CN104459132A - 一种基于金电沉积和Au@Ag/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于金电沉积和Au@Ag/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用AuAg/CuO-GS作为检测抗体标记物，制备一种检测胰腺癌肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，利用AuAg/CuO-GS其优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有更高的灵敏度和更宽的检测范围，检测限可达1.5fg/mL。

Description

一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用AuAg/CuO-GS作为检测抗体标记物，制备一种检测胰腺癌肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。
目前已有的癌症标志物的临床检测方法很多,如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法等。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。
电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，因此本发明制备了一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器，实现了对肿瘤标志物的检测。
申请号为201310249684的专利发明了一种用于无标记癌胚抗原检测的电化学免疫传感器的制备方法，在电化学传感器中，夹心型的电化学免疫传感器应用更为广泛，本发明制备了一种AuAg/CuO-GS作为标记物的胰腺癌夹心型免疫传感器。纳米材料凭借其特殊的物理和化学性质得到了广泛应用，纳米材料能够提供大的比表面积，提高传感器的实用性和稳定性，申请号为201410012160的专利中介绍了一种用纳米氧化铜催化过氧化氢氧化对苯二甲酸增强荧光的方法，纳米氧化铜的信号增强效果明显。石墨烯纳米层（GS）具有大的比表面积，催化性能好，生物相容性好，能有效地吸附固载抗原，增强电子传递等优点，申请号为201310600457的专利依据这些优点发明了一种黑色素纳米微球－石墨烯电化学传感器，效果较好，因此本发明将哌嗪修饰的氨基化石墨烯引入到电化学免疫传感器的制备中。核壳结构具有良好的光学和催化性能，金银核壳亦被用于传感器的制备。在此电化学免疫传感器中，将纳米CuO、石墨烯、金银核壳掺杂在一起，制得AuAg/CuO-GS，作为检测抗体标记物。纳米金即具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性，本研究中将纳米金作为捕获抗体标记物。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是基于AuAg/CuO-GS作为检测抗体标记物，构建了一种快速超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于多种肿瘤标志物的检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）以质量浓度为0.8~1.5%的HAuCl4溶液为底液，在-0.2 V电压下扫描30 s，将金电沉积到电极表面，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将4~6 μL、8 ~ 12 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 μL、质量分数为0.5 ~ 2.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加4~6 μL、0.01 pg/mL~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）将4~6 μL、1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器。
2. 检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
（1）花状纳米CuO-GS的制备
将10.0 mL、8~10.0 mol/L的NaOH，以每分钟0.5 mL的速度加入1.0 mL、0.4~0.6 mol/L的硝酸铜溶液中，加入0.05~0.07 g的氧化石墨烯，放入反应釜中，100 ℃下反应24 h，反应完全后进行离心分离，得到黑色固体沉淀物，将其放入鼓风干燥箱中干燥8~12 h，制得花状纳米CuO-GS；
（2）氨基化的花状纳米CuO-GS的制备
称取0.08~0.12 g的花状纳米CuO-GS，依次加入8~12 mL无水乙醇，0.08~0.12 mL 的3-氨丙基三乙氧基硅烷于三口烧瓶中，60~80 ℃下油浴回流加热、搅拌1.0~2.0 h；取出，放在离心管中进行离心，用无水乙醇清洗，离心去除上清液，干燥后，制得黑色固体氨基化的花状纳米CuO-GS；
（3）AuAg溶液的制备
称量99 mL 超纯水，加入1 mL 、质量分数为0.8~1.2％的HAuCl4水溶液，油浴回流加热，沸腾后加入2.5 mL、质量分数为0.8~1.2％的柠檬酸钠水溶液，继续沸腾13 ~18 min，取出后冷却到室温，制得纳米金溶液，遮光保存；
配制100 mL，50 mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵CTAB水溶液，加入5 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸VC，2.5 mL，8~12 mmol/L的硝酸银溶液，5 mL 纳米金溶液，滴加1 mol/L的NaOH溶液至颜色由红色变为金黄色，制得金黄色的AuAg溶液；
（4）检测抗体标记物AuAg/CuO-GS的制备
取20 mLAuAg溶液，以10000 ~12000 rpm的转速进行离心15~20min，去除上清液，加入20 mL水，超声使其均匀，加入1 mL、8~12 mg/mL氨基化的花状纳米CuO-GS的水溶液，震荡24 h后，以8000 rpm的转速离心5 min，用水清洗沉淀两次，放入鼓风干燥箱中进行干燥8~12 h，制得黑色固体检测抗体标记物AuAg/CuO-GS； 
（5）检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
取2 mL、2 mg/mL的检测抗体标记物AuAg/CuO-GS水溶液，加入2 mL、10 μg/mL抗体溶液，4 ℃震荡12h，去除上清液，加入2 mL、pH 7.4的PBS，制得检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液 ，4 ℃条件下备用。
3. 胰腺癌肿瘤标志物的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、40~60 mmol/L的pH 5.6 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对胰腺癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5~10 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述胰腺癌肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原CEA、糖类抗原19-9、糖类抗原242、铁蛋白Ferritin。
本发明的有益成果
（1）本发明的发明人首次将AuAg/CuO-GS纳米粒子作为检测抗体标记物引入到胰腺癌肿瘤标志物的电化学免疫传感器的制备当中，利用AuAg/CuO-GS其优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。
（2）利用具有良好催化效果的金银双金属和氧化铜，实现信号的双重放大；同时引入石墨烯，提高比表面积和电子转移速率，进一步提高了传感器的灵敏度，实现了电化学信号的多重放大。
（3）使用完全相同的纳米材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变胰腺癌肿瘤标志物种类即可实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测，此方法操作简单，检测速度快，可在短时间内实现大量样品的测定，有利于肿瘤标志物传感器的商品化。
（4）将AuAg/CuO-GS纳米粒子与胰腺癌肿瘤标志物检测抗体直接孵化，在检测抗体的标记物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了检测抗体标记物的制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
具体实施方式
实施例1一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用
1. 一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）以质量浓度为0.8%的HAuCl4溶液为底液，在-0.2 V电压下扫描30 s，将金电沉积到电极表面，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将4 μL、8 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 μL、质量分数为0.5 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加4 μL、0.01 pg/mL~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）将4 μL、1 mg/mL的检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器。
实施例2一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用
（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）以质量浓度为1.2%的HAuCl4溶液为底液，在-0.2 V电压下扫描30 s，将金电沉积到电极表面，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将5 μL、10 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 μL、质量分数为1.2 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加4~6 μL、0.01 pg/mL~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）将5 μL、2 mg/mL的检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器。
实施例3一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法及应用
（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）以质量浓度为1.5%的HAuCl4溶液为底液，在-0.2 V电压下扫描30 s，将金电沉积到电极表面，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将6 μL、12 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 μL、质量分数为2.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6 μL、0.01 pg/mL~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）将6 μL、3 mg/mL的检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器。
实施例4 检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
（1）花状纳米CuO-GS的制备
将10.0 mL、8 mol/L的NaOH，以每分钟0.5 mL的速度加入1.0 mL、0.4 mol/L的硝酸铜溶液中，加入0.05 g的氧化石墨烯，放入反应釜中，100 ℃下反应24 h，反应完全后进行离心分离，得到黑色固体沉淀物，将其放入鼓风干燥箱中干燥8 h，制得花状纳米CuO-GS；
（2）氨基化的花状纳米CuO-GS的制备
称取0.08 g的花状纳米CuO-GS，依次加入8 mL无水乙醇，0.08 mL 的3-氨丙基三乙氧基硅烷于三口烧瓶中，60 ℃下油浴回流加热、搅拌1.0 h；取出，放在离心管中进行离心，用无水乙醇清洗，离心去除上清液，干燥后，制得黑色固体氨基化的花状纳米CuO-GS；
（3）AuAg溶液的制备
称量99 mL 超纯水，加入1 mL 、质量分数为0.8％的HAuCl4水溶液，油浴回流加热，沸腾后加入2.5 mL、质量分数为0.8％的柠檬酸钠水溶液，继续沸腾13 min，取出后冷却到室温，制得纳米金溶液，遮光保存；
配制100 mL，50 mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵CTAB水溶液，加入5 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸VC，2.5 mL，8 mmol/L的硝酸银溶液，5 mL 纳米金溶液，滴加1 mol/L的NaOH溶液至颜色由红色变为金黄色，制得金黄色的AuAg溶液；
（4）检测抗体标记物AuAg/CuO-GS的制备
取20 mLAuAg溶液，以10000的转速进行离心15 min，去除上清液，加入20 mL水，超声使其均匀，加入1 mL、8 mg/mL氨基化的花状纳米CuO-GS的水溶液，震荡24 h后，以8000 rpm的转速离心5 min，用水清洗沉淀两次，放入鼓风干燥箱中进行干燥8 h，制得黑色固体检测抗体标记物AuAg/CuO-GS； 
（5）检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
取2 mL、2 mg/mL的检测抗体标记物AuAg/CuO-GS水溶液，加入2 mL、10 μg/mL抗体溶液，4 ℃震荡12h，去除上清液，加入2 mL、pH 7.4的PBS，制得检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液 ，4 ℃条件下备用。
实施例5 检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
（1）花状纳米CuO-GS的制备
将10.0 mL、9 mol/L的NaOH，以每分钟0.5 mL的速度加入1.0 mL、0.5 mol/L的硝酸铜溶液中，加入0.06 g的氧化石墨烯，放入反应釜中，100 ℃下反应24 h，反应完全后进行离心分离，得到黑色固体沉淀物，将其放入鼓风干燥箱中干燥10 h，制得花状纳米CuO-GS；
（2）氨基化的花状纳米CuO-GS的制备
称取0.10 g的花状纳米CuO-GS，依次加入10 mL无水乙醇，0.10 mL 的3-氨丙基三乙氧基硅烷于三口烧瓶中，70 ℃下油浴回流加热、搅拌1.5 h；取出，放在离心管中进行离心，用无水乙醇清洗，离心去除上清液，干燥后，制得黑色固体氨基化的花状纳米CuO-GS；
（3）AuAg溶液的制备
称量99 mL 超纯水，加入1 mL 、质量分数为1.0％的HAuCl4水溶液，油浴回流加热，沸腾后加入2.5 mL、质量分数为1.0％的柠檬酸钠水溶液，继续沸腾15 min，取出后冷却到室温，制得纳米金溶液，遮光保存；
配制100 mL，50 mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵CTAB水溶液，加入5 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸VC，2.5 mL，10 mmol/L的硝酸银溶液，5 mL 纳米金溶液，滴加1 mol/L的NaOH溶液至颜色由红色变为金黄色，制得金黄色的AuAg溶液；
（4）检测抗体标记物AuAg/CuO-GS的制备
取20 mLAuAg溶液，以110000 rpm的转速进行离心17 min，去除上清液，加入20 mL水，超声使其均匀，加入1 mL、10 mg/mL氨基化的花状纳米CuO-GS的水溶液，震荡24 h后，以8000 rpm的转速离心5 min，用水清洗沉淀两次，放入鼓风干燥箱中进行干燥8~12 h，制得黑色固体检测抗体标记物AuAg/CuO-GS； 
（5）检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
取2 mL、2 mg/mL的检测抗体标记物AuAg/CuO-GS水溶液，加入2 mL、10 μg/mL抗体溶液，4 ℃震荡12h，去除上清液，加入2 mL、pH 7.4的PBS，制得检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液 ，4 ℃条件下备用。
实施例6 检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
（1）花状纳米CuO-GS的制备
将10.0 mL、10.0 mol/L的NaOH，以每分钟0.5 mL的速度加入1.0 mL、0.6 mol/L的硝酸铜溶液中，加入0.07 g的氧化石墨烯，放入反应釜中，100 ℃下反应24 h，反应完全后进行离心分离，得到黑色固体沉淀物，将其放入鼓风干燥箱中干燥12 h，制得花状纳米CuO-GS；
（2）氨基化的花状纳米CuO-GS的制备
称取0.12 g的花状纳米CuO-GS，依次加入12 mL无水乙醇， 0.12 mL 的3-氨丙基三乙氧基硅烷于三口烧瓶中，80 ℃下油浴回流加热、搅拌2.0 h；取出，放在离心管中进行离心，用无水乙醇清洗，离心去除上清液，干燥后，制得黑色固体氨基化的花状纳米CuO-GS；
（3）AuAg溶液的制备
称量99 mL 超纯水，加入1 mL 、质量分数为1.2％的HAuCl4水溶液，油浴回流加热，沸腾后加入2.5 mL、质量分数为1.2％的柠檬酸钠水溶液，继续沸腾18 min，取出后冷却到室温，制得纳米金溶液，遮光保存；
配制100 mL，50 mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵CTAB水溶液，加入5 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸VC，2.5 mL，12 mmol/L的硝酸银溶液，5 mL 纳米金溶液，滴加1 mol/L的NaOH溶液至颜色由红色变为金黄色，制得金黄色的AuAg溶液；
（4）检测抗体标记物AuAg/CuO-GS的制备
取20 mLAuAg溶液，以12000 rpm的转速进行离心20min，去除上清液，加入20 mL水，超声使其均匀，加入1 mL、12 mg/mL氨基化的花状纳米CuO-GS的水溶液，震荡24 h后，以8000 rpm的转速离心5 min，用水清洗沉淀两次，放入鼓风干燥箱中进行干燥12 h，制得黑色固体检测抗体标记物AuAg/CuO-GS； 
（5）检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
取2 mL、2 mg/mL的检测抗体标记物AuAg/CuO-GS水溶液，加入2 mL、10 μg/mL抗体溶液，4 ℃震荡12h，去除上清液，加入2 mL、pH 7.4的PBS，制得检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液 ，4 ℃条件下备用。
实施例7 电化学免疫传感器用于癌胚抗原CEA的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、40~60 mmol/L的pH 5.6 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对胰腺癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5~10 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
（4）根据所得电流强度与癌胚抗原CEA浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为10 fg/mL ~ 100 ng/mL，检测限为3.35 fg/mL。
实施例8糖类抗原19-9的检测
绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行糖类抗原19-9样品分析，测得线性范围为10fg/mL ~ 100 ng/mL，检测限为 2.80 fg/mL。
实施例9 糖类抗原242的检测
绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行糖类抗原242分析，测得线性范围为6.0 fg/mL ~ 90 ng/mL，检测限为1.5 fg/mL。
实施例10铁蛋白Ferritin的检测
绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行铁蛋白Ferritin
分析，测得线性范围为6 .6 fg/mL ~ 90 ng/mL，检测限为1.8 fg/mL。

Claims (4)

1.一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）以质量浓度为0.8~1.5%的HAuCl4溶液为底液，在-0.2 V电压下扫描30 s，将金电沉积到电极表面，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将4~6 μL、8 ~ 12 μg/mL的胰腺癌标志物捕获抗体Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 μL、质量分数为0.5 ~ 2.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加4~6 μL、0.01 pg/mL~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）将4~6 μL、1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液，其特征在于，制备步骤如下：
（1）花状纳米CuO-GS的制备
将10.0 mL、8~10.0 mol/L的NaOH，以每分钟0.5 mL的速度加入1.0 mL、0.4~0.6 mol/L的硝酸铜溶液中，加入0.05~0.07 g的氧化石墨烯，放入反应釜中，100 ℃下反应24 h，反应完全后进行离心分离，得到黑色固体沉淀物，将其放入鼓风干燥箱中干燥8~12 h，制得花状纳米CuO-GS；
（2）氨基化的花状纳米CuO-GS的制备
称取0.08~0.12 g的花状纳米CuO-GS，依次加入8~12 mL无水乙醇，0.08~0.12 mL 的3-氨丙基三乙氧基硅烷于三口烧瓶中，60~80 ℃下油浴回流加热、搅拌1.0~2.0 h；取出，放在离心管中进行离心，用无水乙醇清洗，离心去除上清液，干燥后，制得黑色固体氨基化的花状纳米CuO-GS；
（3）AuAg溶液的制备
称量99 mL 超纯水，加入1 mL 、质量分数为0.8~1.2％的HAuCl4水溶液，油浴回流加热，沸腾后加入2.5 mL、质量分数为0.8~1.2％的柠檬酸钠水溶液，继续沸腾13 ~18 min，取出后冷却到室温，制得纳米金溶液，遮光保存；
配制100 mL，50 mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵CTAB水溶液，加入5 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸VC，2.5 mL，8~12 mmol/L的硝酸银溶液，5 mL 纳米金溶液，滴加1 mol/L的NaOH溶液至颜色由红色变为金黄色，制得金黄色的AuAg溶液；
（4）检测抗体标记物AuAg/CuO-GS的制备
取20 mLAuAg溶液，以10000 ~12000 rpm的转速进行离心15~20min，去除上清液，加入20 mL水，超声使其均匀，加入1 mL、8~12 mg/mL氨基化的花状纳米CuO-GS的水溶液，震荡24 h后，以8000 rpm的转速离心5 min，用水清洗沉淀两次，放入鼓风干燥箱中进行干燥8~12 h，制得黑色固体检测抗体标记物AuAg/CuO-GS； 
（5）检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液的制备
取2 mL、2 mg/mL的检测抗体标记物AuAg/CuO-GS水溶液，加入2 mL、10 μg/mL抗体溶液，4 ℃震荡12h，去除上清液，加入2 mL、pH 7.4的PBS，制得检测抗体孵化物AuAg/CuO-GS/Ab2溶液 ，4 ℃条件下备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器，用于胰腺癌肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、40~60 mmol/L的pH 5.6 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对胰腺癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5~10 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
4.如权利要求1~3所述的一种基于金电沉积和AuAg/CuO-GS为标记物的胰腺癌免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述胰腺癌肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原CEA、糖类抗原19-9、糖类抗原242、铁蛋白Ferritin。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105044341A (zh) * 2015-07-03 2015-11-11 济南大学 一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物ca724生物传感器的制备方法及应用
CN105158469A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 山东理工大学 一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法及应用
CN105241943A (zh) * 2015-09-25 2016-01-13 济南大学 检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用
CN105954339A (zh) * 2016-04-25 2016-09-21 山东理工大学 一种基于CeO2@Cu2O/Au@Pt的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
CN106680502A (zh) * 2016-06-17 2017-05-17 山东理工大学 一种基于银壳包覆的l‑半胱氨酸捕获金核标记的psa传感器的制备方法及应用
CN107367540A (zh) * 2017-09-05 2017-11-21 重庆大学 一种适配体电化学传感器及用于检测毒死蜱的方法
CN107525835A (zh) * 2017-08-09 2017-12-29 山东理工大学 一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用
CN110618183A (zh) * 2019-09-09 2019-12-27 广西华银医学检验所有限公司 一种肿瘤标志物快速检测的方法
CN112147194A (zh) * 2020-08-24 2020-12-29 济南大学 一种电沉积金和铂-氧硫化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法
CN114894867A (zh) * 2022-03-25 2022-08-12 江南大学 一种基于Au-Ag@二氧化锰纳米材料的双氧水电化学检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102707049A (zh) * 2012-05-14 2012-10-03 宁波大学 一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用
CN102814178A (zh) * 2012-08-23 2012-12-12 南京理工大学 一种钯-过渡金属氧化物-石墨烯三元复合催化剂及其制备方法
CN104155447A (zh) * 2014-07-21 2014-11-19 济南大学 一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102707049A (zh) * 2012-05-14 2012-10-03 宁波大学 一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用
CN102814178A (zh) * 2012-08-23 2012-12-12 南京理工大学 一种钯-过渡金属氧化物-石墨烯三元复合催化剂及其制备方法
CN104155447A (zh) * 2014-07-21 2014-11-19 济南大学 一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEERTHY DHARA等: "Pt-CuO nanoparticles decorated reduced graphene oxide for the fabrication of highly sensitive non-enzymatic disposable glucose sensor", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 *
XIAOLIN WAND等: "Non-enzymatic glucose biosensor based on copper oxide-reducedgraphene oxide nanocomposites synthesized from water-isopropanolsolution", 《ELECTROCHIMICA ACTA》 *
YU-WEI HSU等: "Synthesis of CuO/graphene nanocomposites for nonenzymatic electrochemical glucose biosensor applications", 《ELECTROCHIMICA ACTA》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105044341A (zh) * 2015-07-03 2015-11-11 济南大学 一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物ca724生物传感器的制备方法及应用
CN105158469A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 山东理工大学 一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法及应用
CN105241943A (zh) * 2015-09-25 2016-01-13 济南大学 检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用
CN105241943B (zh) * 2015-09-25 2017-12-12 济南大学 检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用
CN105954339A (zh) * 2016-04-25 2016-09-21 山东理工大学 一种基于CeO2@Cu2O/Au@Pt的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
CN105954339B (zh) * 2016-04-25 2018-02-23 山东理工大学 一种基于CeO2@Cu2O/Au@Pt的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
CN106680502A (zh) * 2016-06-17 2017-05-17 山东理工大学 一种基于银壳包覆的l‑半胱氨酸捕获金核标记的psa传感器的制备方法及应用
CN107525835A (zh) * 2017-08-09 2017-12-29 山东理工大学 一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用
CN107367540A (zh) * 2017-09-05 2017-11-21 重庆大学 一种适配体电化学传感器及用于检测毒死蜱的方法
CN110618183A (zh) * 2019-09-09 2019-12-27 广西华银医学检验所有限公司 一种肿瘤标志物快速检测的方法
CN112147194A (zh) * 2020-08-24 2020-12-29 济南大学 一种电沉积金和铂-氧硫化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法
CN114894867A (zh) * 2022-03-25 2022-08-12 江南大学 一种基于Au-Ag@二氧化锰纳米材料的双氧水电化学检测方法

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