CN104122309B - 一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环糊精功能化石墨烯、环糊精-CuAg、金刚烷甲酸功能化抗体的制备方法及其用于构建电化学免疫传感器,用于肿瘤标志物的定性、定量检测,涉及生物技术、材料化学、纳米科学等多个领域。本发明基于利用环糊精功能化纳米材料,增强对抗原、抗体等生物分子的亲和性,提高其固定量和固定效果;利用金刚烷甲酸功能化抗体分子,实现抗体的多功能标记,提高传感器的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备及应用。具体是采用环糊精-Cu@Ag核壳纳米材料,制备多种检测肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器,属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
恶性肿瘤俗称癌症,当身体内细胞发生突变后,它会不断地分裂,不受身体控制,最后形成癌症。恶性肿瘤的细胞能侵犯、破坏邻近的组织和器官。而且,癌细胞可从肿瘤中穿出,进入血液或淋巴系统,从而造成了癌症转移。
肿瘤标志物是反映肿瘤存在的化学类物质,它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质,借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能,以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。肿瘤标志物的快速、灵敏电化学免疫检测为肿瘤早期发现和诊断提供了可能,因此,在临床研究上,发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。
目前检测肿瘤标志物的方法主要有放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析及电化学免疫分析等,但是这些检测方法因为其具有放射性、耗时长、成本高、灵敏度低等缺点,不能得到很好的应用。因此,为了解决上述方法的不足之处,本发明提供了一种简单、快速、灵敏度高和选择性高的电化学免疫分析方法。
本方法采用化学还原的方法,制备了环糊精功能化的Cu@Ag核壳纳米粒子,通过主客体识别作用,实现了金刚烷甲酸功能化抗体的固定,将环糊精功能化的Cu@Ag核壳纳米材料引入传感器的制备中,构建了一种超灵敏的夹心型免疫传感器。在不使用酶的情况下,环糊精功能化的Cu@Ag核壳纳米粒子对双氧水有良好的催化能力,并在检测过程中产生良好的电化学信号,有效地降低了传感器的检出限,可用于多种肿瘤标志物的分析。具有低成本、高灵敏、特异性好、快速检测等优点,且制备过程简单,有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是基于环糊精-Cu@Ag核壳纳米粒子,构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是通过金刚烷甲酸实现对抗体的功能化,实现了抗体的多重标记,达到了超灵敏检测目的。
本发明的技术方案如下:
1. 一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,步骤如下:
将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
取6 µL、0.5~1.5 mg·mL-1 环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;
滴加6 µL、5~10 µg·mL-1金刚烷甲酸功能化的抗体,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
滴加3 µL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
取6 µL、10 µg·mL-1的环糊精-Cu@Ag二抗标记物溶液,滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得环糊精-Cu@Ag构建的免疫传感器。
2. 环糊精功能化的石墨烯溶液,步骤如下:
将20 mL、0.4~0.6 mg·mL-1的氧化石墨烯,60~100 mg 环糊精和250~350 µL氨水混合均匀,加入15~25 µL水合肼,强力搅拌3分钟后,在60 ˚C的水浴中加热3~4 h,反应完成后于13000 r·min-1离心15 min,50 ˚C干燥得到环糊精功能化的石墨烯。将环糊精功能化的石墨烯用超纯水配制成环糊精功能化的石墨烯溶液备用。
3. 金刚烷甲酸功能化的抗体,步骤如下:
称取30~36 mg金刚烷甲酸溶于40 mL超纯水,混合均匀,加入20 µL、0.5~1.5 mol·L-1 NaOH溶液至溶液澄清,将澄清的溶液转移到100.0 mL容量瓶中,用超纯水定容到刻度。取10~40 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC和10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS,加入1~3 mL 金刚烷甲酸溶液和2 mL、50 mmol·L-1、 pH=7.4的PBS缓冲溶液,放在室温下轻搅30 min。加入150~250 µL、1 mg·mL-1的抗体,置于4 ˚C恒温振荡培养箱中反应12小时。以8000 r·min-1的转速离心8 min,并用50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次,将制得金刚烷甲酸功能化的抗体分散到1 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS中,放入-20 ˚C的冰箱中保存。
4. 核壳型环糊精-Cu@Ag溶液,步骤如下:
取0.005~0.015 mol β-环糊精溶于150 mL超纯水, 40 ˚C的油浴中磁力搅拌,完全溶解后加入0.01~0.03 mol 抗坏血酸,用1 mol·L-1的NaOH调节溶液的pH为9~13;另外,将0.005~0.015 mol CuSO4·5H2O加入过量氨水得到铜氨络离子,将0.005~0.015 mol AgNO3加入过量的氨水得到银氨络离子;在70 ˚C,以60 drops·min-1的速度向pH为9~13的溶液中加入铜氨络离子,反应20 min后,以同样的速度滴加银氨络离子,反应25 min后离心分离,超纯水洗涤,最后干燥制得核壳型Cu@Ag;取5~15 mg 制备的Cu@Ag 核壳纳米粒子和60~100 mg巯基化-β-环糊精分散到20 mL的超纯水,搅拌过夜,离心分离,最后干燥制得核壳型环糊精-Cu@Ag;称取1~1.5 mg的环糊精-Cu@Ag分散到500 μL的PBS里配制成环糊精-Cu@Ag溶液。
5.核壳型环糊精-Cu@Ag-二抗标记物(Ab2-Cu@Ag-CD),步骤如下:
将200~500 μL环糊精-Cu@Ag溶液与200~500 μL的200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化抗体溶液混合,置于4 ˚C 恒温培养箱孵化12 h,离心分离,用50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS洗涤1次,将制备的Ab2-Cu@Ag-CD重新分散到1.0 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS中,储存在4 ˚C备用。
6. 电化学免疫传感器用于各种肿瘤标志物的检测,检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、pH 5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对分析物进行检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔 0.1 s,运行时间200 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL的50 mmol·L-1、pH=7.0的PBS中注入10 μL 5 mol/L的双氧水溶液,然后记录电流变化。
(4)根据所得电流强度与肿瘤标志物浓度之间的线性关系,绘制工作曲线。
7. 本发明所述的肿瘤标志物选自以下之一:癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、乳腺癌易感基因(CAl5-3)、卵巢癌糖类抗原(CA125)、糖蛋白抗原(CA50)、CA19-9、CA549、CA72-4、鳞状细胞相关抗原(SCC)、NMP22、CA242、前列腺特异性抗原(PSA)、细胞角蛋白、磷化蛋白(p53)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盘催乳素(HPL)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)。
本发明的有益成果
(1)采用环糊精功能化的Cu@Ag核壳纳米粒子得到环糊精-Cu@Ag复合材料,既保留了Cu@Ag纳米粒子良好的催化性能,又具备了环糊精分子的分子识别作用和亲水性,显著提高了CD-Cu@Ag的稳定性和分散性。
(2)利用环糊精功能化的石墨烯纳米复合材料具有高的导电性、良好的生物相容性,大的比表面积,良好的分散性和高的分子识别能力,可以通过主客体相互作用固载更多金刚烷甲酸功能化的抗体。
(3)利用金刚烷甲酸实现对抗体的功能化,增加了抗体的标记位点,实现了多重标记,使制得的传感器实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。
(4)利用环糊精与金刚烷之间的主客体分子识别作用,实现了抗体的固定,有效地防止检测过程中标记物的脱落。
(5)本发明利用抗原、抗体的免疫反应,提高了检测方法的特异性。
(6)本发明制备的电化学免疫传感器用于多种肿瘤标志物的检测,响应时间短,检测限低,线性范围宽,可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例 1 一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备
将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
取6 µL、0.5 mg·mL-1 环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;
滴加6 µL、5 µg·mL-1金刚烷甲酸功能化的抗体,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
滴加3 µL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
取6 µL、10 µg·mL-1的环糊精-Cu@Ag二抗标记物溶液,滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得环糊精-Cu@Ag构建的免疫传感器。
实施例 2 一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备
将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
取6 µL、1.0 mg·mL-1 环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;
滴加6 µL、7.5 µg·mL-1金刚烷甲酸功能化的抗体,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
滴加3 µL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
取6 µL、10 µg·mL-1的环糊精-Cu@Ag二抗标记物溶液,滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得环糊精-Cu@Ag构建的免疫传感器。
实施例 3 一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备
将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
取6 µL、1.5 mg·mL-1 环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;
滴加6 µL、10 µg·mL-1金刚烷甲酸功能化的抗体,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
滴加3 µL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液,晾干后超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
取6 µL、10 µg·mL-1的环糊精-Cu@Ag二抗标记物溶液,滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得环糊精-Cu@Ag构建的免疫传感器。
实施例 4 环糊精功能化的石墨烯溶液
将20 mL、0.4 mg·mL-1的氧化石墨烯,60 mg 环糊精和250 µL氨水混合均匀,加入15 µL水合肼,强力搅拌3分钟后,在60 ˚C的水浴中加热3 h,反应完成后于13000 r·min-1离心15 min,50 ˚C干燥得到环糊精功能化的石墨烯。将环糊精功能化的石墨烯用超纯水配制成环糊精功能化的石墨烯溶液备用。
实施例 5 环糊精功能化的石墨烯溶液
将20 mL、0.5 mg·mL-1的氧化石墨烯,80 mg 环糊精和300 µL氨水混合均匀,加入20 µL水合肼,强力搅拌3分钟后,在60 ˚C的水浴中加热3.5 h,反应完成后于13000 r·min-1离心15 min,50 ˚C干燥得到环糊精功能化的石墨烯。将环糊精功能化的石墨烯用超纯水配制成环糊精功能化的石墨烯溶液备用。
实施例 6 环糊精功能化的石墨烯溶液
将20 mL、0.6 mg·mL-1的氧化石墨烯,100 mg 环糊精和350 µL氨水混合均匀,加入25 µL水合肼,强力搅拌3分钟后,在60 ˚C的水浴中加热3~4 h,反应完成后于13000 r·min-1离心15 min,50 ˚C干燥得到环糊精功能化的石墨烯。将环糊精功能化的石墨烯用超纯水配制成环糊精功能化的石墨烯溶液备用。
实施例 7 金刚烷甲酸功能化的抗体
称取30 mg金刚烷甲酸溶于40 mL超纯水,混合均匀,加入20 µL、0.5 mol·L-1 NaOH溶液至溶液澄清,将澄清的溶液转移到100.0 mL容量瓶中,用超纯水定容到刻度。取10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC和10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS,加入1 mL 金刚烷甲酸溶液和2 mL、50 mmol·L-1、 pH=7.4的PBS缓冲溶液,放在室温下轻搅30 min。加入150 µL、1 mg·mL-1的抗体,置于4 ˚C恒温振荡培养箱中反应12小时。以8000 r·min-1的转速离心8 min,并用50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次,将制得金刚烷甲酸功能化的抗体分散到1 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS中,放入-20 ˚C的冰箱中保存。
实施例 8 金刚烷甲酸功能化的抗体
称取33 mg金刚烷甲酸溶于40 mL超纯水,混合均匀,加入20 µL、1.0 mol·L-1 NaOH溶液至溶液澄清,将澄清的溶液转移到100.0 mL容量瓶中,用超纯水定容到刻度。取20 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC和10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS,加入2 mL 金刚烷甲酸溶液和2 mL、50 mmol·L-1、 pH=7.4的PBS缓冲溶液,放在室温下轻搅30 min。加入200 µL、1 mg·mL-1的抗体,置于4 ˚C恒温振荡培养箱中反应12小时。以8000 r·min-1的转速离心8 min,并用50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次,将制得金刚烷甲酸功能化的抗体分散到1 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS中,放入-20 ˚C的冰箱中保存。
实施例 9 金刚烷甲酸功能化的抗体
称取36 mg金刚烷甲酸溶于40 mL超纯水,混合均匀,加入20 µL、1.5 mol·L-1 NaOH溶液至溶液澄清,将澄清的溶液转移到100.0 mL容量瓶中,用超纯水定容到刻度。取40 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC和10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS,加入3 mL 金刚烷甲酸溶液和2 mL、50 mmol·L-1、 pH=7.4的PBS缓冲溶液,放在室温下轻搅30 min。加入250 µL、1 mg·mL-1的抗体,置于4 ˚C恒温振荡培养箱中反应12小时。以8000 r·min-1的转速离心8 min,并用50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次,将制得金刚烷甲酸功能化的抗体分散到1 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS中,放入-20 ˚C的冰箱中保存。
实施例 10 核壳型环糊精-Cu@Ag溶液
取0.005 mol β-环糊精溶于150 mL超纯水, 40 ˚C的油浴中磁力搅拌,完全溶解后加入0.01 mol 抗坏血酸,用1 mol·L-1的NaOH调节溶液的pH为9;另外,将0.005 mol CuSO4·5H2O加入过量氨水得到铜氨络离子,将0.005 mol AgNO3加入过量的氨水得到银氨络离子;在70 ˚C,以60 drops·min-1的速度向pH为9的溶液中加入铜氨络离子,反应20 min后,以同样的速度滴加银氨络离子,反应25 min后离心分离,超纯水洗涤,最后干燥制得核壳型Cu@Ag;取5 mg 制备的Cu@Ag 核壳纳米粒子和60 mg巯基化-β-环糊精分散到20 mL的超纯水,搅拌过夜,离心分离,最后干燥制得核壳型环糊精-Cu@Ag;称取1 mg的环糊精-Cu@Ag分散到500 μL的PBS里配制成环糊精-Cu@Ag溶液。
实施例 11 核壳型环糊精-Cu@Ag溶液
取0.010 mol β-环糊精溶于150 mL超纯水, 40 ˚C的油浴中磁力搅拌,完全溶解后加入0.02 mol 抗坏血酸,用1 mol·L-1的NaOH调节溶液的pH为11;另外,将0.010 mol CuSO4·5H2O加入过量氨水得到铜氨络离子,将0.010 mol AgNO3加入过量的氨水得到银氨络离子;在70 ˚C,以60 drops·min-1的速度向pH为11的溶液中加入铜氨络离子,反应20 min后,以同样的速度滴加银氨络离子,反应25 min后离心分离,超纯水洗涤,最后干燥制得核壳型Cu@Ag;取10 mg 制备的Cu@Ag 核壳纳米粒子和80 mg巯基化-β-环糊精分散到20 mL的超纯水,搅拌过夜,离心分离,最后干燥制得核壳型环糊精-Cu@Ag;称取1.25 mg的环糊精-Cu@Ag分散到500 μL的PBS里配制成环糊精-Cu@Ag溶液。
实施例 12 核壳型环糊精-Cu@Ag溶液
取0.015 mol β-环糊精溶于150 mL超纯水, 40 ˚C的油浴中磁力搅拌,完全溶解后加入0.03 mol 抗坏血酸,用1 mol·L-1的NaOH调节溶液的pH为13;另外,将0.015 mol CuSO4·5H2O加入过量氨水得到铜氨络离子,将0.015 mol AgNO3加入过量的氨水得到银氨络离子;在70 ˚C,以60 drops·min-1的速度向pH为13的溶液中加入铜氨络离子,反应20 min后,以同样的速度滴加银氨络离子,反应25 min后离心分离,超纯水洗涤,最后干燥制得核壳型Cu@Ag;取15 mg 制备的Cu@Ag 核壳纳米粒子和100 mg巯基化-β-环糊精分散到20 mL的超纯水,搅拌过夜,离心分离,最后干燥制得核壳型环糊精-Cu@Ag;称取1.5 mg的环糊精-Cu@Ag分散到500 μL的PBS里配制成环糊精-Cu@Ag溶液。
实施例 13 核壳型环糊精-Cu@Ag-二抗标记物(Ab2-Cu@Ag-CD)
将200 μL环糊精-Cu@Ag溶液与200 μL的200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化抗体溶液混合,置于4 ˚C 恒温培养箱孵化12 h,离心分离,用50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS洗涤1次,将制备的Ab2-Cu@Ag-CD重新分散到1.0 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS中,储存在4 ˚C备用。
实施例 14 核壳型环糊精-Cu@Ag-二抗标记物(Ab2-Cu@Ag-CD)
将350 μL环糊精-Cu@Ag溶液与350 μL的200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化抗体溶液混合,置于4 ˚C 恒温培养箱孵化12 h,离心分离,用50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS洗涤1次,将制备的Ab2-Cu@Ag-CD重新分散到1.0 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS中,储存在4 ˚C备用。
实施例 15 核壳型环糊精-Cu@Ag-二抗标记物(Ab2-Cu@Ag-CD)
将500 μL环糊精-Cu@Ag溶液与500 μL的200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化抗体溶液混合,置于4 ˚C 恒温培养箱孵化12 h,离心分离,用50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS洗涤1次,将制备的Ab2-Cu@Ag-CD重新分散到1.0 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS中,储存在4 ˚C备用。
实施例 16 电化学免疫传感器用于癌胚抗原的检测
(1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、pH 5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对分析物进行检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔 0.1 s,运行时间200 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL的50 mmol·L-1、pH=7.0的PBS中注入10 μL 5 mol/L的双氧水溶液,然后记录电流变化。
(4)根据所得电流强度与癌胚抗原浓度之间的线性关系,绘制工作曲线,测得线性范围为0.1 pg/mL ~ 20 ng/mL,检测限为 0.02 pg/mL。
实施例 17 甲胎蛋白的检测
绘制工作曲线步骤同实施例16,按照绘制工作曲线的方法进行甲胎蛋白样品分析,测得线性范围为1.0 pg/mL ~ 15 ng/mL,检测限为 0.33 pg/mL。
实施例 18乳腺癌易感基因的检测
绘制工作曲线步骤同实施例16,按照绘制工作曲线的方法进行乳腺癌易感基因样品分析,测得线性范围为0.5 pg/mL ~ 18 ng/mL,检测限为0.17 pg/mL。
Claims (6)
1.一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,其特征在于,包括以下步骤:
将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
取6 µL,0.5~1.5 mg·mL-1 的环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;
滴加6 µL,5~10 µg·mL-1金刚烷甲酸功能化的抗体,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
滴加3 µL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
滴加6 µL,0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;
取6 µL、10 µg·mL-1的环糊精-Cu@Ag二抗标记物溶液,滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得环糊精-Cu@Ag构建的免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,其特征在于,所述环糊精功能化的石墨烯溶液,制备步骤如下:
将20 mL、0.4~0.6 mg·mL-1的氧化石墨烯,60~100 mg 环糊精和250~350 µL氨水混合均匀,加入15~25 µL水合肼,强力搅拌3分钟后,在60 ˚C的水浴中加热3~4 h,反应完成后于13000 r·min-1离心15 min,50 ˚C干燥得到环糊精功能化的石墨烯。
3.如权利要求1所述的一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,其特征在于,所述金刚烷甲酸功能化的抗体,制备步骤如下:
称取30~36 mg金刚烷甲酸溶于40 mL超纯水,混合均匀,加入20 µL、0.5~1.5 mol·L-1 NaOH溶液至溶液澄清,将澄清的溶液转移到100.0 mL容量瓶中,用超纯水定容到刻度;
取10~40 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10 mg N-羟基丁二酰亚胺,加入1~3 mL 金刚烷甲酸溶液和2 mL、50 mmol·L-1、 pH=7.4的PBS缓冲溶液,放在室温下轻搅30 min;
加入150~250 µL、1 mg·mL-1的抗体,置于4 ˚C恒温振荡培养箱中反应12小时;
以8000 r·min-1的转速离心8 min,并用50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次,将制得金刚烷甲酸功能化的抗体分散到1 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4的PBS中,放入-20 ˚C的冰箱中保存。
4.如权利要求1所述的一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,其特征在于,所述核壳型环糊精-Cu@Ag溶液,制备步骤如下:
取0.005~0.015 mol β-环糊精溶于150 mL超纯水, 40 ˚C的油浴中磁力搅拌,完全溶解后加入0.01~0.03 mol 抗坏血酸,用1 mol·L-1的NaOH调节溶液的pH为9~13;另外,将0.005~0.015 mol CuSO4·5H2O加入过量氨水得到铜氨络离子,将0.005~0.015 mol AgNO3加入过量的氨水得到银氨络离子;在70 ˚C,以60 drops·min-1的速度向pH为9~13的溶液中加入铜氨络离子,反应20 min后,以同样的速度滴加银氨络离子,反应25 min后离心分离,超纯水洗涤,最后干燥制得核壳型Cu@Ag;取5~15 mg 制备的Cu@Ag 核壳纳米粒子和60~100 mg巯基化-β-环糊精分散到20 mL的超纯水,搅拌过夜,离心分离,最后干燥制得核壳型环糊精-Cu@Ag;称取1~1.5 mg的环糊精-Cu@Ag分散到500 μL的PBS里配制成环糊精-Cu@Ag溶液。
5.如权利要求1所述的一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,其特征在于,所述核壳型环糊精-Cu@Ag-二抗标记物(Ab2-Cu@Ag-CD),制备步骤如下:
将200~500 μL环糊精-Cu@Ag溶液与200~500 μL的200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化抗体溶液混合,置于4 ˚C 恒温培养箱孵化12 h,离心分离,用50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS洗涤1次,将制备的Ab2-Cu@Ag-CD重新分散到1.0 mL的50 mmol·L-1、pH=7.4 PBS中,储存在4 ˚C备用。
6.如权利要求1所述的一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备,其特征在于,所述的制备方法制备的传感器用于各种肿瘤标志物的检测,检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、pH 5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对分析物进行检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔 0.1 s,运行时间200 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL的50 mmol·L-1、pH=7.0的PBS中注入10 μL 5 mol/L的双氧水溶液,然后记录电流变化。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101105495A (zh) * | 2007-07-31 | 2008-01-16 | 浙江省肿瘤医院 | 肿瘤标志物质控品的制备方法 |
EP1953541A1 (en) * | 2005-11-16 | 2008-08-06 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Method for determination of amount of double-stranded dna and kit for the determination |
CN102735728A (zh) * | 2012-07-05 | 2012-10-17 | 济南大学 | 一种电化学免疫传感器、其制备方法及其用途 |
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---|---|---|---|---|
EP1953541A1 (en) * | 2005-11-16 | 2008-08-06 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Method for determination of amount of double-stranded dna and kit for the determination |
CN101105495A (zh) * | 2007-07-31 | 2008-01-16 | 浙江省肿瘤医院 | 肿瘤标志物质控品的制备方法 |
CN102735728A (zh) * | 2012-07-05 | 2012-10-17 | 济南大学 | 一种电化学免疫传感器、其制备方法及其用途 |
CN103235019A (zh) * | 2013-04-15 | 2013-08-07 | 湖北大学 | 一种环糊精/石墨烯纳米复合物修饰电极及其制备方法和用途 |
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