CN105158479A - 一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学免疫传感技术领域。以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6？为电化学探针，以AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料，基于其良好的生物相容性和稳定性，大的比表面积大，优异的导电性等优点，显著提高了免疫传感器的稳定性和灵敏度。该传感器用于癌胚抗原的检测，检测线性范围0.1pg/mL~10ng/mL，检出限0.05pg/mL。

Description

一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料制备一种检测癌胚抗原的电化学免疫传感器。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是一个广谱性肿瘤标志物，能反映出多种肿瘤的存在，扮演角色为功能性结肠癌配体，在大肠癌、乳腺癌和肺癌的辅助诊断，疗效评价、病情控制和发展、监测复发方面是一个较好的肿瘤标志物。目前测定CEA的免疫方法主要有酶联免疫分析，荧光免疫分析，放射免疫分析等。这些方法灵敏可靠的优点。但是存在一定的缺陷，如酶联免疫分析和荧光免疫分析成本较高，并且存在试剂盒难以保存的问题，而放射性免疫分析的重现性较差，有辐射危害。电化学免疫传感器由于所需仪器设备简单，操作简便，灵敏度高，选择，成本低等优点受到了广泛关注。目前在疾病诊断领域面临的主要挑战是如何发展微型化、集成化和便携化的监测分析手段和设，建立一套简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的方法。因此本发明制备了一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器，将免疫学方法与电化学方法相结合，以K3Fe(CN)6为电化学探针，通过抗原抗体之间高度的特异性结合实现对CEA的检测。
本发明AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料，在此，PDDA作为导电聚合物一方面可以增加电极的导电性，另一方面可以改变石墨烯的表面性能阻止石墨烯团聚。PDDA和石墨烯的协同效应可以使修饰电极具有更大有效面积，为AuNPs提供更多的依附位点，而AuNPs的量又能直接影响抗体在电极上的负载量。实验中采用PDDA-GN和AuNPs也将提高修饰电极的电子转移途径和生物兼容性。在本发明构建的电化学免疫传感成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高。
发明内容
本发明的目的之一是基于AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料，构建了一种无酶，无标记，稳定性好，灵敏度高的电化学免疫传感器；
本发明的目的之二是采用K3Fe(CN)6为电化学探针，通过抗原抗体之间高度的特异性结合实现对CEA的检测。
本发明的技术方案为：
1.一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干，取6~10μLAuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNPs-PDDA-GR得到AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(2)取50μL1.0~2.5μg/mL的癌胚抗原抗体(anti-CEA)标准溶液滴涂到电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(3)取50μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(4)滴加50μL浓度为0.1pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器(CEA/BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
2.上述的AuNPs-PDDA-GR分散液的制备：
(1)PDDA-GR的制备
称取50mg的氧化石墨烯(GO)溶于100mL超纯水中，超声2h得到均一分散的溶液，然后向该溶液中加入0.5mL质量分数为20%的PDDA溶液，搅拌30min。再向该溶液中加入0.5mL80%的水合肼，90℃油浴搅拌24h，得到PDDA-GR黑色悬浊液。离心洗涤至中性后重新分散到超纯水中得到PDDA-GR溶液；
(2)金纳米溶液(AuNPs)的制备
量取97mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl4和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得AuNPs溶液；
(3)AuNPs-PDDA-GR分散液的制备
取0.1mLPDDA-GR在搅拌的条件下加入到5mLAuNPs溶液中，超声60min后搅拌30min，得到的混合溶液在9000转离心10min，用超纯水洗涤3次后再重新分散到1mL超纯水中，得到AuNPs-PDDA-GR分散液。
3.CEA的检测：
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。在10mL2×10-4mol/LK3Fe(CN)6和0.1mol/LKCl的PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液及未特异性结合CEA的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.2V~0.6V，扫描速度为100mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和CEA浓度的关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
(1)本发明以AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料，一方面PDDA和石墨烯的协同效应不仅能够增加电极的导电性也能使修饰电极具有更大有效面积，为AuNPs提供更多的依附位点，另一方面AuNPs可以直接与抗体结合，将抗体固定在电极表面，无需使用交联剂；；
(2)本发明制备的电化学免疫传感器用于CEA的检测，操作简单，线性范围宽，检出限低，可以实现对CEA的简单、快速、高灵敏检测。线性范围为0.1pg/mL~10ng/mL，检出限为0.05pg/mL。
附图说明：
图1为不同浓度甲胎蛋白的电致化学发光强度图；
图2为不同浓度甲胎蛋白的相对电致化学发光强度与lgc的线性拟合图。
其中，图1中由a到i的电致化学发光强度图分别代表甲胎蛋白的浓度为0，0.0001，0.0005，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，1，10ng/mL。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干，取6μLAuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNPs-PDDA-GR得到AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(2)取50μL1.0μg/mL的癌胚抗原抗体(anti-CEA)标准溶液滴涂到电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(3)取50μL质量分数为1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(4)滴加50μL浓度为0.1pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器(CEA/BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
实施例2一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4mm的GCE，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干，取8μLAuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNPs-PDDA-GR得到AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(2)取50μL2.0μg/mL的anti-CEA标准溶液滴涂到电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(3)取50μL质量分数为2%的BSA溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(4)滴加50μL浓度为0.1pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器(CEA/BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
实施例3一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干，取10μLAuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNPs-PDDA-GR得到AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(2)取50μL2.5μg/mL的anti-CEA标准溶液滴涂到电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(3)取50μL质量分数为3%的BSA溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(4)滴加50μL浓度为0.1pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器(CEA/BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
实施例4上述的AuNPs-PDDA-GR分散液的制备
(1)PDDA-GR溶液的制备
称取50mg的氧化石墨烯(GO)溶于100mL超纯水中，超声2h得到均一分散的溶液，然后向该溶液中加入0.5mL质量分数为20%的PDDA溶液，搅拌30min。再向该溶液中加入0.5mL80%的水合肼，90℃油浴搅拌24h，得到PDDA-GN黑色悬浊液。离心洗涤至中性后重新分散到超纯水中得到PDDA-GR溶液；
(2)金纳米溶液(AuNPs)的制备
量取97mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl4和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得AuNPs溶液；
(3)AuNPs-PDDA-GR分散液的制备
取0.1mLPDDA-GN溶液在搅拌的条件下加入到5mLAuNPs溶液中，超声60min后搅拌30min，得到的混合溶液在9000转离心10min，用超纯水洗涤3次后再重新分散到1mL超纯水中，得到AuNPs-PDDA-GR分散液。
实施例5CEA的检测
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。在10mL2×10-4mol/LK3Fe(CN)6和0.1mol/LKCl的PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液及未特异性结合CEA的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.2V~0.6V，扫描速度为100mV/s，记录示差脉冲伏安图，所得结果见图1，根据所得的峰电流值(不同浓度CEA标准溶液的电极的峰电流记为I，未特异性结合CEA的电极的峰电流记为I 0)和CEA浓度的关系，绘制工作曲线；
(3)得到的峰电流差值ΔI p(I 0-I)与CEA浓度的对数(lgc)的线性关系见图2，由图2可知，CEA在0.1pg/mL~10ng/mL浓度范围内，ΔI p与CEA浓度的对数呈良好的线性相关，线性方程为ΔI p=-4.059lgc-53.43，线性相关系数为0.9939，检出线为0.05pg/mL；
(4)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。

Claims (3)

1.一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干，取10μLAuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNPs-PDDA-GR得到AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(2)取50μL1~2.5μg/mL的癌胚抗原抗体(anti-CEA)标准溶液滴涂到电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(3)取50μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；
(4)滴加50μL浓度为0.1pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器(CEA/BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
2.根据权利要求1所述的一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法，所述的AuNPs-PDDA-GR分散液，其特征在于，制作步骤如下：
(1)PDDA-GR的制备
称取50mg的氧化石墨烯(GO)溶于100mL超纯水中，超声2h得到均一分散的溶液，然后向该溶液中加入0.5mL质量分数为20%的PDDA溶液，搅拌30min，再向该溶液中加入0.5mL80%的水合肼，90℃油浴搅拌24h，得到PDDA-GN黑色悬浊液，离心洗涤至中性后重新分散到超纯水中得到PDDA-GR溶液；
(2)金纳米溶液(AuNPs)的制备
量取97mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl4和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得AuNPs溶液；
(3)AuNPs-PDDA-GR分散液的制备
取0.1mLPDDA-GN在搅拌的条件下加入到5mLAuNPs溶液中，超声60min后搅拌30min，得到的混合溶液在9000转离心10min，用超纯水洗涤3次后再重新分散到1mL超纯水中，得到AuNPs-PDDA-GR分散液。
3.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器，其特征在于，用于CEA的检测，检测步骤如下：
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在10mL2×10-4mol/LK3Fe(CN)6和0.1mol/LKCl的PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液及未特异性结合CEA的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.2V~0.6V，扫描速度为100mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。
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