CN105738457A - 一种基于金属基标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于金属基标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种基于金属基标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备方法及应用。本发明涉及一种快速、灵敏同时检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)两种肿瘤标志物的免疫传感器的制备领域，特别是涉及一种金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器，利用磁性多巴胺纳米微球活性表面积大、易分离的优点，通过选择合适的封端剂增加金属离子的负载量，从而将电化学信号放大，实现肿瘤标志物的快速、灵敏检测。该修饰电极制作较为简便，稳定性好，反应迅速，对甲胎蛋白和癌胚抗原具有较高的选择性和灵敏度。

Description

一种基于金属基标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种快速、灵敏同时检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)两种肿瘤标志物的免疫传感器的制备领域，特别是涉及一种金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器，利用磁性多巴胺纳米微球活性表面积大、易分离的优点，通过选择合适的螯合剂增加金属离子的负载量，从而将电化学信号放大，实现肿瘤标志物的同时、快速、灵敏检测。
背景技术
肿瘤标志物被认为是一种检测生物体正常的生命过程、生理病变及药理学响应的指示器，其早期检测对于癌症得治疗具有重大意义。而一种癌症往往有多种相关的肿瘤标志物，一种肿瘤标志物往往又表达了几种癌症，因此为了避免不同的人在表达方面的差异而引起的误诊，急需发展一种简便、快速、灵敏的检测方法，实现多种肿瘤标志物的同时检测。
目前同时测定多种肿瘤标志的免疫方法有很多，如拉曼光谱法法、荧光法、化学发光法等。这些方法具有较高的灵敏度和选择性，但检测过程需要昂贵的专用仪器，需要复杂的前处理且操作繁琐、样品消耗量较大，不适宜快速检测。电化学免疫传感器具有设备简单，操作方便，灵敏度高，选择性好，检测速度快等优点。因此本发明制备了一种基于多巴胺磁性微球为捕获探针、金属离子标记石墨烯/金纳米粒子复合物为二抗标记物的夹心型免疫传感器，通过检测不同金属离子还原信号，实现两种肿瘤标志物的同时检测。
本发明利用多巴胺自聚合方法制备的磁性多巴胺微球作为捕获探针，比表面积大、富含有效官能团、且易分离。选择合适的螯合剂使大量铅、镉金属离子负载在石墨烯/金纳米复合物上，做二抗标记物，实现电化学信号的放大和肿瘤标志物的同时检测。该修饰电极制作较为简便，稳定性好，反应迅速，对甲胎蛋白和癌胚抗原具有较高的选择性和灵敏度。
发明内容
本发明的目的就是针对上述肿瘤标志物测定中的缺点而提供一种金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器，利用磁性多巴胺纳米微球活性表面积大、易分离的优点，通过选择合适的封端剂增加金属离子的负载量，从而将电化学信号放大，实现肿瘤标志物的同时、快速、灵敏检测。
本发明的技术方案为：
1.利用金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备方法：
（1）分别将100μLanti-CEA（100μg/ml，二抗）和100μLanti-AFP（100μg/ml，二抗）加入到G-Au-Cd2+和G-Au-Pb2+中，振荡过夜，获得anti-CEA-G-Au-Cd2+和anti-AFP-G-Au-Pb2+，加入1mL1%的BSA，振荡2h，封闭非特异性结合的位点，用PBS（0.01mol/L，PH7.4）离心洗涤，分散到5mLPBS（0.01mol/L，PH7.4）中；
（2）将150μLanti-AFP（10μg/mL，一抗）和150μLanti-CEA（10μg/mL，一抗）加入到Fe3O4PDA中，在4℃下孵化1h，然后用PBS洗涤，除去非特异性结合的一抗；加入0.5mL2%的BSA，在4℃下震荡1h，用PBS洗涤3次，得Fe3O4PDA/Ab1；将Fe3O4PDA/Ab1在100μLAFP（10μg/mL）和CEA（10μg/mL）中37oC下孵化40min，用PBS洗涤3次，得Fe3O4PDA/Ab1/Ag复合物；
（3）将Fe3O4PDA/Ab1/Ag加入到0.5mL的anti-CEA-G-Au-Cd2+和anti-AFP-G-Au-Pb2+的混合物中，37oC下孵化30min，得到夹心型免疫复合物，磁性分离，然后用PBS洗涤3次，分散在2mLpH4.5的NaAc-HAC缓冲溶液中。
2.磁性多巴胺纳米微球的制备
（1）磁性Fe3O4纳米粒子的制备
将2.7gFeCl3·6H2O和7.2gNaAc剧烈搅拌下溶解在100mL的乙二醇中，得到均相黄色溶液，然后将该溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中封闭，180℃下加热反应10h，待高压釜冷却至室温后，将黑色磁性颗粒用磁铁分离收集，用去离子水与无水乙醇洗涤，得磁性Fe3O4纳米粒子；
（2）磁性Fe3O4PDA的制备
将25mg的Fe3O4颗粒加到25mL0.02mol/L的Tris-HCl（pH8.0）溶液中，超声30min，使Fe3O4颗粒能够充分分散，将50mg的盐酸多巴胺分散到25mL去离子水中，搅拌下将多巴胺溶液快速注入到Fe3O4溶液中，搅拌8h，用去离子水洗涤，得磁性多巴胺纳米微球（Fe3O4PDA）。
3、石墨烯/金/金属离子(G-Au-M)复合物的制备
（1）G-Au的制备
称取4mg的石墨烯，分散在10ml二次水中，超声20min，0.4mLHAuCl4（1.0wt%）和0.4mgNaOH快速加入到上述混合物中，超声2h，8000r/min下离心洗涤10min，获得石墨烯/金（G-Au）复合物，将其重新分散在2ml二次水中；
（2）G-Au-M复合物的制备
1mL10-4mol/L的巯基乙酸加入到2mL上述溶液中，加入1mL10-3mol/L的CdCl2溶液，超声分散5min，常温下搅拌过夜，用去离子水离心洗涤，重新分散到1mL的PBS（0.01mol/L，pH7）中，得G-Au-Cd2+，将巯基乙酸改为半胱氨酸以同样的方法做G-Au-Pb2+。
4．AFP和CEA的检测：
（1）在含有400μg/LHg2+及夹心型免疫复合物的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.5）的电解池中以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；实验在CHI625B电化学综合测试仪上进行，其附属的计算机软件供作实验数据的采集和处理；在-1.2V电位进行沉积，沉积时间180s，富集金属离子的同时镀汞，富集结束后静止15s，在-1-0.2V电位之间进行方波溶出伏安扫描，测量峰电流值，测定完成后将电极置于+0.6V电位下清洗；
（2）改变抗原的浓度制备一系列夹心型免疫复合物，进行扫描，记录方波溶出伏安图，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替AFP和CEA标准溶液进行检测。
本发明的有益效果为：
（1）本发明以磁性多巴胺纳米微球为捕获探针，利用磁性多巴胺纳米微球官能团有效丰富、活性表面积大等优点，可以捕获更多一抗，从而将电化学信号放大，提高灵敏度；
（2）本发明通过选择合适的封端剂增大金属离子在石墨烯/金复合物上的负载量，从而将电化学信号放大，提高灵敏度；
（3）本发明用不同的金属离子复合物标记二抗对癌胚抗原和甲胎蛋白进行同时检测，根据金属离子在电极表面的电化学信号发生变化，通过对变化程度的检测来测定癌胚抗原和甲胎蛋白的含量，实现两种肿瘤标志物的同时检测。
附图说明：
图1所示为不同浓度的癌胚抗原电化学信号影响的方波溶出伏安还原峰图；
图2所示为本发明CEA峰电流值与lgc线性关系图;
图3所示为本发明AFP峰电流值与lgc线性关系图。
其中，图1中由a到g的电流强度图分别代表CEA和AFP的浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1，10，100ng/mL。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1.利用金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备方法：
（1）分别将100μLanti-CEA（100μg/ml，二抗）和100μLanti-AFP（100μg/ml，二抗）加入到G-Au-Cd2+和G-Au-Pb2+中，振荡过夜，获得anti-CEA-G-Au-Cd2+和anti-AFP-G-Au-Pb2+，加入1mL1%的BSA，振荡2h，封闭非特异性结合的位点，用PBS（0.01mol/L，PH7.4）离心洗涤，分散到5mLPBS（0.01mol/L，PH7.4）中；
（2）将150μLanti-AFP（10μg/mL，一抗）和150μLanti-CEA（10μg/mL，一抗）加入到Fe3O4PDA中，在4℃下孵化1h，然后用PBS洗涤，除去非特异性结合的一抗；加入0.5mL2%的BSA，在4℃下震荡1h，用PBS洗涤3次，得Fe3O4PDA/Ab1；将Fe3O4PDA/Ab1在100μLAFP（10μg/mL）和CEA（10μg/mL）中37oC下孵化40min，用PBS洗涤3次，得Fe3O4PDA/Ab1/Ag复合物；
（3）将Fe3O4PDA/Ab1/Ag加入到0.5mL的anti-CEA-G-Au-Cd2+和anti-AFP-G-Au-Pb2+的混合物中，37oC下孵化30min，得到夹心型免疫复合物，磁性分离，然后用PBS洗涤3次，分散在2mLpH4.5的NaAc-HAC缓冲溶液中。
实施例2.磁性多巴胺纳米微球的制备
（1）磁性Fe3O4纳米粒子的制备
将2.7gFeCl3·6H2O和7.2gNaAc剧烈搅拌下溶解在100mL的乙二醇中，得到均相黄色溶液，然后将该溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中封闭，180℃下加热反应10h，待高压釜冷却至室温后，将黑色磁性颗粒用磁铁分离收集，用去离子水与无水乙醇洗涤，得磁性Fe3O4纳米粒子；
（2）磁性Fe3O4PDA的制备
将25mg的Fe3O4颗粒加到25mL0.02mol/L的Tris-HCl（pH8.0）溶液中，超声30min，使Fe3O4颗粒能够充分分散，将50mg的盐酸多巴胺分散到25mL去离子水中，搅拌下将多巴胺溶液快速注入到Fe3O4溶液中，搅拌8h，用去离子水洗涤，得磁性多巴胺纳米微球（Fe3O4PDA）。
实施例3.石墨烯/金/金属离子(G-Au-M)复合物的制备
（1）G-Au的制备
称取4mg的石墨烯，分散在10ml二次水中，超声20min，0.4mLHAuCl4（1.0wt%）和0.4mgNaOH快速加入到上述混合物中，超声2h，8000r/min下离心洗涤10min，获得石墨烯/金（G-Au）复合物，将其重新分散在2ml二次水中；
（2）G-Au-M复合物的制备
1mL10-4mol/L的巯基乙酸加入到2mL上述溶液中，加入1mL10-3mol/L的CdCl2溶液，超声分散5min，常温下搅拌过夜，用去离子水离心洗涤，重新分散到1mL的PBS（0.01mol/L，pH7）中，得G-Au-Cd2+，将巯基乙酸改为半胱氨酸以同样的方法做G-Au-Pb2+。
实施例4.AFP和CEA的检测：
（1）在含有400μg/LHg2+及夹心型免疫复合物的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.5）的电解池中以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；实验在CHI625B电化学综合测试仪上进行，其附属的计算机软件供作实验数据的采集和处理；在-1.2V电位进行沉积，沉积时间180s，富集金属离子的同时镀汞，富集结束后静止15s，在-1-0.2V电位之间进行方波溶出伏安扫描，测量峰电流值，测定完成后将电极置于+0.6V电位下清洗；
（2）改变抗原的浓度制备一系列夹心型免疫复合物，进行扫描，记录方波溶出伏安图，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替AFP和CEA标准溶液进行检测。

Claims (4)

1.一种基于金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备，其特征在于以磁性多巴胺纳米微球为捕获探针，利用金属离子/石墨烯/金纳米粒子复合物为二抗标记物的夹心型免疫传感器，利用磁性多巴胺纳米微球活性表面积大、易分离的优点，通过选择合适的螯合剂增加金属离子的负载量，从而将电化学信号放大，实现肿瘤标志物的快速、灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备，其特征在于以磁性多巴胺纳米微球为捕获探针，利用金属离子/石墨烯/金纳米粒子复合物为二抗标记物的夹心型免疫传感器其步骤为：将2.7gFeCl3·6H2O和7.2gNaAc剧烈搅拌下溶解在100mL的乙二醇中，得到均相黄色溶液，然后将该溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中封闭，180℃下加热反应10h，待高压釜冷却至室温后，将黑色磁性颗粒用磁铁分离收集，用去离子水与无水乙醇洗涤，得磁性Fe3O4纳米粒子；将25mg的Fe3O4颗粒加到到25mL0.02mol/L的Tris-HCl（pH8.0）溶液中，超声30min，使Fe3O4颗粒能够充分分散，将50mg的盐酸多巴胺分散到25mL去离子水中，搅拌下将多巴胺溶液快速注入到Fe3O4溶液中，搅拌8h，用去离子水洗涤，得磁性多巴胺纳米微球（Fe3O4PDA）；精确称取4mg的石墨烯，分散在10ml二次水中，超声20min，0.4mLHAuCl4（1.0wt%）和0.4mgNaOH快速加入到上述混合物中，超声2h，8000r/min下离心洗涤10min，获得石墨烯/金（G-Au）复合物，将其重新分散在2ml二次水中；1mL10-4mol/L的巯基乙酸加入到2mL上述溶液中，加入1mL10-3mol/L的CdCl2溶液，超声分散5min，常温下搅拌过夜，用去离子水离心洗涤，重新分散到1mL的PBS（0.01mol/L，pH7）中，得G-Au-Cd2+;将巯基乙酸改为半胱氨酸以同样的方法做G-Au-Pb2+；分别将100μLanti-CEA（100μg/ml，二抗）和100μLanti-AFP（100μg/ml，二抗）加入到G-Au-Cd2+和G-Au-Pb2+中，振荡过夜，获得anti-CEA-G-Au-Cd2+和anti-AFP-G-Au-Pb2+，加入1mL1%的BSA，振荡2h，封闭非特异性结合的位点，用PBS（0.01mol/L，PH7.4）离心洗涤，分散到5mLPBS（0.01mol/L，PH7.4）中；将150μLanti-AFP（10μg/mL，一抗）和150μLanti-CEA（10μg/mL，一抗）加入到Fe3O4PDA中，在4℃下孵化1h，然后用PBS洗涤，除去非特异性结合的一抗；加入0.5mL2%的BSA，在4℃下震荡1h，用PBS洗涤3次，得Fe3O4PDA/Ab1；将Fe3O4PDA/Ab1在100μLAFP（10μg/mL）和CEA（10μg/mL）中37oC下孵化40min，用PBS洗涤3次，得Fe3O4PDA/Ab1/Ag复合物;将Fe3O4PDA/Ab1/Ag加入到0.5mL的anti-CEA-G-Au-Cd2+和anti-AFP-G-Au-Pb2+的混合物中，37oC下孵化30min，得到夹心型免疫复合物，磁性分离，然后用PBS洗涤3次，分散在2mLpH4.5的NaAc-HAC缓冲溶液中。
3.根据权利要求1所述的一种基于金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备，其特征在于以磁性多巴胺纳米微球为捕获探针，利用金属离子/石墨烯/金纳米粒子复合物为二抗标记物的夹心型免疫传感器，其特征在于，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，含有一400μg/LHg2+及夹心型免疫复合物的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.5）中，利用方波溶出伏安法对癌胚抗原和甲胎蛋白进行电化学测量。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的一种金属离子复合物标记同时检测两种肿瘤标志物的磁性电化学免疫传感器的制备，其特征在于，具体步骤为：
（1）在含有400μg/LHg2+及夹心型免疫复合物的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.5）的电解池中以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；实验在CHI625B电化学综合测试仪上进行，其附属的计算机软件供作实验数据的采集和处理；在-1.2V电位进行沉积，沉积时间180s，富集金属离子的同时镀汞，富集结束后静止15s，在-1-0.2V电位之间进行方波溶出伏安扫描，测量峰电流值，测定完成后将电极置于+0.6V电位下清洗;
（2）改变抗原的浓度制备一系列夹心型免疫复合物，进行扫描，记录方波溶出伏安图，测量峰电流值I p，峰电流值I p与抗原浓度的对数呈现良好的线性关系Ip CEA=-2.66lgc-13.68,R2=0.996;Ip AFP=-1.57lgc-8.15，R2=0.992;
（3）结合上述抗原的标准样品的线性关系，对待测样品进行测定：在含有400μg/LHg2+及用待测抗原制备的夹心型免疫复合物的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.5）的电解池中以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；实验在CHI625B电化学综合测试仪上进行，其附属的计算机软件供作实验数据的采集和处理；在-1.2V电位进行沉积，沉积时间180s，富集金属离子的同时镀汞，富集结束后静止15s，在-1-0.2V电位之间进行方波溶出伏安扫描，测量峰电流值I p，测定完成后将电极置于+0.6V电位下清洗；将I p带入上述方程，可求算出待测样品中抗原的浓度；以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，400μg/LHg2+及用待测样品制备的夹心型免疫复合物的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.5）为底液，利用方波溶出伏安法对两种抗原进行电化学测量。
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