CN104155447A - 一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及在肺癌肿瘤标志物的检测中的应用，属于新型纳米功能材料和生物传感器领域。本发明利用贵金属纳米材料金银核壳纳米棒作为生物模拟酶，与二抗孵化后作为标记物，同时利用的金纳米棒和还原石墨烯两种纳米材料作为电极修饰物，从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肺癌肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器。

Description

一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用
技术领域
本发明涉及一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用。具体是采用新型纳米功能材料作为模拟酶标记二抗，实现对肺癌肿瘤标志物的快速、灵敏检测，属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。
背景技术
肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率增长最快。据报道，近五十年来肺癌的发病率明显增高，在男性恶性肿瘤患者中，肺癌发病率和死亡率均占第一位，在女性恶性肿瘤患者中，发病率和死亡率均占第二位。因此，肺癌的早期诊断、早期治疗是提高肺癌患者生存率的关键。肺癌肿瘤标志物的检测可反映肺癌的生物学特性，对治疗、辅助诊断、判断预后均有重要意义。目前已有的肺癌肿瘤标志物的临床检测方法很多，如酶免疫法、放射免疫法等，但这些检测方法存在诸多不足，如酶免疫法中酶容易失活、放射免疫法中放射性污染严重等。因此，发明一种灵敏度高、特异性强、工作条件要求不高的环境友好型肺癌肿瘤标志物传感器迫在眉睫。
免疫传感器是源于抗原抗体特异性结合的鉴别功能而研制成的一类生物传感器，并且电化学免疫传感器是免疫传感器中种类最多的、而且是研究最早的，同时也是比较成熟的一个分支。由于它拥有灵敏度高、分析速度快、体积小、选择性好、适合联机化等优点，所以在环境保护、临床诊断、药物分析和食品安全检测中有着很好的应用前景。贵金属核壳纳米材料具有单一材料不具备的优良性能，受到人们的广泛关注。将贵金属核壳纳米材料用于电化学传感器的构建，可以大大提高免疫传感器的灵敏度和重现性等。
本发明创造性的使用金银核壳纳米棒纳米材料作为模拟酶，与二抗孵化后作为标记物，制备了用于肺癌肿瘤标志物检测的夹心型电化学免疫传感器。
发明内容
本发明的目的之一在于避免现有检测方法中存在的仪器设备复杂、操作过程繁琐及对检验人员的技能要求高等缺点，提供一种夹心型电化学免疫传感器的制备方法，所制备的传感器具有灵敏度高、特异性强的特点，且制备简单、操作方便，可用于肺癌肿瘤标志物的快速、灵敏检测；
本发明的目的之二在于将所制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，使用新型功能材料作为模拟酶，替代了生物酶，避免了实际样品检测时生物酶失活及检测环境的影响。
本发明采用的技术方案如下：
1. 本发明所述的一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰还原石墨烯（rGO）、金纳米棒溶胶（Au NRs）、壳聚糖溶液（Chs）、肺癌肿瘤标志物一抗（Ab1）、牛血清蛋白（BSA）、肺癌肿瘤标志物抗原和金银核壳纳米棒溶胶孵化的肺癌肿瘤标志物二抗（AuAgNRs-Ab2），所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极，所述Au NRs为20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液；
其特征在于，所述制备方法包括以下制备步骤：
（1）AuAgNRs-Ab2的制备
将20mLAu NRs和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO3）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入肺癌肿瘤标志物二抗（Ab2），在4℃下震荡24h，得到AuAgNRs-Ab2。
（2）夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极的制备方法
1）对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
2）在1）中得到的电极表面滴加5~10 μL 1~5 mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加5~10 μL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加3~6 μL 质量分数为0.5% 的壳聚糖溶液（CHs）；
5）在4）中得到的电极表面滴加5~8 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加3~6 μL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加4~6 μL 预先孵化好的AuAgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
所述的Chs是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
2. 本发明所述的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
1）将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和20uL 3~6 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
3. 本发明所述的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法和应用，其特征在于所述肺癌肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA-125）、糖类抗原（CA-242）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、组织多肽抗原（TPA）、鳞状细胞癌抗原（SCC）。
本发明的有益成果
（1）本发明所述的肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备简单，操作方便，对检测环境要求不高，实现了对样品的快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前景。
（2）本发明首次采用AuAgNRs应用于夹心型电化学免疫传感器的制备，利用其作为生物模拟酶对H2O2的催化作用，从而产生电信号，以及利用rGO和Au NRs共同修饰电极，增大电极比表面积和增大抗体吸附量的作用，显著提高了电化学免疫传感器的灵敏度和选择性，具有重要的科学意义和应用价值。
具体实施方式
实施例1  金银核壳纳米棒溶胶孵化的肺癌肿瘤标志物二抗（AuAgNRs-Ab2）的制备。
将20mL金纳米棒溶胶（AuNRs）和20mL 0.05 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30℃下搅拌，并顺序加入3 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO3）溶液和 3 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入肺癌肿瘤标志物二抗（Ab2），在4℃下震荡24h，得到AuAgNRs-Ab2。
所述的AuNRs是20nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。
实施例2  AuAgNRs-Ab2的制备。
将20mL AuNRs和20mL 0.1 mol/L的CTAB溶液混合，在35℃下搅拌，并顺序加入4 mL 0.1 mol/L的 AA溶液、0.8 mL 0.05 mol/L的AgNO3溶液和 4 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，停止搅拌，静置2h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入Ab2，在4℃下震荡24h，得到AuAgNRs-Ab2。
所述的AuNRs是30nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。
实施例3  AuAgNRs-Ab2的制备。
将20mL AuNRs和20mL 0.2 mol/L的CTAB溶液混合，在45℃下搅拌，并顺序加入6 mL 0.1 mol/L的AA溶液、1 mL 0.05 mol/L的AgNO3溶液和 6 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，停止搅拌，静置3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入Ab2，在4℃下震荡24h，得到AuAgNRs-Ab2。
所述的AuNRs是40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。
实施例4  夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极的制备方法。
1）对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
2）在1）中得到的电极表面滴加5 μL 1mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加5 μL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加3 μL 质量分数为0.5% 的壳聚糖溶液（CHs）；
5）在4）中得到的电极表面滴加5 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加3 μL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加4 μL 预先孵化好的AuAgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
所述的Chs是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
所述的AuAgNRs-Ab2由实施例1制备得到。
实施例5  夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极的制备方法。
1）同实施例4；
2）在1）中得到的电极表面滴加8 μL 3 mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加810 μL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加4 μL 质量分数为0.5% 的CHs；
5）在4）中得到的电极表面滴加6 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加4 μL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加5 μL 预先孵化好的AuAgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
所述的Chs是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
所述的AuAgNRs-Ab2由实施例2制备得到。
实施例6  夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极的制备方法。
1）同实施例4；
2）在1）中得到的电极表面滴加10 μL 5 mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加10 μL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加6 μL 质量分数为0.5% 的CHs；
5）在4）中得到的电极表面滴加8 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加6 μL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加6 μL 预先孵化好的AuAgNRs-Ab2溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
所述的Chs是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
所述的AuAgNRs-Ab2由实施例3制备得到。
实施例7  实施例1~6制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
1）将已知浓度的肺癌肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40 μL、pH=7.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10mL pH=7.0的PBS缓冲溶液和20uL 3 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例8  实施例1~6制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
1）将已知浓度的肺癌肿瘤标志物抗原标准溶液加入到50 μL、pH=7.4的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取8 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.4的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入18mL pH=7.4的PBS缓冲溶液和20uL 5 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例9  实施例1~6制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
1）将已知浓度的肺癌肿瘤标志物抗原标准溶液加入到60 μL、pH=8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入25mL pH=8.0的PBS缓冲溶液和20uL 6 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例10  肺癌肿瘤标志物的检测：CEA、CA-242或SCC。
一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备及应用，包括以下步骤：
1）选择三种肺癌肿瘤标志物，按照实施例1~6所述的步骤构建夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器；
2）按照实施例7~9所述的步骤进行检测，肺癌肿瘤标志物的检测技术指标见表1。
表1 肺癌肿瘤标志物的检测技术指标
实施例11  肺癌肿瘤标志物的检测：CA-125、NSE或TPA。
1）选择三种肺癌肿瘤标志物，按照实施例1~6所述的步骤构建夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器；
2）按照实施例7~9所述的步骤进行检测，肺癌肿瘤标志物的检测技术指标见表2。
表2 肺癌肿瘤标志物的检测技术指标
实施例12  人血清中肺癌肿瘤标志物的检测。
准确移取人血清样品，加入一定质量浓度的肺癌肿瘤标志物抗原标准溶液，以未加入肺癌肿瘤标志物抗原的人血清为空白，进行加标回收实验，按照实施例7~9的步骤进行检测，测定样品中肺癌肿瘤标志物的回收率，检测结果见表3。
表3 人血清中肺癌肿瘤标志物的检测结果
表3检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.0 %，平均回收率为96.0 ~ 102%，表明本发明可用于人血清中肺癌肿瘤标志物的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。

Claims (3)

1.一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰还原石墨烯（rGO）、金纳米棒溶胶（Au NRs）、壳聚糖溶液（Chs）、肺癌肿瘤标志物一抗（Ab1）、牛血清蛋白（BSA）、肺癌肿瘤标志物抗原和金银核壳纳米棒溶胶孵化的肺癌肿瘤标志物二抗（AuAgNRs-Ab2），所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极，所述Au NRs为20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液；
其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
a、制备AuAgNRs-Ab2；
b、制备夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极；
其中，步骤a制备AuAgNRs-Ab2的具体步骤如下：
将20mLAu NRs和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO3）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入肺癌肿瘤标志物二抗（Ab2），在4℃下震荡24h，得到AuAgNRs-Ab2；
步骤b制备夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极的具体步骤如下：
1）对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
2）在1）中得到的电极表面滴加5~10 μL 1~5 mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加5~10 μL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加3~6 μL 质量分数为0.5% 的壳聚糖溶液（CHs）；
5）在4）中得到的电极表面滴加5~8 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加3~6 μL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加4~6 μL 预先孵化好的AuAgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极；
所述的Chs是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
2.如权利要求1所述的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
1）将已知浓度的肺癌肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和20uL 3~6 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
3.如权利要求1和2所述的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法和应用，其特征在于所述肺癌肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA-125）、糖类抗原（CA-242）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、组织多肽抗原（TPA）、鳞状细胞癌抗原（SCC）。
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