔRct(％) |
| a | 4809 | 0 |
| b | 5160 | 7.29881 |
| c | 5329 | 10.81306 |
| d | 5796 | 20.52402 |
| e | 6075 | 26.32564 |
| f | 6358 | 32.21044 |
| g | 6742 | 40.19547 |
| h | 6994 | 45.43564 |
| i | 7646 | 58.99355 |
| j | 8552 | 77.83323 |
由图4、5可以看出，所制备的免疫传感器对1.8×10-14g·mL-1～2.0×10-8g·mL-1浓度范围的癌胚抗原具有良好的线性响应性，最低检测限达到10fg·mL-1，线性响应方程为：
ΔRct(％)＝96.430+6.568lgCCEA，(S/N＝3)，R2＝0.992。
Claims (7)
1.一种基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束的免疫传感器的制备方法，其特征在于大分子胶束的制备、大分子胶束修饰电极的制备、免疫传感器的构建，具体步骤如下：
(1)大分子胶束的制备
将壳聚糖溶液逐滴加入到40～50倍其体积的γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液中，以500～1000rpm的转速搅拌，使壳聚糖与γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液通过静电作用自组装形成大分子胶束，继续以500～1000rpm的转速搅拌5h～12h，使胶束聚合物组装完全；将所得大分子胶束溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布的大分子胶束溶液即γ-聚谷氨酸接枝多巴胺壳聚糖复合胶束溶液；
(2)大分子胶束修饰电极的制备
将所述大分子胶束溶液通过滴涂、电泳沉积的方法修饰在传感电极表面，形成粒子膜，室温晾干，制得大分子胶束修饰电极；
所述电极为金电极、铂电极、玻碳电极或ITO玻璃电极；
(3)免疫传感器的构建
将制得的大分子胶束修饰电极浸入氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸在电极表面修饰纳米金粒子；再将纳米金修饰的电极浸入含抗体的磷酸盐缓冲溶液中与抗体结合；最后将结合抗体的电极浸入牛血清蛋白溶液中以封闭非特异性结合位点，即制得免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度0.5mg/mL～1.0mg/mL，溶剂为质量分数为1％～5％的醋酸水溶液或盐酸水溶液；γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液的浓度0.05mg/mL～0.5mg/mL，溶剂为去离子水或超纯水。
3.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中电极在使用前需经预处理，预处理的方法为：
(1)抛光处理：电极依次用1.0μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极；
(2)将吹干的电极置于5mol/L的铁氰化钾溶液中，在-200mV～600mV范围内进行循环伏安测试，使扫描峰电位差小于100mV，否则将电极重新进行抛光处理。
4.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中电泳沉积方法为将电极浸入大分子复合胶束溶液中，施加与复合胶束荷电相反的恒电位，使大分子复合胶束沉积在电极表面形成胶束粒子膜；修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极；电沉积工艺条件为：恒电位0.1V～10V，电沉积时间10s～600s。
5.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中滴涂方法为用微量进样器吸取5～10μL复合胶束溶液滴涂于电极表面，室温下自然干燥，形成粒子膜，制得大分子胶束修饰电极。
6.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中构建免疫传感器的具体步骤为：
(1)将大分子胶束修饰的电极浸入0.02mg/mL～0.2mg/mL的氯金酸水溶液中，通过恒电位还原氯金酸，在大分子胶束修饰电极表面生成均匀分散的纳米金粒子；恒电位-0.1V～-2.0V，还原时间10s～300s；
(2)将步骤(1)所得的电极浸入含抗体的pH6.0～pH7.5的磷酸盐缓冲液中，在4℃条件下浸泡12～24h后取出，制得表面吸附有抗体的修饰电极；
(3)再将步骤(2)所得表面吸附有抗体的修饰电极浸入5mg/mL～10mg/mL的牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵育0.5h～2h以封闭非特异性吸附位点，制得所述免疫传感器；
(4)将所制备的免疫传感器浸入pH6.0～pH7.5的磷酸盐缓冲液中，4℃以下保存备用。
7.根据权利要求6所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的抗体为卵巢癌相关抗体、乳腺癌相关抗原、胃肠癌相关抗体、血管内皮生长因子、人体绒毛膜促性腺激素、前列腺癌抗体或微囊海藻素抗体。
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